Abstract
Alopecia הוא צורה נפוצה של נשירת שיער אשר יכול להתרחש בתנאים רבים ושונים, לרבות אובדן זכר-דפוס שיער, תסמונת שחלות פוליציסטיות, וalopecia areata. Alopecia יכול להתרחש גם כתופעת לוואי של כימותרפיה בחולי סרטן. במחקר זה, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך באופן מדויק ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לאלה צורות שונות של התקרחות. השיטה משתמשת תרמי ג'ל סטנדרטי להשיג ותהליך תמונות של עכברים, מדידת קליטת האור, אשר מתרחשת בחלק מחוספס לכמות שיער שחור (או אפור) על העכבר. נתונים שכבר לכמת באופן זה אז יכול להיות מנותח באמצעות טכניקות סטטיסטיות סטנדרטיים (כלומר, ANOVA, T-test). מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, areata התקרחות ונשירת שיער מהשעווה. בדוח זה, הפרוטוקול מפורט הוא פרהented לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. טכניקה חדשה זו מציעה מספר היתרונות, ביניהם פשטות היחסית של יישום, הסתמכות על ציוד שהוא זמין ברוב מעבדות מחקר, ומיישום מטרה, הערכה כמותית שהוא יותר חזק מאשר הערכות סובייקטיביות. השיפורים בכימות של צמיחת שיער בעכברים ישפרו מחקר של מודלים התקרחות ולהקל על הערכה של טיפולים חדשים ומבטיחים בניסויים פרה-קליניים.
Introduction
Alopecia (נשירת שיער) יכול להיות אירוע נפשי ורגשי מצער עם גורמים רבים. התקרחות גברית-תבנית היא הגורם השכיח ביותר של התקרחות, המשפיע על כשני שלישים מהגברים בגיל 35 1. דפוס דומה של אובדן שיער יכול להיות שנצפה בנשים עם תסמונת שחלות פוליציסטיות. בשתי הפרעות אלו, נשירת השיער היא אנדרוגן בתיווך. Alopecia יכול להתרחש גם כמחלה אוטואימונית, alopecia areata, אשר משפיעה על 1.7% מכלל האוכלוסייה 2. Alopecia יכול להתרחש כתופעת לוואי של כמה טיפולים רפואיים, כגון כימותרפיה 3. אחוז גבוה (65-85%) של חולי כימותרפיה חוויה מסוים של התקרחות 4,5. ההשלכות הפסיכולוגיות של אובדן שיער נחקרו היטב בהגדרת כימותרפיה. התקרחות בעקבות כימותרפיה יכולה לגרום לחרדה, דיכאון, דימוי גוף שלילי, הערכה עצמית נמוכה ותחושה של רווחה 6,7 מופחתת. Pe גבוהrcentage (47-58%) של חולי סרטן נשיים לשקול נשירת שיער להיות ההיבט הטראומתי ביותר של כימותרפיה, ועד טיפול ירידה של 8% מחשש ל4,6 נשירת שיער. יש גם עדויות בהתקרחות אנדרוגנית לתמוך טיפול להפחתת השלכות פסיכולוגיות ואפילו רפואיות של 8,9 נשירת שיער. כמו כן, אלופציה אריאטה דווחה להיות השלכות פסיכולוגיות קשות 2, ואת האופי אחיד של נשירת השיער יכול להוביל לתוצאה קוסמטית לא נעימות, יותר מרוב הגורמים אחרים לנשירת שיער.
