Abstract
Alopecia er en vanlig form for hårtap som kan forekomme i mange forskjellige forhold, blant annet mannlig mønster Hårtap, polycystisk ovariesyndrom, og alopecia areata. Alopecia kan også oppstå som en bivirkning av kjemoterapi hos kreftpasienter. I denne studien var vårt mål å utvikle et konsistent og pålitelig metode for å kvantifisere hårtap hos mus, som vil tillate etterforskere å nøyaktig vurdere og sammenligne nye terapeutiske tilnærminger for disse ulike former for alopecia. Fremgangsmåten utnytter en standard gel sensoren for å innhente og behandle bilder av mus, måling av lysabsorpsjon, som oppstår i grove forhold til mengden av svart (eller grå) håret på mus. Data som er kvantifisert i denne mote kan deretter bli analysert ved hjelp av standard statistiske teknikker (dvs. ANOVA, T-test). Denne metoden ble testet i mus modeller av kjemoterapi-indusert alopeci, alopecia areata og alopecia fra voksing. I denne rapporten er detaljert protokoll presented for å utføre slike målinger, herunder validering av data fra C57BL / 6 og C3H / HeJ stammer av mus. Denne nye teknikk gir en rekke fordeler, inkludert relative enkelhet av søknaden, avhengighet av utstyr som er lett tilgjengelig i de fleste forskningslaboratorier, og påføring av en objektiv, kvantitativ vurdering som er mer robust enn subjektive vurderinger. Forbedringer i kvantifisering av hårvekst hos mus vil forbedre studie av alopecia modeller og lette evaluering av lovende nye behandlingsformer i prekliniske studier.
Introduction
Alopecia (hårtap) kan være en psykologisk og følelsesmessig belastende hendelse med flere årsaker. Hann-mønster baldness er den vanligste årsaken til alopecia, påvirker omtrent to tredjedeler av menn ved alder 35 1. Et lignende mønster av håravfall kan observeres hos kvinner med polycystisk ovariesyndrom. I begge disse lidelsene, er håravfall androgen formidlet. Alopecia kan også oppstå som en autoimmun sykdom, alopecia areata, som rammer 1,7% av befolkningen 2. Alopecia kan oppstå som en bivirkning av noen medisinske behandlinger, for eksempel cellegift tre. En høy prosentandel (65-85%) av kjemoterapi pasienter opplever en viss grad av alopecia 4,5. De psykologiske konsekvensene av hårtap har blitt godt studert i kjemoterapi innstillingen. Cytostatikaindusert alopecia kan resultere i angst, depresjon, negativt kroppsbilde, senket selvfølelse og en redusert følelse av velvære 6,7. En høy percentage (47-58%) av kvinnelige kreftpasienter vurdere hårtap å være den mest traumatiske aspektet av kjemoterapi, og opp til 8% nedgang behandling av frykt for hårtap 4,6. Det er også bevis i androgen alopeci å støtte terapi for å redusere psykologiske og enda medisinske konsekvensene av hårtap 8,9. Likeledes har alopecia areata blitt rapportert å ha alvorlige psykiske konsekvenser to, og usammenhengende natur Hårtap kan føre til en mer ubehagelig kosmetisk resultat enn de fleste andre årsaker til håravfall.
Mens legemidler med milde anti-androgene effekter (dvs. spironolakton) hadde blitt brukt med begrenset suksess som terapi for alopecia, den første effektive medisiner mot alopecia var minoxidil 10. Dette antihypertensive har en observert bivirkning av forårsaker hårveksten, og brukes nå som lokal terapi for mange former for alopecia. Men svarene er ofte ufullstendige, med enkelte fag viser bare treging av hår tap heller enn faktiske gjenvekst 10. Finasteride er en konkurransedyktig antagonist til type II 5α-reduktase som blokkerer omdannelsen av testosteron til dihydrotestosteron, noe som resulterer i forbedringer i androgen alopeci på bekostning av delvis systemisk androgen blokade. Responsrater med langsiktige (10 år) terapi er rundt 50% 11. Samlet, til tross for betydelig forskning på dette området, er det fortsatt ingen adekvat behandling for hårtap.
