Abstract
Gentherapie, gebruikt om functioneel herstel van sensorineurale doofheid te bereiken, belooft beter begrip van de onderliggende moleculaire en genetische mechanismen die bijdragen aan gehoorverlies verlenen. Introductie van vectoren in het binnenoor moet gebeuren op een wijze die algemeen verdeelt middel door de cochlea met minimale schade aan de bestaande structuren. Dit manuscript beschrijft een post-auriculaire chirurgische benadering die kan worden gebruikt voor muizen cochleaire therapie met moleculaire, farmacologische en virale levering aan muizen postnatale dag 10 en ouder via het ronde venster membraan (RWM). Deze chirurgische benadering maakt een snelle en directe levering in de scala tympani terwijl het minimaliseren van bloedverlies en sterfte van dieren te voorkomen. Deze techniek houdt verwaarloosbaar of geen schade aan essentiële structuren van de binnenste en middenoor evenals nekspieren terwijl volledig behoud gehoor. Om de effectiviteit van deze chirurgische techniek, vesiculaire glutam tonenat transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) muizen zullen worden gebruikt als een voorbeeld van een muismodel van doofheid die herstelt horen na aflevering van VGLUT3 het binnenoor via een adeno-geassocieerd virus (AAV-1).
Introduction
Gentherapie is al lang voorgesteld als een potentiële behandeling voor genetische gehoorverlies, maar het succes op dit gebied is ongrijpbaar 1 gebleven. Tot op heden zijn viraal gemedieerde methoden overheerst vanwege de theoretische mogelijkheid om specifieke celtypen te richten binnen de betrekkelijk ontoegankelijke cochlea. Beide adenovirus (AV) en adeno-geassocieerde virus (AAV) zijn gebruikt voor cochleaire genafgifte. AAV's zijn voordelig in het slakkenhuis voor een aantal redenen. Ze zijn replicatie-deficiënte virussen en efficiënt overbrengen transgene moleculen aan verschillende celtypen waaronder neuronen, een belangrijk doelwit voor een aantal oorzaken van gehoorverlies. AAV binnenkomst in de cel wordt gemedieerd door specifieke receptoren 2; Zo mag de keuze van een bepaald serotype verenigbaar met de celtypen worden getransduceerd. AAVs effectief transfecteren haarcellen 3 en integreren in het gastheergenoom, resulteert in stabiele, lange-termijn expressie van het transgenic eiwit en fenotypische verandering in de cel 4. Hoewel niet noodzakelijk voordelig voor korte termijn toepassingen zoals haar-celregeneratie lange termijn expressie is erg belangrijk voor bergingschoot van genetische defecten. Omdat AAVs niet worden geassocieerd met een menselijke ziekte of infectie en tonen geen ototoxiciteit 5,6,7, zijn ze een ideale kandidaat voor gebruik in gentherapie voor erfelijke vormen van gehoorverlies 8.
Overdracht van exogeen genetisch materiaal in de zoogdierbinnenoorsteuncellen behulp van virale vectoren is onderzocht de afgelopen tien jaar en is in opkomst als een veelbelovende techniek voor de behandeling van zowel genetische en verworven vormen van gehoorverlies 9. De cochlea is potentieel een ideaal doelwit voor gentherapie voor verschillende redenen: 1) het kleine volume vereist een beperkte hoeveelheid van het virus nodig is; 2) het relatieve isolement van andere orgaansystemen grenzen bijwerkingen; en 3) de met vloeistof gevulde kamers vergemakkelijken viraleverzending binnen heel het labyrint 10, 11,12,13,14, 15.
Muismodellen van aangeboren doofheid zorgen voor het gebruik van vele methoden van onderzoek te bewaken ontwikkeling van het binnenoor op een systematische, herhaalbare manier. Terwijl de kleine omvang van muis cochleae inhoudt sommige chirurgische moeilijkheid, de muis fungeert als een zeer belangrijk model voor de studie van genetische gehoorverlies, met verschillende experimentele voordelen boven andere soorten 16. Muismodellen voor evaluatie van een reeks kenmerken door middel van genetische linkage analyse, verzamelen van gedetailleerde morfologische waarnemingen, en pathogene's simuleren; als zodanig zijn ze goede kandidaten voor viraal gemedieerde gentherapie. Uitgebreide genetische studies bij muizen combinatie met technologische ontwikkelingen hebben het mogelijk genetisch gemodificeerde muizen gegenereerd op een reproduceerbare wijze in laboratoria 17,18, 19, 20,21. VOORTSe, bestaan er tal van modellen voor zowel verworven en erfelijke gehoorverlies fenotypes bij muizen, waardoor strenge testen in dit diermodel 22, 23,24. Zo, het corrigeren gehoor behulp van viraal gemedieerde gentherapie in een muismodel is een geschikte eerste stap in de zoektocht naar genezing van ziekten bij de mens.