בעוד תרופות עם השפעות מתונות אנטי-אנדרוגנית (כלומר, ספירונולקטון) היו בשימוש עם הצלחה מוגבלת כטיפול להתקרחות, התרופה היעילה הראשונה להתקרחות מינוקסידיל הייתה 10. יש להורדת לחץ דם זה תופעות לוואי שנצפה בגרימת צמיחת שיער, ועכשיו משמשת כטיפול מקומי לצורות רבות של התקרחות. עם זאת, תגובות הן לעתים קרובות לא שלמות, עם כמה נושאים המראים רק איטיing של נשירת שיער ולא לצמיחה מחודשת בפועל 10. פינסטריד הוא אנטגוניסט תחרותי להקליד השני 5α-רדוקטאז שהמרה בלוקים של טסטוסטרון לדיהידרוטסטוסטרון, וכתוצאה מכך השיפור בהתקרחות אנדרוגנית על חשבון מצור אנדרוגן המערכתי חלקי. שיעורי תגובה עם טווח ארוך טיפול (10 שנים) הם סביב 50% -11. בסך הכל, למרות מחקר רב בתחום זה, עדיין אין טיפול הולם לנשירת שיער.
במשך עשרות שנים, מדענים ורופאים בחנו את שיטות של מדידת צמיחת שיער קרקפת בניסויים קליניים. עם התפתחותה של תרופות המטפלות בהתקרחות, חל צורך גדול יותר באמצעי אמין, חסכוני ופולשנית למדידת צמיחת שיער ו, במיוחד, תגובה לטיפול. טכנולוגית ניתוח תמונה לכימות מדויק של צפיפות שיער בחולים עם הפרעות נשירת שיער הניבה תוצאות עקביות ותקפה בעבר תוך שימוש במגוון של techniques, כולל ניתוח של תמונות דיגיטציה 12, ניתוח תמונה של שערות בודדות ועור נגעים 13, וסריקה מיקרוסקופית לכמת המוני שיער באזור קרקפת מוגדר 14.
למרבה הצער, בעת מתודולוגיות מעל סיפקו הערכה משופרת של יעילות לשיער צמיחה-קידום התערבויות בניסויים קליניים, שיטות אלה לא הוחלו על מחקרים במכרסמים בחקירות פרה-קליניים. המטרה שלנו היא לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך בצורה מדויקת יותר ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לצורות שונות של התקרחות. פיתחנו מתודולוגיה שימוש בציוד זמין ברוב המעבדות אשר תאפשר כימות מהיר ואמין של צפיפות שיער בעכברים עם שיער שחור או חום. מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, alopecia areata, והתקרחות מwaxing. פרוטוקול מפורט מוצג לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. כטכניקה זו מסתמכת על גילוי קליטת אור מפיגמנטים בשערה, זה לא יכול לשמש כדי לזהות את צמיחת שיער בעכברים לבנים או עכברים לבקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל המחקרים שכללו בעלי חיים חייבים להיות מאושרים על ידי IACUC של המוסד (לנתונים העוקב, פרוטוקולים אושרו על ידי מונטיפיורי IACUC, פרוטוקול # 11-6-240 ו# 13-7-100). בעלי חיים מסופקים הרדמה אור כפי שצוינו למטרה הבלעדית של שמירה עליהם עדיין בצילום, אין נהלים כואבים הנדרשים לפרוטוקול זה.
1. רכישת תמונות
- קבע את מוקד ושדה הראייה לתרמי ג'ל משתמש בנייר עם טקסט מודפס. ודא אחידות של מקור אור על פני אזור מצולם. כדי להבטיח אחידות, להשתמש תרמי ג'ל עם שנבנה במקור אור לצילום רעיוני. אל תשתמש במקור אור שקוף, כמו זה ליצור צללית של החיה שאינה מתאים לניתוח בגווני אפור נוסף.
הערה: זה יהיה מקום העכבר קצת מחוץ לפוקוס, המספק מיצוע אופטי על פני האזור של העניין (ROI) ולעזור להפחית את שגיאות quantal לאזורים (כלומר, <10 פיקסל) קטנים מאוד של עניין. אזורים גדולים יותר של ריבית לא יושפעו על ידי קטין זה מתמקד התאמה, לא יהיה להם להיות מושפע מהבדלים בגודל של החיה. - להרדים בעלי חיים באמצעות קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) / xylazine (20 מ"ג / מיליליטר) (2: 1), כפי שזה מספק השפעת הרדמה מהירה והתאוששות מהירה ואופטימלי לצילום בעלי חיים רבים.
