Introduction
Het vermogen van PEG-geënte oppervlakken covalent gebonden biochemische liganden geven en tegelijkertijd het handhaven van inherent niet-fouling eigenschappen maken ze een ideale keuze voor techniek aangepaste microschaal omgevingen op cultuur substraten 1,2,3. De biospecifieke interacties gemedieerd door ligand geconjugeerd PEG borstels maakt reductionistische analyse van de effecten van biochemische signalen binnen complex in vivo weefsel microenvironments op individuele cel fenotypes. Bovendien kan bio-orthogonaal "click" chemie worden gebruikt om gericht immobilisatie van liganden, zodat zij worden gepresenteerd in natieve conformaties 4-6. Zo microschaal ruimtelijke patronen van PEG borstels is een veelzijdige tool om designer in vitro niches creëren om cell signaling geïnduceerd door geïmmobiliseerd biochemische 6,7 signalen te onderzoeken.
Een gebruikelijke methode voor het genereren van ruimtelijke patronen van biochemische cues meebrengt microcontactprinten (μCP) goud gecoate substraten met patronen van PEG geconjugeerde alkaanthiolen. Vervolgens de micropatterned monolaag (SAM) van PEG-ylated alkaanthiolen beperkt fysische adsorptie van biochemische moleculen, zoals eiwitten, alleen zonder patroon gebieden van het substraat 8,9. Echter, de opbrengst van deze techniek SAM's zijn gevoelig voor oxidatie in lange termijn celcultuur media. Aldus μCP'd alkaanthiol SAMs vaak verder geënt met PEG polymeerborstels met oppervlak geïnitieerde atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (SI-ATRP) de regio aangroeiloze stabiliteit 10 verhogen. Specifiek μCP van de alkaanthiol polymerisatie-initiator, ω-meraptoundecyl broomisobutyraat op goud gecoate oppervlakken gevolgd door SI ATRP-poly (ethyleenglycol) methyl ether methacrylaat (PEGMEMA) monomeren genereert oppervlakken micropatterned lange termijn stabiele en niet- fouling PEG borstels. Bovendien zijn deze kunnen worden gewijzigd naar aanleiding van diverse chemische eenheden 11 aanwezig.
Gebruik te maken van deze eigenschap, Sha et. al. een methode ontwikkeld om de cultuur substraten met meerdere componenten PEGMEMA borstels presenteren orthogonaal "click" chemie engineer. Bij deze werkwijze gebruikt men een reeks μCP / SI-ATRP stappen afgewisseld met sequentiële natriumazide, ethanolamine en propargylamine nucleofiele substituties cultuur substraten presenteren microschaal patronen van meerdere geïmmobiliseerde liganden 6 maken. Terwijl de mogelijkheden van het gebruik van dergelijke chemie in combinatie met handmatige μCP op nieuwe cultuur substraten ingenieur is enorm, wordt beperkt door de precisie en nauwkeurigheid waarmee meerdere μCP stappen kunnen worden uitgelijnd op een enkel substraat. Een hoog niveau van precisie en nauwkeurigheid zou moeten reproduceerbaar vervaardigen complex in vitro nissen met deze veelzijdige technieken.