I flere tiår har forskere og klinikere undersøkt metoder for å måle hodehårvekst i kliniske studier. Med utvikling av legemidler som behandler alopecia, har det vært et større behov for pålitelige, økonomiske og minimal invasiv måte å måle hårvekst og spesielt respons på behandling. Bildeanalyse-teknologi for en nøyaktig kvantifisering av hår tetthet hos pasienter med hårtap lidelser ga konsistente og gyldige resultater i det siste ved hjelp av en rekke techniques, inkludert analyse av digitaliserte bildene 12, bildeanalyse av individuelle hår og hud lesjoner 13, og mikroskopisk skanning for å kvantifisere håret masse i et definert skalp region 14.
Dessverre, mens de ovennevnte metoder har gitt bedre for vurdering av effekt for hår vekstfremmende tiltak i kliniske studier, disse metodene har ikke blitt brukt på gnagere i prekliniske undersøkelser. Vårt mål er å utvikle et konsistent og pålitelig metode for å kvantifisere hårtap hos mus, som vil tillate etterforskere til mer nøyaktig vurdere og sammenligne nye terapeutiske tilnærminger for ulike former for alopecia. Vi har utviklet en metode ved hjelp av utstyret er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier som vil tillate hurtig og pålitelig kvantifisering av hår densiteten i mus med brun eller sort hår. Denne metodikken har blitt testet i mus modeller av kjemoterapi-indusert alopeci, alopecia areata, og alopecia fra waxing. En detaljert protokoll er presentert for å utføre slike målinger, herunder validering av data fra C57BL / 6 og C3H / HeJ stammer av mus. Da denne teknikken er avhengig av deteksjon av lys absorpsjon fra pigmenter i hårskaftet, kan den ikke brukes til å detektere hårvekst i hvite mus eller albino mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle studier som involverer dyr må godkjennes av IACUC av institusjonen (for data som følger, ble protokoller godkjent av Montefiore IACUC, protokoll # 11-6-240 og # 13-7-100). Dyr er gitt lys anestesi som angitt for det formål å holde dem fortsatt under fotografering, det er ingen smertefulle prosedyrer som kreves for denne protokollen.
1. Kjøp av Photographs
- Sett fokus og synsfelt for gel imager bruker papir med trykt tekst. Verifisere ensartethet av lyskilde over fotografert regionen. Å bidra til å sikre ensartethet, bruke en gel imager med en innebygd lyskilde for reflekterende fotografering. Ikke bruk en transilluminasjon lyskilde, da dette ville skape en silhuett av dyret som er uegnet for videre gråtoner analyse.
MERK: Dette vil plassere musen litt ute av fokus, noe som gir optisk averaging hele regionen av interesse (ROI) og vilbidra til å redusere quantal feil for svært små (dvs. <10 pixel) regioner av interesse. Større regioner av interesse vil ikke bli påvirket av dette mindre fokusjustering, heller ikke vil de bli påvirket av forskjeller i størrelsen på dyret. - Bedøve dyrene ved hjelp av ketamin (100 mg / ml) / xylazin (20 mg / ml) (2: 1), da dette gir hurtig anestesi virkning og hurtig gjenvinning og er optimal for fotografering av flere dyr.
MERK: Anestesi bekreftes når dyret er likevel nok til å tillate fotografering. Som dyr vanligvis gjenopprette fra denne lette anestesi innenfor 10-15 min, har ikke veterinæren anbefalte bruk av øyet salver. - Plasser bedøvede dyr på gel imager i vertikal innretting (så nær parallelt som mulig).
- For rygg fotografier, plassere dyrene i liggende stilling med lemmer utvidet.
- For ventral fotografier, plasser dyr i liggende stilling, ta vare at dyrene ikke er sideveis roteres.
- Plasser gråtoner standard i fotografert regionen.
- Lukk dekselet. Viktig: Ambient lys kan introdusere variasjoner i eksponering.