הערה: הרדמה הוא אישר כאשר החיה היא עדיין מספיק כדי לאפשר צילום. כבעלי חיים בדרך כלל להתאושש מההרדמה האור הזה בתוך 10-15 דקות, הווטרינר לא מומלץ שימוש במשחות עיניים. - הנח בעלי חיים הרדימו על תרמי ג'ל ביישור אנכי (קרוב במקביל ככל האפשר).
- לצילומי גב, הנח את בעלי החיים במצב שכיבה עם גפיים מורחבים.
- לצילומי הגחון, למקם את בעלי חיים במצב שכיבה, דואג שבעלי החיים לא מסובבים רוחבי.
- הנח סטנדרטי בגווני אפור באזור מצולם.
- דלת גישה קרובה. החשוב: Ambient אור יכול להציג את השינויים בחשיפה.
- הגדר F-stop לחשיפה המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי של רכישה (קריאת F-stop).
הערה: רוב המערכות תציג בי התמונה רוויה. - קח תמונה.
- שינוי F-להפסיק להגדרת חשיפה נוספת המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי על ידי הגדלת או הקטנת F-stop על ידי 1, כך ששניהם הסטנדרטי באזור של עניין ולהישאר בטווח ליניארי של רכישה (התייחסות F- לעצור).
- קח תמונה.
- ברגע צילום הושלם, למקם את בעלי החיים על שולחן התחממות ולעקוב אחר עד שהם יכולים לשמור על כיבו sternal. חזור חיות בכלובים שלהם. להחזיר את הקבוצה של בעלי חיים לביבר לאחר שכל בעלי החיים התאוששו באופן מלא.
2. כימות קליטת אור </ P>
- אזורי מארק ריבית על התמונות של בעלי החיים באמצעות סיפקו תוכנה לתרמי ג'ל.
- להשקפת גב חיה שלמה, להשתמש בתמונה מלבנית או סגלגלה המשתרעת מהגפיים העליונים לגפיים התחתונים, המשתרעת לרוחב ככל האפשר כך ששום חלק של התיבה חורגת האחורי של בעלי החיים, כפי שמוצג באיור 1 א.
הערה: אפשר גם לסמן את השטח של עניין באמצעות כלי ציור ביד חופשית. - לתצוגת הגחון בעלי חיים שלמה, להשתמש 2 מלבנים: אחד המכסה את אזור אגן ואחד המכסה את אזור החזה, כפי שמוצג באיור 1 ב.
- לאזור קטן יותר של עניין, כלומר, מיקום של מתן תרופה, סימן כמתאים.
- להשקפת גב חיה שלמה, להשתמש בתמונה מלבנית או סגלגלה המשתרעת מהגפיים העליונים לגפיים התחתונים, המשתרעת לרוחב ככל האפשר כך ששום חלק של התיבה חורגת האחורי של בעלי החיים, כפי שמוצג באיור 1 א.
- מארק אזור (ים) של ריבית על תקן קליטה בגווני אפור.
- שיא קליטה מכל אחד מהאזורים המסומנים של עניין.
3. ניתוח
obtaine רמות הקליטהד לאזורים של עניין ייתכן שיהיה הצורך מנורמל לסטנדרטי רקע להשוואה בין צילומים. מערכת היחסים של חשיפה לקליטה הוא לוג-לוג (כלומר, מערכת היחסים הוא ליניארי בין יומן (חשיפה) ולהיכנס (קליטה)). שימוש במערכת יחסים זו, הקליטה של האזור של עניין יכולה להיות מנורמלת לערך רקע סטנדרטי, אשר יאפשר קליטה להשוואה ישירה בין תמונות שונות, כוללים אלה שצולמו בנקודות זמן שונות (כלומר, מדידות סידוריים בתוך פרוטוקול מחקר). ההליך לביצוע תיקונים אלה מפורט בשלבים אופציונליים 3.1 ו -3.2.
- עקומה (אופציונלית) מגרש של יומן (חשיפה) לעומת יומן (קליטה) תוך שימוש בערכים המתקבלים מתקן קליטה בגווני אפור.