e_content "> Om deze beperking te pakken, zijn er verschillende geautomatiseerde en semi-geautomatiseerde μCP systemen gegenereerd. Chakra et. al. ontwikkelden een μCP systeem waarin aangepaste stempels op een railsysteem worden geplaatst en bracht in conforme contact met goud gecoate dia's met behulp een computergestuurde pneumatische actuator. Deze werkwijze vereist de precieze fabricage van eigen stempel ontwerpen en meldt 10 micrometer nauwkeurigheid geen melding van de bereikte nauwkeurigheid bij het uitvoeren van meerdere μCP stap 12. Meer recent is een methode waarbij een geïntegreerd kinematische koppelsysteem gemeld precisie dan 1 urn met één patroon, maar konden meerdere patronen nauwkeurig uitlijnen door een gebrek aan nauwkeurige controle stempel functies van matrijs vormen 13. Bovendien beide vorige methoden vereisen het substraat vast blijven tussen patroonvorming stappen waardoor aanzienlijk beperken van de diversiteit van oppervlaktemodificatie chemie die kunnen wordengebruikt. Hier beschrijven we een geautomatiseerde R-μCP systeem dat in staat accurate en nauwkeurige uitlijning van meerdere μCP stappen terwijl het toestaan van maximale flexibiliteit in het stempel ontwerp en fabricage. Bovendien kan de gevormde substraten herhaaldelijk worden verwijderd uit het systeem van stampen, waarbij het gebruik van diverse substraat wijziging verbindingen, inclusief opeenvolgende nucleofiele substituties toelaat. Substraten ontwikkeld die dergelijke chemie zijn gebruikt voor celkweek eerder door zowel ons 6,14 en 7 anderen. Zo hebben we R-μCP en sequentiële nucleofiele substitutiereacties samengevoegd tot een werkwijze voor schaalbare vervaardiging van cultuur substraten met complexe en micropatterned biochemische signalen ontwikkelen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genereren Elastomeric Postzegels
- Om de PDMS stempel van silicium meesters te genereren, het ontwerp van de photomask's functie patronen met behulp van computer-aided design software.
- Ontwerp van het eerste patroon als een 20 x 20 matrix van annuli 300 urn inwendige diameter (ID) en 600 micrometer OD van 1,200 urn hart op hart afstand.
- Het ontwerp van de tweede patroon als een 20 x 20 matrix van annuli met 600 micrometer ID en 900 micrometer OD met 1,200 micrometer hart-op-hart afstand.
- Daarnaast plaatst u 1 x 1 mm 2 vierkante merktekens op alle vier de hoeken van elke array ontwerp gespreid 1.200 micrometer center-to-center uit de hoek patroon bij een hoek van 45 °.
- Fabriceren silicium matrijzen voor gebruik in dit experiment met 1: 1 aspectverhoudingen, correleert een 300 urn diepte feature toepassing van standaard lithografische technieken elders 15 of samen met een gedetailleerde microfluidic gieterij.
OPMERKING: Opties en diepten van minder dan 100 micrometer kan leiden tot abnormale vervorming van postzegels voorafgaand aan contact met substraat oppervlakken.
LET OP: Dit protocol begint met het hebben van al verkregen silicium meesters met de beschreven patronen van fotolak, die gespecialiseerde apparatuur en schone kamers te creëren vereist. Het is het beste om te overleggen met een fabrikant of bij de kern faciliteit om deze patronen masters te creëren.
- Silaniseren silicium masters O / N door incubatie met (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichloorsilaan damp.
OPMERKING: Silane damp is zeer giftig en mag alleen in een zuurkast worden behandeld. - Maak inverse replica van de silicium meesters door uitharden van een 10: 1 verhouding van PDMS prepolymeer en hardingsmiddel PDMS bovenop de gesilaniseerde silicium meesters in een petrischaal O / N bij 60 ° C.
- Verwijder de PDMS postzegels uit het silicium meesters, en bond de postzegels om acrylonitril butadieen styreen (ABS) backings of enig ander stijf materiaalis het gebruik van lijm.
Opmerking: Het materiaal van keuze behoeft niet doorzichtig of biocompatibel. Het moet echter een vlak oppervlak interactief door de robot tooling en hogere stijfheid dan PDMS.
2. Voorbereiding Coverslides
- Spoel microscoop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) in tolueen, methanol en ultrasone trillingen in aceton gedurende 1 minuut voor het spoelen met ethanol en drogen onder een zachte stikstofstroom.
OPMERKING: ga tolueen en aceton alleen in een zuurkast. - Coat coverslides met ~ 3.5 nm titanium (Ti), gevolgd door 18,0 nm goud (Au) met behulp van een gefocusseerde elektronenbundel verdamper.
Opmerking: Deze procedure is compatibel met een verscheidenheid van met goud beklede substraten zoals silicium en polystyreen. Hoewel het mogelijk is deze te genereren ter plaatse, met goud beklede substraten zijn beschikbaar via commerciële leveranciers.
