Abstract
Alopecia è una forma comune di perdita dei capelli che può verificarsi in diverse condizioni, tra cui la perdita di capelli maschile-modello, la sindrome dell'ovaio policistico, e alopecia areata. Alopecia può verificarsi anche come effetto collaterale della chemioterapia in pazienti affetti da cancro. In questo studio, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà agli investigatori di valutare con precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per queste varie forme di alopecia. Il metodo utilizza un imager gel standard per ottenere ed elaborare immagini di topi, misurando l'assorbimento di luce, che si verifica in proporzione agitato per la quantità di capelli nero (o grigio) sul mouse. Dati che sono stati quantificati in questo modo possono essere analizzati con tecniche statistiche standard (ad esempio, ANOVA, T-test). Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata e alopecia da ceretta. In questo rapporto, il protocollo dettagliato è presENTED per l'esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Questa nuova tecnica offre una serie di vantaggi, tra cui relativa semplicità di applicazione, dipendenza apparecchiature che è prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori di ricerca, e l'applicazione di un obiettivo, valutazione quantitativa che è più robusto di valutazioni soggettive. Miglioramenti nella quantificazione della crescita dei capelli nei topi miglioreranno studio di modelli alopecia e facilitare la valutazione di promettenti nuove terapie in studi preclinici.
Introduction
Alopecia (perdita dei capelli) può essere un evento psicologicamente ed emotivamente angosciante con molteplici cause. Maschio-calvizie è la causa più comune di alopecia, che colpisce circa due terzi dei maschi per età 35 1. Un modello simile di perdita dei capelli può essere osservato nelle donne con sindrome dell'ovaio policistico. In entrambi questi disturbi, la perdita di capelli è mediata androgeni. Alopecia può verificarsi anche come una malattia autoimmune, alopecia areata, che colpisce 1,7% della popolazione 2. Alopecia può verificarsi come un effetto collaterale di alcuni trattamenti medici, come la chemioterapia 3. Una percentuale elevata (65-85%) dei pazienti in chemioterapia esperienza un certo grado di alopecia 4,5. Le conseguenze psicologiche della perdita di capelli sono stati ben studiati in ambito chemioterapia. Alopecia indotta da chemioterapia può causare ansia, depressione, un'immagine negativa del corpo, abbassato l'autostima e una riduzione del senso di benessere 6,7. Un alto percentuale (47-58%) dei pazienti oncologici femminili considerare la perdita di capelli per essere l'aspetto più traumatico della chemioterapia, e fino a 8% trattamento calo per paura di perdita di capelli 4,6. Ci sono anche prove in alopecia androgenetica per sostenere la terapia per ridurre le conseguenze psicologiche e anche medici di perdita di capelli 8,9. Allo stesso modo, l'alopecia areata è stato segnalato per avere gravi conseguenze psicologiche 2, e la natura irregolare della perdita dei capelli può portare a un risultato estetico più sgradevole rispetto alla maggior parte altre cause di perdita dei capelli.
Mentre i farmaci con effetti anti-androgenici lieve (cioè, spironolattone) erano stati utilizzati con successo limitato come terapia per l'alopecia, il primo farmaco efficace per l'alopecia era minoxidil 10. Questo antipertensivo ha un osservato effetto collaterale di causare la crescita dei capelli, ed è ora utilizzato come terapia topica per molte forme di alopecia. Tuttavia, le risposte sono spesso incomplete, con alcuni soggetti che mostra solo lentoing di perdita di capelli, piuttosto che la ricrescita reale 10. Finasteride è un antagonista competitivo di tipo II 5α-reduttasi che blocca la conversione del testosterone in diidrotestosterone, con conseguente miglioramento della alopecia androgenetica a scapito di parziale androgeni blocco sistemico. I tassi di risposta con-lungo termine (10 anni) terapia sono circa il 50% 11. Nel complesso, nonostante una notevole ricerca in questo settore, non c'è ancora una terapia adeguata per la perdita dei capelli.