- Sette F-stop til en eksponering som plasserer regionen av interesse innenfor den lineære området av oppkjøpet (lesing F-stop).
MERK: De fleste systemer vil vise hvor bildet er mettet. - Ta bilde.
- Endre F-stop til en annen eksponeringsinnstilling som plasserer regionen av interesse innenfor det lineære området ved å øke eller redusere F-stop med 1, slik at både standard og regionen av interesse forbli i en lineær rekke oppkjøp (referanse F- stoppe).
- Ta bilde.
- Når fotografering er ferdig, plasser dyr på en varmende bord og overvåke inntil de kan opprettholde sternum recumbency. Returnere dyr til burene. Returnere den gruppen av dyr til vivarium når alle dyrene er fullt restituert.
2. Kvantifisering of Light Absorpsjon </ P>
- Marker regioner av interesse på bilder av dyrene hjelp av medfølgende programvare for gel imager.
- For hele dyret dorsal vis ved å bruke en rektangulær eller oval bilde som strekker seg fra armene til de nedre lemmer, som strekker seg i sideretningen så mye som mulig, slik at ingen del av esken strekker seg ut over baksiden av dyret som vist i figur 1A.
MERK: Man kan også markere området av interesse å bruke en frihåndstegning verktøyet. - For hele dyr ventral visningen, bruker to rektangler: ett som dekker bekkenet og ett som dekker brystet området som vist i figur 1B.
- For et mindre område av interesse, dvs. plassering av narkotika administrasjon, mark som passer.
- For hele dyret dorsal vis ved å bruke en rektangulær eller oval bilde som strekker seg fra armene til de nedre lemmer, som strekker seg i sideretningen så mye som mulig, slik at ingen del av esken strekker seg ut over baksiden av dyret som vist i figur 1A.
- Mark region (er) av interesse på gråtoner absorpsjon standard.
- Post absorpsjon fra hver av de merkede områder av interesse.
3. Analyse
Absorpsjon nivåer som ble oppnåddd for de regioner av interesse kan trenge å bli normalisert til bakgrunnen standard for sammenligning mellom fotografier. Forholdet mellom eksponering for absorpsjon er log-log (dvs. er forholdet lineær mellom log (eksponering) og logg (absorpsjon)). Ved hjelp av dette forholdet, kan absorpsjonen av området av interesse bli normalisert til en standard bakgrunnsverdi, som vil tillate absorpsjoner som skal sammenlignes direkte mellom forskjellige fotografier, inkludert de som er tatt ved forskjellige tidspunkter (dvs. seriemålinger innenfor et studieprotokoll). Fremgangsmåten for utførelse av disse korreksjonene er beskrevet i valgfritt trinn 3.1 og 3.2.
- (Valgfritt) Plot kurve av log (eksponering) vs. log (absorpsjon) med verdier hentet fra gråtoner absorpsjon standard.
- (Valgfritt) Juster for variasjoner i standarden på hvert bilde som følger:
- Velge F-stop for å lese (som bestemt i trinn 1.6) og F-stop for referanse (som bestemmes i sTep 1.8).
- Beregne gjennomsnittlig absorpsjon av standarden i alle bildene ved å lese F-stop. Dette gjennomsnittet er Reference Standard Verdi (RSV).
- Beregne forskjell i absorpsjon mellom lesing og referanse F-stop innstillinger i hvert bilde for standard (delta-S) og for hver definerte ROI (delta-ROI-en, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Beregne korrigert absorpsjon for hver ROI som følger: Korrigert absorpsjon (ROI-X) = Absorpsjon (ROI-X) ved å lese F-stop + (RSV - absorpsjon av standard ved å lese F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Kompilere eksperimentelle data og utføre dataanalyse ved anvendelse av standard statistiske metoder for kontinuerlige variabler (dvs. ANOVA, T-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknikken ble validert ved hjelp C3H / HeJ innpodet mus, musemodell av alopecia areata 16. Disse dyrene utvikle global hårtap som utvikler seg gradvis over tid. Men skjer det hårtap i patcher, og kan variere fra ett muse til den neste, innføre betydelig variabilitet og hindrer kvalitative vurderinger. Denne modellen gitt en mulighet til å teste sammenhenger mellom målinger av optisk tetthet på forskjellige steder på musen som en vurdering av gyldigheten.