OPMERKING: Ti lagen moet ten minste 3 nm dik, terwijl Au lagen op substraten moet eent minste 5 nm dik en kan tot aan 1 mm in dikte, afhankelijk van de ideale optische eigenschappen van het eindsubstraat 16,17 bereik. Substraten zijn niet nodig optisch helder voor de productie te zijn; echter, vergemakkelijkt microscopische analyse van producten van substraten. - Spoel goud gecoate coverslides met ethanol en droog onder zachte stikstof direct voor gebruik.
3. R-μCP van Outer Annulus
- Voordat R-μCP met het selectief compliant gelede robotarm (SCARA) systeem, kalibreert u de robotwerktuig effectoren en bijbehorende dubbele camera systemen met behulp van de software van het systeem.
LET OP: Deze worden ingezet afgebeeld in figuur 1.
Figuur 1. R- μCP System en Robotic Arm Tooling. (A) Grootschalige beeld van R-μCP systeem met alle gereedschappen en klemmen, (a) vacuum klauwplaat, (b) reagens bad, (c) naar beneden gerichte camera, (d) stempel nesten armatuur, (e) robotachtige tool. (B) Robotarm tooling beeltenis (f) gediamanteerde ets gereedschap en (g) pneumatische zuigkracht gereedschap met een (h) ABS-backed PDMS stempel.
- Handmatig op een PDMS stempel met 600 micrometer ID en 900 micrometer OD vooruitstekende annuli gezicht naar beneden in de stempel nesten armatuur. Handmatig op een vers gereinigd met goud beklede coverslide bovenop de vacuümklem, weergegeven in figuur 1A en immobiliseren met behulp van de aangesloten lab vacuüm.
- Met de robotbesturing, sluiten de naar beneden gerichte camera op het middelpunt van het goud gecoate coverslide, zoals in figuur 2A.
OPMERKING: Dit punt kan in eerste instantie worden bepaald door visuele inspectie en heeft geen grote nauwkeurigheid vereisen, zoals het PDMS stempel is veel groer zijn dan goud gecoate glijbaan. - Instrueer de robotarm tot vier referentie-etsen "X" markeringen op de hoekpunten van een vierkant met afmetingen 3,8 mm bij 3,8 mm gecentreerd op het goud gecoate coverslide behulp van de gediamanteerde ets hulpmiddel bevestigd aan de robotarm. (Weergegeven in figuur 2B; geautomatiseerd proces)
OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat alle vier merktekens zijn binnen een visuele omlijsting van de neerwaartse facing camera. - Met behulp van de robots pneumatische zuigkracht tooling, pick-up en houd de PDMS stempel 1 mm boven het stempel nesten competitieprogramma zoals in figuur 2C. (Geautomatiseerd proces)
- Met behulp van de opwaartse gerichte camera en LED-verlichting ring afgebeeld in figuur 2D en E, visualiseren referentievierkant merken van een stempel en identificeer ze met de camera software 10 keer om de stempel van de gemiddelde X, Y bepalen, en hoekafwijking van het centrum van de robot tooling as. (Geautomatiseerd proces)
- Zoals in
- 3.8) Plaats de stempel in een bad van alkaanthiol ATRP initiator, ω-mercaptoundecyl broomisobutyraat (2 mM in ethanol) zoals weergegeven in figuur 2F. (Geautomatiseerd proces)
- Verwijder de stempel van de alkaanthiol oplossing en plaats deze over stikstofstroom onder druk om 0,48 bar (5 psi) aan de ethanol verdampen zoals in figuur 2G. Na 1 min de druk op de stikstofstroom is 1,03 bar (15 psi) uniforme droog waarborgen. (Geautomatiseerd proces)
OPMERKING: Bij onvolledige droging zal resulteren in geheel of gedeeltelijk verlies van de patroon trouw. - Na drogen, beweegt de stempel op het berekende middenpositie van de goud gecoate glijbaan en zakken 100 urn porties onder controle Z-as motor force zoals in figuur 2H.