Per decenni, gli scienziati e medici hanno esaminato i metodi di misurazione della crescita dei capelli del cuoio capelluto in studi clinici. Con lo sviluppo di farmaci che trattano alopecia, vi è stata una maggiore necessità di mezzo affidabile, economico e minimamente invasivi per misurare la crescita dei capelli e, in particolare, la risposta alla terapia. Tecnologia di analisi di immagine per una quantificazione precisa della densità dei capelli in pazienti con disturbi di perdita dei capelli ha dato risultati coerenti e validi in passato utilizzando una varietà di techniques, compresa l'analisi delle immagini digitalizzate 12, l'analisi delle immagini di singoli peli e lesioni 13 della pelle, e la scansione microscopica per quantificare la massa di capelli in una regione del cuoio capelluto definita 14.
Purtroppo, mentre le metodologie di cui sopra hanno fornito una migliore valutazione dell'efficacia per i capelli la crescita-promuovere interventi in studi clinici, questi metodi non siano state applicate a studi su roditori in studi preclinici. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà ai ricercatori di valutare con maggiore precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per varie forme di alopecia. Abbiamo sviluppato una metodologia utilizzando attrezzature facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori che permetteranno la quantificazione rapida e affidabile della densità dei capelli nei topi con capelli castani o neri. Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata, e alopecia da waxing. Un protocollo dettagliato è presentato per l'esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Poiché questa tecnica si basa sulla rilevazione di assorbimento della luce da pigmenti nel capello, non può essere utilizzato per rilevare la crescita dei capelli in topi bianchi o topi albini.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti gli studi che coinvolgono animali devono essere approvate dal IACUC dell'istituzione (per i dati che segue, i protocolli sono stati approvati dal Montefiore IACUC, protocollo # 11-6-240 e 13-7-100 #). Gli animali vengono forniti anestesia leggeri come indicato al solo scopo di tenerli fermi durante fotografia, non esistono procedure dolorose richieste per questo protocollo.
1. Acquisizione di fotografie
- Impostare fuoco e campo visivo per imager gel utilizzando carta con il testo stampato. Verificare uniformità della fonte di luce in tutta regione fotografato. Per garantire l'uniformità, utilizzare un imager gel con un costruito in fonte di luce per la fotografia riflettente. Non utilizzare una fonte di luce transilluminazione, in quanto ciò creerebbe una silhouette dell'animale, che non è adatto per ulteriori analisi in scala di grigi.
NOTA: Questo metterà il mouse leggermente fuori fuoco, che fornisce media ottica in tutta la regione di interesse (ROI) e volontàridurre gli errori quantali molto piccoli (cioè <10 pixel) regioni di interesse. Regioni più grandi d'interesse non saranno interessati da questo piccolo fuoco di regolazione, né saranno influenzati dalle differenze nelle dimensioni dell'animale. - Anestetizzare animali utilizzando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), in quanto fornisce un rapido effetto anestesia e rapido recupero ed è ottimale per fotografare multipli animali.
NOTA: L'anestesia è confermata quando l'animale è ancora sufficiente per permettere fotografia. Come animali in genere recuperano da questa luce anestesia entro 10-15 minuti, il veterinario non ha raccomandato l'uso di pomate oculari. - Inserire animali anestetizzati su gel imager in allineamento verticale (più vicino a parallelo possibile).
- Per le fotografie dorsali, mettere gli animali in posizione prona con gli arti estesi.
- Per le fotografie ventrali, mettere gli animali in posizione supina, facendo attenzione che gli animali non sono ruotati lateralmente.
- Luogo di serie in scala di grigi nella regione fotografato.
- Chiudere la porta di accesso. Importante: luce ambientale può introdurre variazioni di esposizione.
- Set F-stop di un'esposizione che pone la regione di interesse all'interno della gamma lineare di acquisizione (lettura F-stop).