Det første spørsmålet var om tiltak ved hjelp av ulike eksponeringer, variasjoner i ROI avgrensning, og ROI er fra ikke-overlappende områder på samme mus ble korrelert. Det var en signifikant korrelasjon (p <0,0001) sett sammenligne Rois definert av rektangulære vs. ovale standarder på dorsalflaten på musen (Figur 4A). Tilsvarende høye korrelasjoner ble sett på forskjellige steder på dyret og på diffeleie eksponeringsnivåer (ikke vist). Dette indikerer en høy grad av nøyaktighet i målingene. Det var også en signifikant korrelasjon mellom absorpsjon ved F-stopp 2,0 vs. 1,2 på den dorsale overflaten til baksiden ved hjelp av rektangulære ROIs (p <0,0001, figur 4B). En signifikant korrelasjon ble observert selv når man sammenligner absorpsjon målinger mellom den dorsale og ventrale overflate av den samme mus (p <0,0001, figur 4C). Disse dataene gir bevis for at absorpsjon målinger tatt fra forskjellige steder på samme dyr er korrelert, som forventet i C3H / HeJ innpodet musemodell, og disse sammenhengene forbli lineær over et bredt spekter av hårtap. Dette bidrar til å etablere gyldigheten av gråtoner målinger og etablerer også robusthet av denne teknikken til variasjoner i bildeopptak og analyseteknikk.
Det andre spørsmålet var om det er konsistens mellom serielle målinger tatt fradet samme dyr ved forskjellige tidspunkter. For å vurdere dette, ble bildene innhentet av C3H / HeJ innpodet mus på en ukentlig basis for tre uker. Den C3H / HeJ mus innpodet ville være forventet å vise gradvis tap av hår i løpet av denne tiden. Gråtoner analyse på ventral overflaten (bryst regionen, boks-formet ROI) viste denne forventede hårtap, med konsekvent nedadgående trend fra ett tidspunkt til det neste (Figur 5). Av notatet, bare 80% av C3H / HeJ innpodet mus viser hårtap, og de med høyest gråtoner verdiene viser ikke denne nedgangen, heller vise konsistente resultater på tvers av forsøksperioden. Denne konsistensen av tiltaket i dyr uten hår tap ble også bekreftet i C57BL / 6 mus 19. Den samme analysen utføres på lårområdet i den ventrale overflate og på den dorsale overflaten viste lignende resultater over tid (ikke vist).
Med disse oppmuntrende resultater fra anvendelse av denne teknikken i C3H / HeJ innpodet dyrytterligere undersøkelser ble utført i en annen dyremodell, en av kjemoterapi-indusert alopecia. C57BL / 6 mus som får tre ukentlige kurs av cyklofosfamid vil løst utvikle globale hår tynning og depigmentering. Den gråtoner analyse teknikk beskrevet her ble ansatt for å kvantifisere disse endringene, og for å vurdere respons på terapeutiske intervensjoner 17. I denne modellen, viste gråtoner analyse for å være et kraftig verktøy i å gi kvantitative vurderinger av kjemoterapi-indusert endringer i pels, og tillatt verifikasjon av behandlingseffekter ved statistisk analyse. I en annen modell av kjemoterapi alopecia, var det spesielle utfordringer i å utnytte dette gråtoner analyse. I denne modellen er dyr vokset på framsiden for å synkronisere hårsekkene, deretter behandlet med en enkelt dose av cyklofosfamid 9 dager senere, når hårsekkene har angitt anagen VI scenen og er maksimalt følsomme for kjemoterapeutika 18. Voksetregion er den regionen av interesse for studien, men området av voksing kan være av variabel størrelse. Begrenser ROI til innenfor den voksede regionen tillater kvantifisering av både tap og gjenvekst av hår etter cyklofosfamid administrasjon 19. Videre, tillater teknikken nøyaktig vurdering av doseavhengige forskjeller i respons på behandling av en eksperimentell terapi. Denne søknaden illustrerer fordelene ved å ha fleksibilitet i å definere ROI i denne teknikk.