OPMERKING: Dit wordt gecommuniceerd als koppel ervaren door de Z-as motor en weergegeven in de robot begeleiding software. (Geautomatiseerd proces) - Stop verlagen van de stempel wanneer de vooraf bepaalde druk van 79,2 kPa is bereikt, en contact met goud gecoate glijbaan voor 15 sec te handhaven. (Geautomatiseerd proces)
OPMERKING: De druk waarden hier zijn geoptimaliseerd voor het huidige stempel design en functie hoogte. Als de stempel ontwerp wordt gewijzigd, specifiek voor hoge aspect ratio postzegels, tune deze dienovereenkomstig door een trial and error proces. - Verwijder langzaam de stempel van het goud gecoate dia en plaats de stempel terug in de stempel nesten armatuur. (Geautomatiseerd proces) 4. SI-ATRP van PEGMEMA op micropatterned Coverslides
- Laat onderdruk die de micropatterned coverslide, en overbrengen naar een 50 ml Schlenkkolf. Seal en ontgast de Schlenkkolf behulp van een vacuümpomp.
- Voeg 5,5 ml van ATRP reactiemengsel dat het macromonomeer PEGMEMA (208,75 mmol), water (34,4 ml), methanol (43,8 ml), koper (II) bromide (1 mmol), en 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) om de Schlenk kolf.
- Voeg 0,5 ml L-natriumascorbaat (454,3 mM) in water om de reactie te initiëren en deze te blijven gedurende 16 uur bij kamertemperatuur onder inert gas.
OPMERKING: Na toevoeging van L-natriumascorbaat, zal reactie kleurverschuiving van lichtgroen tot donkerbruin zoals getoond in figuur 3A-B.
OPMERKING: De reactie kan ook na 16 uur, maar het zal niet significante toename van de lengte van de PEG borstels. - Verwijder de micropatterned coverslide van Schenk kolf en spoel met ethanol, water en ethanol en drogen onder een zachte stikstofstroom.
OPMERKING: Na SI-ATRP, moet oppervlaktemodificaties zichtbaar voor het oog en kan worden afgebeeld en geanalyseerd onder een microscoop zoals in figuur 3C.
Opmerking: Dit is de eenvoudigste manier om de nauwkeurigheid van het proces te testen als het de noodzaak wegneemt om de substraten immunostain. - Plaats de micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon.
- Voeg 6 ml N, N-dimethylformamide (DMF) dat 100 mM natriumazide in de reactieflacon. Houd deze reactie bij 37 ° C gedurende 24 uur.
OPMERKING: ga DMF alleen in een zuurkast. Wees voorzichtig met het afwegen van natriumazide. - Na voltooiing, verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon en spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom.
- Plaats micropatterned coverslide in 20 ml glazen reactieflesjes.
- Voeg 6 ml dimethylsulfoxide (DMSO) die 100 mM ethanolamine en 300 mM triethylamine in de reactieflacon. Houd deze reactie bij 40 ° C gedurende 24 uur.
OPMERKING: ga DMSO, ethanolamine, en triethylamine alleen in een zuurkast. - Na voltooiing verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon, spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom.
- Voer R-μCP stappen zoals eerder beschreven in stap 3.2 en 3,6-3,12, vervangen van een PDMS stempel met 300 urn en 600 urn ID OD uitstekende ringvormige openingen, zodat de annuli met kleinere elementen in de eerder micropatterned annuli geplaatst.
OPMERKING: De druk drempel voor deze postzegel is 132,0 kPa. Zoals eerder vermeld, worden deze druk optimale instellingen voor de stempel functies wordt gebruikt in dit experiment. - Uitvoeren van SI-ATRP stappen zoals eerder beschreven in de stappen 4,1-4,4.
- Plaats micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon.
- Voeg 6 ml DMSO met 100 mMpropargylamine de reactieflacon. Houd deze reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
OPMERKING: ga DMSO en propargylamine alleen in een zuurkast. - Na voltooiing verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon en spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom.
- Plaats micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon.
- Voeg 6 ml kopersulfaat (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v water / DMF) bevattende 562 pM azide-PEG 4 biotine conjugaat aan de reactieflacon. Voeg 1,2 ml L-ascorbinezuur (0,15 mM) in water aan het mengsel om de reactie te initialiseren.
- Bubble stikstof door het reactiemengsel gedurende 10 sec, sluit de flacon met Parafilm en reageren gedurende 24 uur bij KT.