NOTA: La maggior parte dei sistemi saranno visualizzare in cui l'immagine è satura. - Prendere fotografia.
- Change F-Stop un'altra impostazione dell'esposizione che pone la regione di interesse all'interno del range lineare aumentando o diminuendo il F-stop da 1, tale che sia il livello e la regione di interesse rimangono in una serie lineare di acquisizione (domanda F- stop).
- Prendere fotografia.
- Una volta che la fotografia è completata, posizionare gli animali su un tavolo di riscaldamento e monitorare fino a che non possono mantenere decubito sternale. Animali tornare alle loro gabbie. Restituisce il gruppo di animali di vivaio una volta che tutti gli animali sono completamente recuperati.
2. Quantificazione di assorbimento della luce </ P>
- Regioni Mark di interesse sulle immagini degli animali uso del software fornito per il gel imager.
- Per tutta la vista dorsale animale, utilizzare un'immagine rettangolare o ovale estende dalle arti superiori agli arti inferiori, che si estende lateralmente per quanto possibile tale che nessuna parte della scatola si estende oltre la parte posteriore dell'animale come mostrato nella Figura 1A.
NOTA: Si potrebbe anche segnare l'area di interesse utilizzando uno strumento di disegno a mano libera. - Per animale intero vista ventrale, utilizzare 2 rettangoli: coprire la regione pelvica e coprire la zona del torace come mostrato nella Figura 1B.
- Per una regione più piccola di interesse, vale a dire, la posizione di somministrazione del farmaco, marchio a seconda dei casi.
- Per tutta la vista dorsale animale, utilizzare un'immagine rettangolare o ovale estende dalle arti superiori agli arti inferiori, che si estende lateralmente per quanto possibile tale che nessuna parte della scatola si estende oltre la parte posteriore dell'animale come mostrato nella Figura 1A.
- Regione Mark (s) di interesse sullo standard di assorbimento in scala di grigi.
- Assorbimento Registrare da ciascuna delle regioni marcate di interesse.
3. Analisi
Livelli di assorbimento richiederlod per le regioni di interesse potrebbe essere necessario normalizzato allo standard di sfondo per il confronto tra le fotografie. Il rapporto di esposizione ad assorbimento è log-log (cioè, il rapporto è lineare tra log (esposizione) e di registro (assorbimento)). Con questo rapporto, l'assorbimento della regione di interesse può essere normalizzato ad un valore sfondo standard, che permetterà assorbimenti di essere confrontati direttamente tra diverse fotografie, comprese quelle prese a diversi momenti (ad esempio, le misurazioni seriali all'interno di un protocollo di studio). La procedura per l'esecuzione di queste correzioni è dettagliata in passaggi facoltativi 3.1 e 3.2.
- (Opzionale) curva Aree log (esposizione) vs. log (assorbimento) con valori ottenuti dallo standard di assorbimento in scala di grigi.
- (Opzionale) Regolare le variazioni di livello di ogni fotografia come segue:
- Selezionare F-stop per la lettura (come determinato al punto 1.6) e F-stop di riferimento (come determinato in sTep 1.8).
- Calcolare assorbimento medio dello standard in tutte le fotografie alla lettura F-stop. Questa media è il valore di riferimento standard (RSV).
- Calcolare differenza di assorbimento tra la lettura e le impostazioni di F-stop di riferimento in ogni fotografia per lo standard (delta-S) e per ogni ROI definita (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Calcolare l'assorbimento corretto per ogni ROI come segue: assorbimento corretto (ROI-X) = Assorbimento (ROI-X) a lettura F-stop + (RSV - assorbimento di serie a leggere F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Compilare i dati sperimentali ed eseguire l'analisi dei dati utilizzando tecniche statistiche standard per le variabili continue (ad esempio, ANOVA, T-test).