For ytterligere å illustrere anvendelsen av denne teknikken, forut er en midlertidig dataanalyse av en pågående studie i C57BL / 6 benytter protokollen for ukentlige cyklofosfamid administrering er angitt ovenfor. 8 uker gamle mus som ble behandlet med bærer eller 50 mg / kg / uke cyklofosfamid i 3 uker. Kjemoterapi-behandlede mus viste visuelt tydelig hårtap etter to måneder, mens vehikkelbehandlede dyrene hadde en normal pels (figur 6A). Gråtoner analyse var perdannet som angitt ovenfor, viser signifikant (p <0,05) forskjell mellom kjemoterapi mus og bærerkontroller (figur 6B).
Figur 1: Brutto visning av hår endringer på dorsal og ventral overflaten av C3H / HeJ innpodet mus, musemodell av alopecia areata Merk dyrene utvikle globale hårtap som utvikler seg gradvis over tid (A) Dorsal utsikt, med representative avgrensning.. regioner av interesse (Rois) for gråtoner analyse, oval eller rektangulær som angitt. (B) Ventral syn med ulike regioner av interesse for gråtoner analyse i brystet, tilsvarende en ustelt område, eller lår, tilsvarende en preparert område.
Figur 2:.. Pixel nivå på gråtoner analyse vs. Tiffen nummer standard En standard Tiffen diagram ble fotografert på en gel imager på de angitte F-stopp (A) Diagram over Pixel nivå vs. Tiffen nummer, som viser forventet logaritmisk forhold (B. ) Logaritmisk transformasjon, i dette område fortsetter å følge en ikke-lineær relasjon.
Figur 3:. Pixel nivå på gråtoner analyse vs F-stop En standard Tiffen diagram ble fotografert på en gel imager på de angitte F-stopp. Plottet er variasjoner i pikselnivå sett i flere forskjellige Tiffen standarder vs F-stop. Merk at linjene ikke er parallelle, noe som indikerer at korreksjoner for å justere standarder mellom fotografenPHS må være individuelt beregnet for hver region av interesse.
Figur 4:. Sammenheng mellom ulike fotografiske teknikker og regioner av interesse i gråtoner analyse Vist er korrelasjoner mellom de angitte måleteknikker hentet fra den samme C3H / HeJ innpodet mus på samme tidspunkt (A) Korrelasjon av rektangelet vs. oval regionen. renter på rygg visningen. (B) Korrelasjon av F stoppe 2.0 vs. 1.2 i rektangulært område av interesse. (C) Korrelasjon av gråtoner verdier fra dorsal og ventral utsikt, rektangulært område av interesse. Alle korrelasjoner var statistisk signifikant, som bestemt ved lineær regresjonsanalyse (p <0,0001).
Figur 5: Tid løpet av endring i absorpsjon å bruke gråtoner analyse i C3H / HeJ innpodet mus farger indikerer serie målinger fra individuelle mus.. Legg merke til konsistens for hver mus fra ett tidspunkt til det neste.
Figur 6:.. Gråtoner analyse i kjemoterapi-indusert alopecia 6-uker gamle C57BL6 / J-mus ble behandlet med enten bærer (N = 6) eller tre ukentlige doser av cyklofosfamid (50 mg / kg) (N = 6) (A) representativ gruppe av tre mus fra hver av behandlingsgruppene, fotografert to måneder etter oppstart av kjemoterapi. (B) sammenstilte data fra gråtoner analyse fra hver gruppe, som viser nedsatt absorpsjon med cyklofosfamid administrasjon (p <0,05). Oppmerksom på sammenhengen mellom synlig hårtap i panel A og statistisk signifikant reduksjon i absorpsjonen i panel B.