- Bij completion verwijderen micropatterned coverslide uit de reactie flacon, afspoelen met water en plaats deze in een 12-well polystyreen schaaltje.
- Blok micropatterned coverslide in DPBS (3% ezel serum) gedurende 1 uur bij KT. Kleuring voor gebiotinyleerde acetyleen groepen met streptavidine-conjugaat 546 (2 ug / ml) in DBP (3% ezel serum in PBS) gedurende 2 uur bij KT.
- Spoel micropatterned coverslide 5 keer met DPBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden.
OPMERKING: Figuur 4B toont een beeld van de schuif na deze stap voltooid. - Verlaat micropatterned coverslide in 12-well polystyrene gerecht volgende DBPs spoelt.
- Voeg 2 ml DBP (of celkweekmedium) bevattende 20 uM DBCO-PEG 4 biotine, en laat de reactie doorgaan gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (of bij 37 ° C in een incubator).
- Na voltooiing, spoel micropatterned coverslide 5 keer met DPBS (of gewoon een media-verandering uit te voeren).
- Kleuring voor gebiotinyleerde azide groepen met streptavidine-conjugaat 488 (2 ug / ml) in 2 ml DPBS (3% ezel serum) gedurende 2 uur bij KT.
- Spoel micropatterned coverslide 5 keer in DPBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden.
- Afbeelding micropatterned coverslide middels confocale fluorescentiemicroscoop. Figuur 4A-C toont afbeeldingen van de schuif na deze stap voltooid.
OPMERKING: Bij het gebruik van substraten voor weefselkweek assays, sla paragrafen 10 en 12 van dit protocol. Nadat de gewenste degree functionaliseringsgraad, steriliseren de gemanipuleerde coverslide gespoeld beide kanten met 100% ethanol en drogen onder een stikstofstroom. Overdracht van de dia naar een steriele biologische veiligheid kast en spoel de dia met PBS vijfmaal voordat u verder gaat met mobiele zaaien en cultuur.
5. Azide Functionalisering van micropatterned PEGMEMA Chains
6. Passiveren van Broom gefunctionaliseerde PEGMEMA Chains
7. R-μCP van Inner Annulus en SI-ATRP van PEGMEMA
8. Acetyleen Functionalisering van micropatterned PEGMEMA Chains
9. Koper-gekatalyseerde "Klik" Biotinylatie van acetyleen Afgebroken PEGMEMA Chains
10. Immunofluorescente Detectie van Gebiotinyleerde Acetyleen Groepen
11. Koper-free "Klik" Biotinylatie van Azide Afgebroken PEGMEMA Chains
OPMERKING: Indien gewenst, kan dit substraat modificatie stap in situ worden uitgevoerd tijdens de celcultuur.
12. Immunofluorescente Detectie van Gebiotinyleerde Azide Groepen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van handmatige aanpassing μCP technieken cultuur substraten met arrays van PEG-geënte borstels gefunctionaliseerd met orthogonale engineering "klik" chemie is in voorafgaand werk 6. Dit biedt echter weinig controle patroon oriëntatie en vaak resulteert in overlap van gefunctionaliseerde gebieden. Hier wordt een nieuw R-μCP systeem om deze beperking te overwinnen, en het accuraat patroon een reeks PEG borstel annuli 300 urn en 600 urn ID OD presenteren eindstandige alkyngroepen in een afzonderlijke matrix van PEG borstel annuli 600 urn ID en OD 900 urn presenteren azide eindstandige groepen wordt aangetoond 14. Na de reactie van alkyn presenteren PEG borstels met azide-PEG 3 biotine en de reactie van azide presenteren PEG borstels met DBCO-PEG 4 biotine werd het substraat immuungekleurd met fluorescerende probes en afgebeeld met behulp van een confocale microscoop (Figure 4). Analyse van deze beelden met een aangepaste MATLAB programma berekend dat de twee PEG borstel arrays werden uitgelijnd met sub- 10 urn nauwkeurigheid, dat wil zeggen, X ~ 6,4 urn, Y ~ 1.7 urn, en θ ~ 0,02 °, die aan de fabrikant genoemde grens van onze SCARA model (dat wil zeggen, ~ 10 micrometer) en een indicatie van de eerdere prestaties van de R-μCP systeem 14. Zo vinden wij dat het gebruik van duurdere SCARAs in dit systeem nog lager, sub-micron resolutie zou bieden. Deze resultaten tonen de veelzijdige substraat engineeringcapaciteiten mogelijk door het gecombineerde gebruik van de R-μCP systeem en sequentiële nucleofiele substitutiereacties. De minimale kruisreactiviteit blijkt uit fluorescentielabelling van de orthogonale oppervlakchemie dient om het potentieel van dit systeem voor nauwkeurige immobilisatie van biochemische signalen te complex cultuur substraten voor weefselregeneratie toepassingen genereren illustreren. </ P>