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Representative Results
Questa tecnica è stata convalidata utilizzando C3H / HeJ trapiantate, il modello murino di alopecia areata 16. Questi animali sviluppano la perdita di capelli globale che progredisce gradualmente nel tempo. Tuttavia, la perdita dei capelli avviene a chiazze, e può variare da un mouse al successivo, introducendo notevole variabilità e ostacolando valutazioni qualitative. Questo modello ha fornito l'occasione per testare le correlazioni tra misurazioni della densità ottica in diversi punti il mouse come un giudizio di validità.
La prima domanda è stata se le misure usando diverse esposizioni, variazioni di ROI di demarcazione, e il ROI di da aree che non si sovrappongono sul erano correlate stesso mouse. C'è stata una correlazione significativa (p <0,0001) visto confrontando ROI definita da standard ovali rettangolari vs. sulla superficie dorsale del mouse (Figura 4A). Allo stesso modo elevate correlazioni sono stati visti in diversi siti sull'animale ea diffeaffittare livelli di esposizione (non illustrato). Ciò indica un elevato grado di precisione in queste misurazioni. C'è stata anche una significativa correlazione tra assorbimento a F-stop 2.0 vs. 1.2 sulla superficie dorsale della schiena utilizzando ROI rettangolari (p <0,0001, Figura 4B). Una correlazione significativa è stata osservata anche quando si confrontano le misurazioni di assorbimento tra la dorsale e superficie ventrale del mouse stesso (p <0,0001, Figura 4C). Questi dati forniscono la prova che le misure di assorbimento prelevati da siti differenti sullo stesso animale sono correlati, come previsto nel C3H / HeJ innestato modello di topo, e queste correlazioni restano lineare in una vasta gamma di perdita di capelli. Questo aiuta a stabilire la validità delle misure in scala di grigi e stabilisce anche la robustezza di questa tecnica alle variazioni di acquisizione delle immagini e la tecnica di analisi.
La seconda domanda è se vi sia coerenza tra le misure seriali presi dalo stesso animale a tempi diversi. Per valutare questo, le immagini sono state ottenute delle C3H / HeJ innestato topi su base settimanale per 3 settimane. Il C3H / mouse HeJ innestato ci si aspetterebbe per visualizzare la perdita di capelli graduale su questo tempo. Analisi Scala di grigi sulla superficie ventrale (regione toracica, ROI scatolare) mostrava questa perdita di capelli attesa, con costante tendenza decrescente da un punto temporale al successivo (Figura 5). Da notare, solo l'80% dei C3H / HeJ topi engrafted mostrano la perdita di capelli, e quelli con i più alti valori di scala di grigi non mostrano questo declino, anzi presentano risultati costanti in tutto il periodo sperimentale. Questa coerenza della misura in animali senza perdita dei capelli è stato verificato anche in C57BL / 6 del mouse 19. La stessa analisi effettuata sulla regione coscia della superficie ventrale e sulla superficie dorsale ha mostrato risultati simili nel tempo (non mostrato).
Con questi risultati incoraggianti di applicazione di questa tecnica in C3H / HeJ innestato animali,ulteriori indagini sono state condotte in un modello animale diverso, uno di alopecia indotta da chemioterapia. C57BL / 6 topi che ricevono 3 corsi settimanali di ciclofosfamide sarà variabile svilupperà diradamento dei capelli globale e depigmentazione. La tecnica di analisi in scala di grigi qui descritta è stata utilizzata per quantificare questi cambiamenti, e di valutare la risposta agli interventi terapeutici 17. In questo modello, l'analisi in scala di grigi si è rivelato uno strumento potente nel fornire valutazioni quantitative dei cambiamenti indotti dalla chemioterapia in pelo, e permesso la verifica degli effetti del trattamento per l'analisi statistica. In un altro modello di chemioterapia alopecia, ci sono stati problemi particolari in utilizzando questa analisi in scala di grigi. In questo modello, gli animali vengono spalmati sulla superficie dorsale per sincronizzare i follicoli piliferi, quindi trattati con una singola dose di ciclofosfamide dopo 9 giorni, quando i follicoli piliferi sono entrati fase anagen VI e sono massimamente sensibile a chemioterapici 18. La ceraregione è la regione di interesse per lo studio, ma la zona della ceretta potrebbe essere di dimensione variabile. Limitare il ROI per all'interno della regione cerata consente di quantificare sia la perdita e la ricrescita dei capelli dopo la somministrazione di ciclofosfamide 19. Inoltre, la tecnica consente una valutazione accurata delle differenze di dose-dipendente in risposta al trattamento di una terapia sperimentale. Questa applicazione illustra i vantaggi di avere flessibilità nel definire la ROI in questa tecnica.