| Absorpsjons-verdier er som følger: | |||
| Fotografi | F-stop | ROI | Absorpsjon |
| 1 | 2 | Standard | 90 |
| 1 | 2 | ROI-en | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Standard | 150 |
| 1 | 3 | ROI-en | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Standard | 110 |
| 2 | 2 | ROI-en | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Standard | 160 |
| 2 | 3 | ROI-en | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Reading F-stop valgt som 2.0, Reference F-stop valgt som 3.0. | |||
| Reference Standard Verdi (RSV) = gjennomsnitt av absorpsjon av standard fra fotografi 1 og bilde 2 ved F-stop 2.0, RSV = gjennomsnitt (90, 110) = 100 | |||
| For bilde 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Korrigert absorpsjon for ROI-1 = 100 + (100-90) * (60/60) = 110 | |||
| For bilde 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Korrigert absorpsjon for ROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 | |||
| Korrigert absorpsjon for ROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 | |||
Tabell 1:. Eksempel på beregning for å korrigere forskjeller i eksponering mellom fotografier Tabellen viser et eksempel på hvordan å kompensere for mindre forskjeller i absorpsjon av standardene mellom fotografier (valgfritt trinn 3.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten en detaljert beskrivelse er gitt av en ny teknikk for kvantifisering av håravfall hos gnagere. Denne teknikken benytter en gel imager for bildeopptak og analyse, utstyr som er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier. Målingene har vist seg å være robust overfor små variasjoner i teknikk (Tall 4-5), og er godt korrelert til graden av visuell hårtap i behandlingsmodeller (figur 6). Disse teknikkene har blitt ansatt i evaluering av eksperimentelle behandlingsformer for alopecia 17.
En kvantitativ verktøy for å vurdere hårvekst hos gnagere kan være svært verdifull i å fremme forskning i terapi for alopecia. Mange musemodeller for alopecia har iboende variabilitet, som gjør det vanskelig å basere resultater på subjektive vurderinger av terapeutiske intervensjoner. Likeledes, en kvantitativ vurdering som gir et resultat i formav et kontinuerlig mål kan oppsummeres ved gruppe gjennomsnitt og standardavvik / standardavvik, og kan bli testet ved anvendelse av standard statistiske metoder (ANOVA, t-test). Denne kvantitativ vurdering kan benyttes til å måle responser over en serie tidspunkter, og kan brukes til å generere en doseresponskurve for testforbindelsen. Kvantitativ analyse tillater dermed for evidensbaserte vurdering av effekt av legemiddelselskap som er under utvikling.
Denne teknikken utnytter forskjellen i farge mellom pels og huden til stede i mange musestammer. For mus med mørk håret, jo større tetthet av håret, jo større mengden av optisk absorpsjon. Denne optiske absorpsjon kan kvantifiseres ved anvendelse av en gel avbildningsapparat, som er utformet for å vurdere optisk absorpsjon i et definert område av interesse for å kvantifisere protein i mengder western blot-analyse. I likhet med western blot-analyse, kan de resulterende absorpsjonsmålinger være analyzed bruker standard statistiske metoder for å sammenligne hår tetthet mellom grupper av mus (dvs. behandling vs. kontroll).
Western blot-analyse blir generelt utført på en enkelt bilde som er analysert i forhold til standarder anordnet på det bildet. Men med dette programmet, blir det nødvendig å foreta sammenligninger mellom forskjellige bilder, som kan tas på ulike tidspunkter. Med veldig konsekvent fotografisk teknikk, kan variasjoner mellom fotografier minimeres. Men for eksperimentell søknad, er det nyttig at mindre variasjoner i eksponering mellom fotografier kan bli kompensert for. Således er det viktig at en gråskala standard inngå i fotografiet (dvs. Tiffen s gråtoner Figur 15). Men forholdet mellom absorpsjon og eksponeringen varierer avhengig av den optiske tetthet av målet (figur 2A). Hvis således gråskala-standarden har en annen optisk tetthet fra TArget, kan de nødvendige korreksjoner være annerledes. Logaritmiske korreksjoner er nyttig, men gir ikke en perfekt løsning på dette problemet (figur 2B). Ved å ta bilder i to forskjellige F-stopp, kan man beregne en lineær tilnærming for gråskala-standarden, og for hvert mål på fotografiet, og dermed gi en passende skalering av korreksjon for de individuelle mål. Figur 3 illustrerer hvordan mål med forskjellig optisk tettheter vil ha forskjellige korreksjonsfaktorer, som kan interpolert fra forskjeller i absorpsjon av hvert mål på to forskjellige F-stopp. Således, hvis man ønsker å normalisere til standard verdi på 150, vil et mål ved optisk tetthet Tiffen 19 være 148, en på Tiffen 18 ville være 140, en på Tiffen 17 vil være 119, og så videre. Snarere enn å løse disse korreksjonene grafisk, kan man bruke et forhold mellom bakkene mellom gråtoner standard og målet mellom to F-stopper å beregne korreksjonen for hvert mål, som forklart i den medfølgende eksempel (tabell 1).