Figuur 2. Schematische R- μCP Process. (A) omlaag gerichte camera visualiseren geïmmobiliseerd goud gecoate glijbaan, (B) ets merktekens op goud gecoate coverslide, (C) het verwijderen van PDMS stempel van zegel nesten armatuur, (D - E) visualiseren PDMS stempel merktekens met opwaarts gerichte camera , (F) het plaatsen van PDMS stempel in alkaanthiol initiatiefnemer bad, (G) drogen alkaanthiol initiator oplosmiddel dan stikstof stromen, en (H) stempelen alkaanthiol gecoate PDMS stempel op goud gecoate coverslide.
Figuur 4. immunostained afbeeldingen van micropatterned Slide. (A) azide en (B) alkyngroepen presenteren gebiotinyleerd met kopervrij en koper gemedieerde click chemie en gedetecteerd met respectievelijk streptavidine-488 en -546. (C) Overlay van beide TL-kanalen. Alle schaalbalken 500 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ideaal substraten voor tissue engineering zou worden bioinspired en daardoor recapituleren de ruimtelijke verdeling van kritische bioactieve liganden gevonden binnen de cellen. Ook zou bezitten dynamiek die tijdelijke aanpassing van de liganden en de ruimtelijke patronen waarin zij worden aangeboden aan gerichte weefsel morfogenese toe en ruimtelijk beperkte inductie van lot van de cel mogelijk maken. Fabricage van dergelijke substraten vereist het immobiliseren van meerdere biochemische signalen in complexe en zeer geordende oriëntatie op substraten. Terwijl alle endogene factoren niche een cel in vitro simuleren onredelijk, de R-μCP systeem beschreven maakt immobilisatie van meerdere gebieden van orthogonale bioactieve soorten verbindingen met microschaal controle ruimtelijke oriëntatie.
Het nut van deze substraten neemt verder toe wanneer men bedenkt dat terwijl PEG borstel arrays gebonden met geïmmobiliseerde ligandenkan biospecifieke interacties uitlokken, ongebonden PEG borstels blijven bestand tegen eiwitadsorptie en kan dus dienen om cel adhesie en migratie te beheersen. Hoewel passieve, micropatterned adsorptie van extracellulaire matrix (ECM) proteïnen of polymeer-PEG conjugaten een eenvoudigere werkwijze voor het besturen celadhesie en migratie, maar deze techniek verschaffen tijdelijke controle omdat adsorptie is een omkeerbaar proces 11. Ook moleculen adsorberen aan oppervlakken in onvoorspelbare richtingen en willekeurig concentraties waardoor de betrouwbaarheid en de controle van biospecifieke interacties te beperken. Bovendien kunnen verbindingen gewoonlijk gebruikt om niet-vervuilende gebieden, zoals runderserumalbumine of Pluronic F127 maken, hebben aangewezen reactieve plaatsen voor verdere functionalisering beperken na adsorptie in situ modificaties bezitten. SAM's van alkaanthiolen gegenereerd kan worden met dergelijke reactieve groepen voor extra modificatie van het oppervlak, maar ook zij hebben een beperkte houdbaarheid in weefselkweek Conditionen door het ontbreken van oxidatieve afscherming geboden door geënte PEG borstels 10,11. Omgekeerd, de fusie van onze R-μCP platforms met PEG-borstel enten en sequentiële nucleofiele substitutie reacties biedt de mogelijkheid om substraten ingenieur met duurzame, microschaal cytophobic gebieden die kunnen worden aangepast a priori of in situ met bio-orthogonale functionaliteiten. Dit zal grotere controle biospecifieke interacties die kunnen reguleren in vitro weefsel morfologie en groei toestaan.