Per illustrare ulteriormente l'applicazione di questa tecnica, purché siano un'analisi dei dati ad interim di uno studio in corso in C57BL / 6 utilizzando il protocollo di somministrazione di ciclofosfamide settimanale sopra indicato. 8 settimane di età topi sono stati trattati con veicolo o 50 mg / kg / sett ciclofosfamide per 3 settimane. Topi trattati con chemioterapia ha mostrato la perdita di capelli dall'aspetto dopo 2 mesi, mentre gli animali di veicoli trattati avevano un normale mantello (Figura 6A). Analisi Scala di grigi era performata come sopra indicato, mostrando significativa (p <0.05) differenza tra topi chemioterapia e comandi del veicolo (Figura 6B).
Figura 1: vista lordo delle variazioni di capelli sulla dorsale e superficie ventrale C3H / HeJ innestato topi, il modello murino di alopecia areata noti gli animali sviluppano la perdita di capelli globale che progredisce gradualmente nel tempo vista (A) dorsale, con delimitazione rappresentante.. di regioni di interesse (ROI) per l'analisi in scala di grigi, ovale o rettangolare, come indicato. (B) Vista ventrale con diverse regioni di interesse per l'analisi in scala di grigi in petto, corrispondenti ad un'area ungroomed, o la coscia, corrispondenti ad un'area curato.
Figura 2:.. Livello di pixel su analisi in scala di grigi rispetto al numero di serie del Tiffen grafico Uno standard di Tiffen è stato fotografato su un imager gel a gli F-stop indicati (A) grafico di livello Pixel rispetto al numero di Tiffen, mostrando atteso rapporto logaritmica (B. ) trasformazione logaritmica, in questa gamma continua a seguire una relazione non lineare.
Figura 3:. Livello di pixel in scala di grigi rispetto all'analisi F-stop chart Uno standard di Tiffen è stato fotografato su un imager gel a gli F-stop indicati. Tracciati sono le variazioni del livello di pixel visti per diversi standard di Tiffen diversi vs F-stop. Si noti che le linee non sono parallele, che indica che le correzioni di allineare gli standard tra photograPHS devono essere calcolati singolarmente per ciascuna regione di interesse.
Figura 4:. Correlazione tra diverse tecniche e regioni di interesse fotografiche in scala di grigi di analisi riportati sono correlazioni tra le tecniche di misurazione indicati prese dalla stessa C3H / HeJ innestato mouse allo stesso tempo punto (A) Correlazione di rettangolo vs. regione ovale. interessi sulla vista dorsale. (B) Correlazione di F fermare 2.0 vs. 1.2 utilizzando un'area rettangolare di interesse. (C) Correlazione dei valori in scala di grigi da vista dorsale e ventrale, un'area rettangolare di interesse. Tutti correlazioni erano statisticamente significative come determinato mediante analisi di regressione lineare (p <0,0001).
Figura 5: corso Tempo di cambiamenti in assorbimento utilizzando l'analisi in scala di grigi in C3H / HeJ innestato topi colori indicano le misurazioni seriali da singoli topi.. Nota la consistenza per ogni mouse da un punto temporale al successivo.