- (אופציונאלי) כוון לוריאציות ברמת כל תצלום כדלקמן:
- בחר F-stop לקריאה (כפי שנקבע בשלב 1.6) ו- F-stop להתייחסות (כפי שנקבע בסעיףTEP 1.8).
- לחשב קליטה ממוצעת של סטנדרטי בכל התמונות בF-להפסיק לקרוא. ממוצע זה הוא התייחסות תקן הערך (RSV).
- לחשב הבדל בקליטה בין הקריאה והגדרות F-stop התייחסות בכל תצלום לסטנדרטי (דלתא-S) ולכל ROI המוגדר (דלתא-ROI-1, דלתא-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- לחשב את הספיגה המתוקנת לכל החזר על השקעה באופן הבא: קליטה מתוקנת (ROI-X) = קליטה (ROI-X) בקריאת F-stop + (RSV - קליטה סטנדרטית בקריאת F-stop) * (דלתא-ROI-X / דלתא-S)
- לקמפל נתוני ניסוי ולבצע ניתוח נתונים תוך שימוש בטכניקות סטטיסטיות סטנדרטית למשתנים רציפים (כלומר, ANOVA, T-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקה זו קיבלה תוקף באמצעות C3H / עכברים HeJ engrafted, מודל העכבר של אלופסיה 16. בעלי חיים אלה לפתח נשירת שיער בעולם, אשר מתקדמת בהדרגה לאורך זמן. עם זאת, נשירת השיער מתרחשת בטלאים, ועשויה להשתנות מעכבר אחד למשנהו, מציגה השתנות ניכרת ופוגעת הערכות איכותיות. מודל זה סיפק הזדמנות לבחון מתאמים בין המדידות של צפיפות אופטית במקומות שונים בעכבר כהערכה של תוקף.
הייתה השאלה הראשונה צעדים אם באמצעות חשיפות שונות, וריאציות בתיחום החזר על השקעה, ואת ההחזר על ההשקעה של מאזורים שאינם חופף באותו העכבר היה בקורלציה. היה קשר מובהק (p <0.0001) ראה השוואת ROIs שהוגדרה על ידי סטנדרטים סגלגלים מלבניים לעומת על פני השטח הגבי של העכבר (איור 4 א). באופן דומה מתאמים גבוהים נראו באתרים שונים בבעלי החיים ובdiffeלשכור רמות חשיפה (לא מוצג). הדבר זה מצביע על רמה גבוהה של דיוק במדידות אלה. היה גם קשר מובהק בין הקליטה בF-להפסיק 2.0 לעומת 1.2 על פני השטח הגב של הגב באמצעות ROIs המלבני (p <0.0001, איור 4). מתאם משמעותי נצפה גם כאשר משווה בין מדידות קליטת הגב ופני שטח הגחון של אותו עכבר (p <0.0001, איור 4C). נתונים אלה מספקים הוכחה לכך שמדידות קליטה נלקחו מאתרים שונים באותו החיה מתואמות, כצפוי בC3H / HeJ engrafted מודל עכבר, והמתאמים אלה יישארו ליניארי על פני מגוון רחב של נשירת שיער. זה עוזר לבסס את התקפות של המדידות בגווני אפור וגם קובע את חוסן של טכניקה זו לשינויים ברכישת תמונה וטכניקת ניתוח.
השאלה השנייה הייתה אם יש עקביות בין מדידות סידורי נלקחו מבעלי החיים זהים בנקודות זמן שונות. להעריך את זה, תמונות התקבלו מC3H / HeJ engrafted עכברים על בסיס שבועי למשך 3 שבועות. C3H העכבר / HeJ engrafted יהיה צפוי להציג נשירת שיער הדרגתית לאורך זמן זה. ניתוח בגווני אפור על פני השטח הגחון (אזור חזה, החזר על השקעה בצורת קופסא) הראה נשירת שיער צפויה זה, עם מגמת ירידה עקבית מנקודת זמן אחת לשנייה (איור 5). ראוי לציין, רק 80% מעכברי engrafted C3H / HeJ להראות נשירת שיער, ואלו עם הערכים הגבוהים ביותר בגווני אפור לא מראים ירידה זו, ולא להציג תוצאות עקביות בתקופת הניסוי. עקביות זו של מדד בבעלי חיים ללא נשירת שיער גם אושרה בC57BL / 6 העכבר 19. אותו הניתוח שבוצע באזור הירך של פני השטח הגחון ועל פני השטח הגבי הראה תוצאות דומות על פני זמן (לא מוצג).