Een sterk punt van R-μCP vergelijking met andere systemen voor het uitlijnen opeenvolgende microcontact drukken is het vermogen om het substraat uit het systeem verwijderen van herhaalde stampen behoud van hoge uitlijnnauwkeurigheid 12,13. Hierdoor kunnen grotere diversiteit in de soorten oppervlakchemie die kunnen worden toegepast, en de duur van oppervlaktemodificatie reacties worden gevarieerd om afstemmen van de dichtheden vervolgens imgemobiliseerd liganden 6. Aldus kunnen R-μCP worden aan contactpunten concentratiegradiënten vestigen in de biochemische signalen die biospecifieke interacties 14 mediëren. Met de capaciteit om zowel de locatie en de biospecifieke interacties nauwkeurig te regelen, de R-μCP systeem een unieke methode voor het onderzoeken van de rol van biologisch actieve liganden in weefsel morfogenese en wordt een robuust systeem voor het kweken substraten presentatie van biologische signalen in simuleren de in vivo niche.
Een cruciaal aspect van cellulaire niches, in het bijzonder binnen de ontwikkeling, is spatiotemporele modulatie van signalering factoren 18. Hoewel oplosbare biochemische signalen kunnen worden toegevoegd aan kweekmedia op een tijdelijk bepaalde wijze is er beperkte ruimtelijke bepalen welke cellen ondervinden deze signalen. Met de R-μCP systeem beschreven, is het mogelijk om micropatterned cultuur substraten met terminaal functionaliz construerened PEG borstels presenteren azide functionele groepen die geen effect heeft op lot van de cel in cultuur. Terwijl azide groepen kunnen ondergaan koper gekatalyseerde "klik" reacties met alkyn presenterende moleculen, kan deze niet worden uitgevoerd in de aanwezigheid van cellen in kweek gezien de toxiciteit van koper. Echter, high-stam moleculen zoals dibenzocyclooctyne (DBCO) ondergaan een zeer selectief en biocompatibele kopervrije azide-alkyne cycloadditiereactie 19,20. Door vervoeging van-DBCO bevattende linkers, kan micropatterned cultuur substraten worden gewijzigd in situ met nieuwe biologische liganden 21. Met de mogelijkheid om cytophobic regio cytofiele maken of voeg verschillende biochemische signalen voor gebruik in multi-step signalering procedures, cultuur substraten gegenereerd met deze methode hebben roman adaptieve mogelijkheden en zo een robuust systeem voor het instrueren van weefsel morfogenese in vitro.
Ondanks de immense pottiële en bruikbaarheid van de R-μCP platform, heeft het enkele nadelen. Doordat veel SI-ATRP stappen PEG-geënte substraten genereren vergroot de fabricage tijd in vergelijking met werkwijzen die inkjetprinters of microdruppels afzetting van ECM eiwitten. Terwijl de nauwkeurigheid van inkjet druktechnieken wedijveren met de huidige R-μCP systeem, de adsorptie van ECM eiwitten omkeerbaar waardoor minder controle cel-eiwit interacties. Ook substraten gegenereerd via inkjet druktechnieken kunnen niet worden verwijderd tijdens de fabricage, waarbij het gebruik van diverse substraat chemische modificatie die toelaten bijvoorbeeld ruimtelijk beperkt situ substraat modificaties 22 belemmeren. Door deze beperkingen inkjet technieken zijn beter geschikt voor het snel genereren van cultuur substraten vooral om korte duur, statische regeling van biomoleculen en celtypes 23 dat de R-μCP systeem veel better geschikt richting genereren veelzijdige substraten op langere termijn, dynamische controle over beide ruimtelijke en temporele cellulaire interacties in 2D met diverse biologische liganden vertonen.