Figura 6:.. Analisi in scala di grigi indotta da chemioterapia alopecia 6 settimane topi C57BL6 / J sono stati trattati con veicolo (N = 6) o 3 dosi settimanali di ciclofosfamide (50 mg / kg) (N = 6) (A) gruppo rappresentativo di 3 topi di ciascuno dei gruppi di trattamento, fotografato 2 mesi dopo l'inizio della chemioterapia. (B) i dati compilati da analisi in scala di grigi da ciascun gruppo, mostrando una diminuzione di assorbimento con somministrazione di ciclofosfamide (p <0.05). Si noti la correlazione tra i capelli visibiliperdita di pannello A e una riduzione statisticamente significativa in assorbimento nel pannello B.
| Valori di assorbimento sono i seguenti: | |||
| Fotografia | F-stop | ROI | Assorbimento |
| 1 | 2 | Standard | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Standard | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Standard | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Standard | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Lettura F-Stop scelto come 2.0, Riferimento F-Stop scelto come 3.0. | |||
| Riferimento Valore standard (RSV) = medio di assorbimento di norma dal 1 fotografia e fotografia 2 a F-stop 2.0, RSV = media (90, 110) = 100 | |||
| Per fotografia 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Assorbimento corretto per il ROI-1 = 100 + (100 - 90) * (60/60) = 110 | |||
| Per fotografia 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Assorbimento corretto per il ROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 | |||
| Assorbimento corretto per il ROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 | |||
Tabella 1:. Esempio di calcolo per correggere le differenze di esposizione tra fotografie La tabella mostra un esempio di come per compensare piccole differenze di assorbimento degli standard tra fotografie (step opzionale 3.2).
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Discussion
In questo rapporto una descrizione dettagliata è dotata di una nuova tecnica per quantificare la perdita dei capelli nei roditori. Questa tecnica utilizza un imager gel per l'acquisizione delle immagini e analisi, apparecchi che è prontamente disponibile in molti laboratori. Le misurazioni hanno dimostrato di essere robusto per piccole variazioni nella tecnica (figure 4 - 5), e sono ben correlati al grado di perdita di capelli visiva in modelli di trattamento (Figura 6). Queste tecniche sono state impiegate con successo nella valutazione delle terapie sperimentali per alopecia 17.
Uno strumento per la valutazione quantitativa della crescita dei capelli nei roditori può essere molto utile nel portare avanti la ricerca in terapie per l'alopecia. Molti modelli di mouse per alopecia hanno variabilità intrinseca, che rende difficile basare i risultati su valutazioni soggettive di interventi terapeutici. Analogamente, una valutazione quantitativa che fornisce un risultato sotto formadi una misura continua può essere riassunto da medie di gruppo e deviazione standard / errore standard, e può essere testato con tecniche statistiche standard (ANOVA, T-test). Questa valutazione quantitativa può essere utilizzato per misurare le risposte su una serie di punti di tempo, e può essere utilizzato per generare una curva dose-risposta per un composto in esame. L'analisi quantitativa permette quindi per le valutazioni basate sulle prove di efficacia di terapie che sono in fase di sviluppo.
Questa tecnica sfrutta la differenza di colore tra mantello e la pelle presente in molti ceppi di topi. Per i topi con capelli scuri, maggiore è la densità dei capelli, la maggiore quantità di assorbimento ottico. Questo assorbimento ottico può essere quantificato utilizzando un apparato di imaging gel, che è stato progettato per valutare assorbimento ottico in una regione definita di interesse per quantificare quantità di proteine in western blot. Simile ad analisi Western Blot, le conseguenti misure di assorbimento può essere analeyzed utilizzando metodi statistici standard per confrontare la densità dei capelli tra i gruppi di topi (cioè, il trattamento contro il controllo).