עם תוצאות מעודדות אלה מיישום של טכניקה זו בC3H / HeJ engrafted בעלי חיים,חקירות נוספות שנערכו במודל חיה שונה, אחד מההתקרחות בעקבות כימותרפיה. C57BL / 6 עכברים שקבלו 3 קורסים שבועיים של ציקלופוספמיד יהיה variably לפתח שיער דליל הגלובלי וdepigmentation. טכניקת הניתוח בגווני אפור שתתואר בהמשך הועסקה לכמת את השינויים הללו, וכדי להעריך את התגובה להתערבויות טיפוליות 17. במודל זה, הניתוח בגווני אפור הוכיח להיות כלי רב עוצמה במתן הערכות כמותיות של שינויים בעקבות כימותרפיה במעיל שיער, ומותר אימות של שפעות טיפול על ידי ניתוח סטטיסטי. במודל אחר של התקרחות כימותרפיה, היו אתגרים מיוחדים בניצול הניתוח בגווני אפור הזה. במודל זה, בעלי חיים בשעווה על המשטח הגבי לסנכרן את זקיקי שיער, ולאחר מכן טופלו במנה אחת של ציקלופוספמיד 9 ימים לאחר מכן, כאשר זקיקי שיער נכנסו שלב VI anagen ומקסימאלי רגישים לchemotherapeutics 18. שעווההאזור הוא האזור של עניין למחקר, אבל האזור של שעווה עשוי להיות בגודל משתנה. הגבלת ROI באזור בשעווה מאפשרת כימות של שני הפסדים וצמיחה מחודש של שיער לאחר מתן ציקלופוספמיד 19. יתר על כן, הטכניקה מאפשרת הערכה מדויקת של הבדלים תלויים-מינון בתגובה לטיפול של טיפול ניסיוני. יישום זה ממחיש את היתרונות שיש גמישות בהגדרת ROI בטכניקה זו.
כדי להמחיש עוד יותר את היישום של טכניקה זו, ובלבד הם ניתוח נתוני ביניים של מחקר מתמשך בC57BL / 6 ניצול הפרוטוקול של ממשל cyclophosphamide השבועי שצוין לעיל. טופלו עכברים בן 8 שבוע עם רכב או ציקלופוספמיד / קילוגרם / wk 50 מ"ג במשך 3 שבועות. עכברים שטופל בכימותרפיה הראו נשירת שיער חזותי לכאורה לאחר 2 חודשים, בעוד שבעלי חיים שטופל רכב מעיל שיער נורמלי (איור 6 א). ניתוח בגווני אפור היה לנוצר כפי שצוין לעיל, מראה הבדל (p <0.05) משמעותי בין עכברי כימותרפיה ובקרות רכב (איור 6).
איור 1: תצוגה גולמית של שיער שינויים בגב ופני שטח הגחון של C3H / HeJ engrafted עכברים, מודל העכבר של אלופציה אראטה הערה החיות לפתח נשירת שיער בעולם, אשר מתקדמת בהדרגה לאורך זמן תצוגה הגבי (), עם תיחום נציג.. של אזורים של עניין (ROIs) לניתוח בגווני אפור, סגלגל או מלבני כפי שצוין. תצוגה (B) הגחון עם אזורים שונים של עניין לניתוח בגווני אפור בחזה, המקביל לאזור ungroomed, או ירך, המקביל לאזור מטופח.