Microcontactprinten maakt snelle afzetting van nano naar microschaal 'ink' beschikt over grote oppervlakken, maar er is altijd aanzienlijke heterogeniteit is in de concentratie van gedeponeerde "inkt" stoffen. Dit is ook een stroombegrenzing van de R-μCP platform zoals kan worden waargenomen in Figuur 4. We veronderstellen dat de heterogeniteit fluorescerende wijziging van de PEG borstels is door toepassing van de robot een oneven normaalkracht over de gehele PDMS stempel, dat is waarschijnlijk ook niet volledig plat. Dit leidt tot niet-gelijkmatige contactdruk tussen alle delen van de stempel en het substraat waardoor wordt veroorzaakt ongelijkmatige afzetting van de alkaanthiol initiator en daaropvolgende dikte van de geënte PEG borstel. InOm PEG-geënte substraten te vervaardigen met zelfs afzetting van alkaanthiolen en daarmee oppervlak functionaliteit, zal het stempelen hulpmiddel ontwerp moeten worden geoptimaliseerd om een gedistribueerd en uniforme normaalkracht van toepassing over de gehele PDMS stempel. Dit zal gelijkmatig contact met het goud gecoate slides over de hele interface van onafhankelijk van stempel onvolkomenheden vergemakkelijken. Ook in figuur 4B, kan lichte kruisbesmetting acetyleen groepen op de azide beëindigd PEG borstel observeren. Terwijl de oppervlaktedichtheid van geïmmobiliseerde liganden door kruisbesmetting minimaal is vergeleken met die van het beoogde PEG-borstel, kan dit worden verlaagd tot bijna nul door het verhogen van de duur van het ethanolamine passivering reactie (zie Paragraaf 6) als eerder 6 aangetoond.
De primaire toepassing van de R-μCP systeem beschreven voor het vervaardigen van complexe weefselkweek substraten die kunnen worden gebruikt om ruimtelijke en temporele controle o uitoefenenf lot van de cel. De hoge precisie en nauwkeurigheid van de R-μCP platform maakt het een aantrekkelijke methode voor andere toepassingen. De mogelijkheid om patroon cytofiele gebieden met differentiële ligand chemistries gevolgd door in situ modificatie van eerder inert, cytophobic regio zorgt voor co-cultuur van meerdere cellijnen met een strakke controle over hun ruimtelijke oriëntatie. Dit in combinatie met de inherente high-throughput aard van micropatterning geven een alternatief voor de huidige methoden voor high-throughput screening van zowel enkelvoudige cellen en meercellige combinaties 24. Terwijl de R-μCP systeem groot potentieel op het gebied van biologie, kan het ook worden toegepast op het gebied van micro-elektromechanische systemen (MEMS). In MEMS fabricage, is het wenselijk MEMS componenten dragen met hoge precisie en nauwkeurigheid voor massaproductie. Met nieuwe kinetische stempelen technieken, kan de R-μCP systeem beschreven worden aangepast om effectief drukken componegen van silicium of gallium nitride op silicium wafers voor gebruik bij het genereren MEMS 25. Zo zou de R-μCP platform gebruikt voor een breed scala van mogelijke toepassingen.
Concluderend, het gebruik van de R-μCP systeem voor het genereren PEG-geënte kweek substraten orthogonaal gefunctionaliseerd sequentiële nucleofiele substitutiereacties geeft niet alleen een ideaal platform voor potentieel besturen weefsel morfologie en groei in vitro, maar een uitstekend systeem voor het onderzoeken van de rol van meervoudige bioactieve liganden op lot van de cel. De mogelijkheid om patroon meerdere biochemische signalen in verschillende en zeer geordende patronen legt de basis voor het bouwen van cultuur substraten in staat is het instrueren van de vorming van weefsel structuren met meerdere celtypen georganiseerd op de micron schaal. Dit, gekoppeld aan het vermogen om micropatterned substraten in situ wijzigen, waardoor ongeëvenaarde controle weefsel morfogenese en cell lot in cultuur. De patroonvormingstechnieken hier beschreven verschaffen een veelzijdig systeem voor het vervaardigen cultuur substraten die een dag kunnen vergemakkelijken rationele en reproduceerbare produktie van organotypische weefselstructuren in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