Analisi Western blot viene generalmente eseguita su una singola immagine che viene analizzato rispetto agli standard previsti su quell'immagine. Tuttavia, con questa applicazione, diventa necessario fare confronti tra immagini diverse, che possono essere presi in tempi diversi. Con la tecnica fotografica molto consistente, variazioni tra fotografie possono essere ridotti al minimo. Tuttavia, per l'applicazione sperimentale, è utile se lievi variazioni di esposizione tra le fotografie possono essere compensati. Pertanto, è importante che una norma scala di grigi essere inclusa nella fotografia (cioè, grafico scala di grigi del Tiffen 15). Tuttavia, il rapporto tra assorbimento e l'esposizione varia a seconda della densità ottica del bersaglio (Figura 2A). Pertanto, se lo standard scala di grigio ha una densità ottica diversa dalla target, le opportune correzioni possono essere diverse. Correzioni logaritmiche sono utili, ma non forniscono una soluzione perfetta a questo problema (Figura 2B). Per scattare fotografie a 2 diversi F-stop, si può calcolare una approssimazione lineare per lo standard in scala di grigi e per ogni destinazione sulla fotografia, e quindi fornire una scala adeguata della correzione per i singoli obiettivi. Figura 3 illustra come bersagli con diverse ottiche densità avranno altri fattori di correzione, che possono essere interpolati da differenze di assorbimento di ciascun target a 2 diversi F-stop. Così, se si vuole normalizzare il livello al valore di 150, un bersaglio a densità ottica Tiffen 19 sarebbe 148, uno alla Tiffen 18 sarebbe 140, uno alla Tiffen 17 sarebbe 119, e così via. Invece di risolvere queste correzioni graficamente, si può utilizzare un rapporto di piste tra la norma in scala di grigi e il target tra il 2 f-stop per calcolare la correzione for ogni bersaglio, come spiegato nell'esempio fornito (Tabella 1).
Come tutte le tecniche, l'analisi quantitativa della crescita dei capelli attraverso l'analisi in scala di grigio ha diversi limiti. In primo luogo, vi è una significativa complessità computazionale in applicazione di questa tecnica. Ciò è dovuto al fatto che il software di analisi per imager gel è ottimizzato per analizzare ogni figura come un esperimento separato. Pertanto, vi è un requisito per correggere manualmente per qualsiasi variazione esposizioni tra immagini. L'approssimazione linearizzato per tali correzioni aiuta a semplificare questo processo. Un esempio è fornito in Tabella 1: simulato dati di 2 set di fotografie, prese a F-stop 2.0 e 3.0, con uno standard comune. Ogni set di fotografie ha 2 ROI che devono essere confrontati tra le serie. Variazioni minime nelle condizioni fotografiche hanno causato la prima serie di fotografie per avere una leggermente maggiore esposizione rispetto al secondo set, evident per sfumature di assorbimento dello standard comune.
L'esempio mostra come piccole differenze nelle condizioni fotografiche possono creare differenze apparenti di assorbimento in un dato ROI, ma questi può essere corretto con uno standard di riferimento, in questo caso mostra che l'assorbimento alle ROI non differiscono tra i 2 set di immagini.
E 'importante notare che il cambiamento in assorbimento della luce non sempre direttamente correlate alla quantità di capelli depigmentazione o altri cambiamenti di colore potrebbe essere scambiata per la perdita di capelli o la crescita dei capelli. Purtroppo, la precisione di questa tecnica non può essere valutata perché non c'è attualmente alcuna gold standard con cui confrontare. Tuttavia, in cui è evidente perdita di capelli, la tecnica non produrre i risultati attesi (Figura 6). Infine, non ci sono attualmente dati per valutare se i risultati con questa tecnica sono correlati con i risultati in studi clinici di potenziali terapie.
<p class = "jove_content"> L'analisi in scala di grigi per quantificare la perdita dei capelli in varie forme di alopecia rappresenta un'opportunità per perfezionare e uniformare i metodi per la caratterizzazione di modelli di alopecia e per le risposte di test a potenziali terapie. L'applicazione di questa tecnica dovrebbe migliorare l'identificazione e lo sviluppo di terapie più efficaci per alopecia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
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