איור 2:.. גרף רמת Pixel על ניתוח בגווני אפור לעומת סטנדרטי המספר של Tiffen התרשים של Tiffen הסטנדרטי צולם על תרמי הג'ל על F-עצירות מצויינים (א) לרמת פיקסל לעומת המספר של Tiffen, מראה צפוי קשר לוגריתמים (B. ) שינוי לוגריתמי, בטווח זה ממשיך לעקוב יחסים קוי.
איור 3:. רמת Pixel על ניתוח בגווני אפור לעומת F-stop התרשים של Tiffen הסטנדרטי צולם על תרמי הג'ל על F-עצירות מצויינים. זממו הם הווריאציות ברמת הפיקסל ראו בכמה תקנים של Tiffen שונים לעומת F-stop. שים לב שהקווים אינם מקבילים, מצביע על כך שתיקונים ליישר סטנדרטים בין photograPHS צריך להיות מחושב בנפרד עבור כל אזור של עניין.
איור 4:. מתאם בין טכניקות צילום שונות ואזורים של עניין בניתוח בגווני אפור מוצגים הם מתאמים בין טכניקות מדידה המצוינות נלקחו מאותו C3H / HeJ engrafted עכבר באותה נקודת הזמן () מתאם של מלבן לעומת האזור הסגלגל של. ריבית על השקפת הגב. מתאם (B) של F להפסיק 2.0 לעומת 1.2 באמצעות אזור המלבני של עניין. מתאם (C) של ערכים בגווני אפור מתצוגות גב והגחון, אזור המלבני של עניין. כל המתאמים היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית, כפי שנקבעו על ידי הניתוח ליניארי רגרסיה (p <0.0001).
איור 5: כמובן זמן של שינוי בקליטה באמצעות ניתוח בגווני אפור בC3H / HeJ engrafted עכברי צבעים מצביעים על מדידות סידורי מעכברים בודדים.. שים לב לעקביות לכל עכבר מנקודת זמן אחת לשנייה.
איור 6:.. ניתוח גווני אפור בעכברי C57BL6 / J בעקבות כימותרפיה התקרחות 6 שבועות ישנים טופלו גם עם רכב (N = 6) או 3 מנות שבועיות של ציקלופוספמיד (50 מ"ג / קילוגרם) (N = 6) (א) קבוצה מייצגת של 3 עכברים מכל אחת מקבוצות הטיפול, צילמה 2 חודשים לאחר תחילת הטיפול הכימותרפי. נתונים (B) מלוקט מניתוח בגווני אפור מכל קבוצה, המראה ירידה בקליטה עם ממשל cyclophosphamide (p <0.05). שים לב להתאמה בין שיער הגלויהפסד בפנל והפחתה מובהקת סטטיסטי בקליטה בB. הפנל
| ערכי קליטה הם כדלקמן: | |||
| צילום | F-stop | החזר על השקעה | קליטה |
| 1 | 2 | סטנדרטי | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | סטנדרטי | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | סטנדרטי | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | סטנדרטי | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| קריאה להפסיק F נבחר כ2.0, ההפניה F-מפסיק נבחר כ3.0. | |||
| התייחסות תקן ערך (RSV) = ממוצע של קליטה סטנדרטית מהתמונה 1 ותמונה 2 בF-להפסיק 2.0, RSV = ממוצע (90, 110) = 100 | |||
| לתמונה 1: | |||
| דלתא-S = 150-90 = 60 | |||
| דלתא-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| דלתא-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| קליטה מתוקנת לROI-1 = 100 + (100 - 90) * (60/60) = 110 | |||
| לתמונה 2: | |||
| דלתא-S = 160-110 = 50 | |||
| דלתא-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| דלתא-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| קליטה מתוקנת לROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 | |||
| קליטה מתוקנת לROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 | |||
טבלה 1:. חישוב לדוגמא לתיקון הבדלים בחשיפה בין תמונות השולחן מראה דוגמא של איך לפצות על הבדלים קלים בקליטתם של הסטנדרטים בין תמונות (שלב אופציונאלי 3.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדוח זה תיאור מפורט מסופק בטכניקה חדשה לכימות נשירת שיער במכרסמים. טכניקה זו מנצלת תרמי ג'ל לרכישת תמונה וניתוח, ציוד שהוא זמין ברוב המעבדות. המדידות הוכחו להיות חזק כדי שינויים קלים בטכניקה (איורים 4-5), ומתואמים היטב לדרגת אובדן ראייה שיער במודלים של טיפול (איור 6). טכניקות אלו הועסקו בהצלחה בהערכה של טיפולים ניסיוניים להתקרחות 17.