Som alle teknikker, kvantitativ analyse av hår vekst gjennom gråtoner analyse har flere begrensninger. Først og fremst er det en betydelig beregningskompleksitet på anvendelse av denne teknikk. Dette resulterer fra det faktum at analysen programvare for gel-kameraer er optimalisert for å analysere hvert bilde som et separat eksperiment. Således er det et krav om å manuelt korrigere for enhver variasjon i eksponering mellom bildene. Den lineariserte tilnærming for slike korreksjoner hjelper forenkle denne prosessen. Et eksempel er gitt i Tabell 1: Simulert data fra to sett av fotografier, tatt ved F-stopp 2,0 og 3,0, med en felles standard. Hvert sett av bilder har to ROIs som må sammenlignes mellom settene. Mindre variasjoner i fotografiske forhold har forårsaket det første settet med bilder for å ha en litt større eksponering enn det andre settet, evident av små forskjeller i absorbsjonen av den felles standard.
Eksempelet viser hvordan små forskjeller i fotografiske forhold kan skape åpenbare forskjeller i absorpsjon ved en gitt avkastning, men disse kan korrigeres med en referansestandard, i dette tilfellet viser at absorpsjon på Rois ikke skiller mellom de to sett med bilder.
Det er viktig å merke seg at endringen i lys absorpsjon ikke alltid direkte relateres til mengde hår depigmentering eller andre fargeendringer kan forveksles med håravfall eller hårvekst. Dessverre, kan nøyaktigheten av denne teknikken ikke vurderes fordi det er for tiden ingen gullstandard som å sammenligne. Imidlertid, hvor det er åpenbart hårtap, gjør teknikken gir de forventede resultater (figur 6). Endelig er det foreløpig ingen data for å vurdere om resultater ved hjelp av denne teknikken korrelerer med resultater i kliniske studier av mulige behandlingsformer.
<p class = "jove_content"> The gråskala-analyse for å kvantifisere hårtap i ulike former for alopecia representerer en mulighet til å avgrense og standardisere metoder for å karakterisere modeller av alopecia og for å teste responsen til potensielle therapeutics. Anvendelsen av denne teknikken bør forbedre identifisering og utvikling av mer effektive behandlinger for alopecia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
- McAndrews, P. J. American Hair Loss Association. , http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp (2011).
- Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989. Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).
- Hussein, A. M. Chemotherapy-induced alopecia: new developments. South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).
- Trueb, R. M. Chemotherapy-induced hair loss. Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).
- Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia. J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).
- McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. Psychological sequelae and alopecia among women with cancer. Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).
- Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. Alopecia: effect on cancer patients' body image. Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).
- Stough, D. Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men. Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).
- Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. Alopecia: the case for medical necessity. Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).
- Olsen, E. A. A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men. J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).
- Rossi, A. 1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up. Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).
- Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. Computer-aided quantification of scalp hair. Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).
- Fleming, M. G. Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery. Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).
- Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. Methods of evaluating hair growth. Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).
- The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. http://www.imatest.com/docs/q13/ Forthcoming.
- Freyschmidt-Paul, P. Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus). Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model. Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).
- Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist. J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner. Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).