כלי כמותי להערכת צמיחת שיער במכרסמים יכול להיות בעל ערך רב בקידום מחקר בתרופה להתקרחות. יש מודלים של עכברים רבים להתקרחות שונות מהותי, שהופך אותו קשה לבסס תוצאות על ערכות סובייקטיביות של התערבויות טיפוליות. כמו כן, הערכה כמותית אשר מספקת תוצאה בצורהשל מדד רציף ניתן לסכם על ידי ממוצעי קבוצה וסטיית תקן / שגיאה סטנדרטית, וניתן לבדוק באמצעות טכניקות סטטיסטיות סטנדרטיים (ANOVA, T-test). הערכה כמותית זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד תגובות על פני סדרה של נקודות זמן, וניתן להשתמש בו ביצירת עקומת מנה-תגובה למתחם בדיקה. ניתוח כמותי וכך מאפשר להערכות המבוססות על ראיות ליעילות של תרופות שנמצאות בפיתוח.
טכניקה זו מנצלת את ההבדל בצבע בין מעיל שיער ובהווה עור בזני עכבר רבים. לעכברים עם שיער כהה, הגדולה יותר צפיפות השיער, הכמות הגדולה יותר של קליטה אופטית. קליטה אופטית ניתן לכמת באמצעות מכשיר ההדמיה ג'ל, שנועד להעריך את הקליטה אופטית באזור מוגדר של עניין לכמת כמויות חלבון בניתוח כתם מערבי. בדומה לניתוח כתם מערבי, מדידות קליטה וכתוצאה מכך יכולות להיות אנאליתyzed באמצעות שיטות סטטיסטיות מקובלות להשוות צפיפות שיער בין קבוצות של עכברים (כלומר, טיפול לעומת קבוצת ביקורת).
ניתוח כתם מערבי מתבצע בדרך כלל על תמונה אחת שהוא ניתח בהשוואה לסטנדרטים הניתנים על תמונה ש. עם זאת, עם יישום זה, זה הופך להיות נחוץ כדי לעשות השוואות בין תמונות שונות, שניתן לקחת בזמנים שונים. עם טכניקת צילום מאוד עקבית, וריאציות בין תמונות ניתן למזער. עם זאת, ליישום ניסיוני, זה מועיל אם שינויים קלים בחשיפה בין תמונות ניתן פיצוי ל. לפיכך, חשוב שסטנדרטי בגווני אפור ייכלל בתצלום (כלומר, התרשים בגווני אפור של Tiffen 15). עם זאת, הקשר בין הקליטה והחשיפה משתנה בהתאם לצפיפות האופטית של היעד (איור 2 א). לכן, אם יש בגווני אפור סטנדרטי צפיפות אופטית שונה מת"אr קבל, התיקונים המתאימים עשויים להיות שונים. תיקוני לוגריתמי מועילים, אבל לא מספקים פתרון מושלם לבעיה זו (איור 2). על ידי לקיחת תמונות בF-2 תחנות שונות, ניתן לחשב קירוב ליניארי לסטנדרטי בגווני אפור ולכל יעד בתמונה, ובכך לספק קנה מידה מתאימה של התיקון למטרות האישיות. איור 3 מדגים כיצד מטרות עם אופטי שונה צפיפות תהיה גורמי תיקון שונים, אשר יכול להיות אינטרפולציה מהבדלים בקליטתו של כל יעד בF-2 תחנות שונות. לכן, אם אדם רוצה לנרמל הסטנדרטי לשווי של 150, יעד בצפיפות אופטית Tiffen 19 יהיה 148, אחד בTiffen 18 יהיה 140, אחד בTiffen 17 יהיו 119, וכן הלאה. במקום לפתור תיקונים אלה בצורה גרפית, אפשר להשתמש יחס של מדרונות בין סטנדרטי בגווני אפור והיעד בין 2 F-מפסיק לחשב את התיקון for כל יעד, כפי שמוסבר בדוגמא שסופקה (טבלה 1).
כמו כל הטכניקות, יש ניתוח כמותי של צמיחת שיער באמצעות ניתוח בגווני אפור מספר מגבלות. בראש ובראשונה, יש מורכבות חישובית משמעותיות ביישום של טכניקה זו. זה נובע מהעובדה שתוכנת הניתוח להדמית ג'ל היא מותאמת לניתוח כל דמות כניסוי נפרד. לפיכך, קיימת דרישה לתקן באופן ידני לכל שינוי בחשיפות בין תמונות. הקירוב לינארית לתיקונים כאלה עוזר לפשט את התהליך הזה. דוגמא מסופקת בטבלה 1: נתונים סימולציה של 2 סטים של צילומים, שצולמו בF-להפסיק 2.0 ו -3.0, עם תקן נפוץ. כל סט של תמונות יש 2 ROIs אשר צריך להיות בהשוואה בין קבוצות. הבדלים מזעריים בתנאי צילום גרמו את הסט הראשון של צילומים יש חשיפה מעט גדולה יותר מהקבוצה השנייה, evideNT על ידי הבדלים קלים בקליטת סטנדרטית הנפוצה.
הדוגמא מראה כיצד הבדלים קלים בתנאי צילום יכולים ליצור הבדלים ניכרים בקליטה בהחזר על השקעה נתון, אבל אלה ניתן לתקן באמצעות תקן התייחסות, במקרה זה מראה כי ספיגה בROIs אינו שונה בין 2 הקבוצות של תמונות.
חשוב לציין ששינוי בקליטת אור לא תמיד באופן ישיר כדי לתאם כמות השיער depigmentation או שינויים בצבע אחרים עלולים להיחשב בטעות לנשירת שיער או צמיחת שיער. למרבה הצער, את הדיוק של טכניקה זו לא ניתן להעריך, כי אין כיום סטנדרטי שבה להשוות זהב. עם זאת, שבו יש נשירת שיער ברורה, הטכניקה עושה לייצר תוצאות הצפויות (איור 6). לבסוף, אין כיום נתונים על מנת להעריך אם תוצאות שימוש בטכניקה זו תואמות את התוצאות בניסויים קליניים של תרופות פוטנציאליות.
<p class = "jove_content"> הניתוח בגווני אפור לכימות נשירת שיער בצורות שונות של התקרחות מהווה הזדמנות כדי לחדד ולתקנן שיטות לאפיון מודלים של התקרחות ולתגובות בדיקות לתרופות פוטנציאליות. יישום של טכניקה זו צריכה לשפר את זיהוי ופיתוח של טיפולים יעילים יותר בהתקרחות.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
- McAndrews, P. J. American Hair Loss Association. , http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp (2011).
- Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989. Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).
- Hussein, A. M. Chemotherapy-induced alopecia: new developments. South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).
- Trueb, R. M. Chemotherapy-induced hair loss. Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).
- Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia. J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).
- McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. Psychological sequelae and alopecia among women with cancer. Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).
- Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. Alopecia: effect on cancer patients' body image. Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).
- Stough, D. Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men. Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).
- Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. Alopecia: the case for medical necessity. Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).
- Olsen, E. A. A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men. J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).
- Rossi, A. 1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up. Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).
- Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. Computer-aided quantification of scalp hair. Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).
- Fleming, M. G. Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery. Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).
- Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. Methods of evaluating hair growth. Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).
- The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. http://www.imatest.com/docs/q13/ Forthcoming.
- Freyschmidt-Paul, P. Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus). Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model. Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).
- Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist. J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner. Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).