We hebben eerder aangetoond dat transgene muizen die vesiculaire glutamaat transporter 3 (VGLUT3) geboren doof door gebrek aan glutamaat afgifte aan de IHC lint synaps 25. Omdat deze mutatie niet leidt tot een primaire degeneratie van sensorische haarcellen, deze mutante muizen potentieel een uitstekend model waarin cochleaire gentherapie voor aangeboren gehoorverlies testen.
Tot op heden zijn een aantal virale toedieningstechnieken voor cochleaire gentherapie beschreven, waaronder ronde venster membraan diffusie, ronde venster membraan injectie en levering via cochleostomie. Er zijn krachtigeial en nadelen van elk van deze benaderingen 9.
Hier beschrijven we een chirurgische methode voor het viraal gemedieerde gen levering aan de VGLUT3 KO muis binnenoor door het ronde venster membraan (RWM). De post-auriculaire RWM injectie methode is minimaal invasieve met een uitstekend gehoor behoud, en is relatief snel. Zoals wij eerder hebben gepubliceerd, in een poging te herstellen horen in dit muismodel, een AAV1 vector die het gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) werd in de cochlea van deze dove muizen bij postnatale dag 12 (P! @), Waardoor het herstel van het gehoor 26. Hoorzitting in de VGLUT3 KO muizen werd geverifieerd door auditieve hersenstam respons (ABR), terwijl transgene eiwitexpressie werd gecontroleerd met behulp van immunofluorescentie (IF). Deze methode toont hiermee aan dat viraal-gemedieerde gentherapie een genetisch defect dat anders zou resulteert in doofheid kan corrigeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures en dierlijke behandeling nageleefd NIH ethische richtlijnen en goedgekeurd protocol eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië, San Francisco.
1. Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
- Het uitvoeren van chirurgische ingrepen in een schone, gewijd ruimte. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten steriliseren met een glazen kraal sterilisator vóór de ingreep.
OPMERKING: In dit protocol gebruiken postnatale dag 10-12 (P10-12) FVB muizen. Verschillende leeftijden en muizenstammen kunnen worden gebruikt om de behoeften van een specifiek project te voldoen. Muizen ouder dan P40 kan een uitdaging zijn, omdat de bulla bot wordt nog lastiger. - Verdoven de muizen met intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg / kg), xylazine hydrochloride (10 mg / kg) en acepromazine (2 mg / kg). Begin chirurgische voorbereiding pas nadat het dier niet meer reageert op pijnprikkels, zoals teen knijpen. Als necessary toedienen van een booster dosis (een vijfde van de oorspronkelijke dosis) van het verdovingsmiddel cocktail aan het oorspronkelijke verdoving vlak herstellen.
OPMERKING: Wees voorzichtig bij deze stap, omdat het grootste deel van de sterfte op deze leeftijd wordt veroorzaakt door een overdosis verdovingsmiddel. - Bedek de ogen van het dier met een beschermende oogzalf om de ogen vochtig te houden tijdens anesthesie onderdrukken knipperreflex het dier.
- Plaats de muis met uitgebreide hals op een verwarmingselement in de hele procedure totdat de muis is helemaal wakker, tot post-anesthesie onderkoeling te voorkomen.
- Scheer de linker post-auriculaire regio met een tondeuse en desinfecteren met 70% ethanol en povidonjood voordat chirurgische manipulatie.
2. de chirurgische ingreep en Vector Injection
- Gebruik een post-auriculaire benadering van het trommelvlies bulla bloot. Incise het onderhuidse weefsel met kleine schaar om de post-auriculaire spier bloot. Na het terugtrekken van de vetweefsel aan The dorsale zijde van de insnijding, scheid de spieren naar rechts en links loodrecht op de insnijding voor het temporale bot bloot. Zorg ervoor dat deze incisie is lang genoeg om comfortabel met voldoende visualisatie.
- Perforeren de tympanische bulla met een 25 G naald en vergroten het gat zo nodig met een pincet door pellen het bot terug toegang tot het basale begin van het slakkenhuis toe en vervolgens verwijden voldoende om de stapediale slagader en het ronde venster membraan te visualiseren (RWM) .
- Prik de RWM zachtjes in het centrum met een borosilicaat capillaire pipet. Observeren vloeistof uitstroom door de RWM op dit punt; dit is normaal. Wacht tot de uitstroom is gestabiliseerd (de uitgevloeid vloeistof uit het slakkenhuis wordt gedroogd met een steriele filter papier).
LET OP: Wees voorzichtig bij het vasthouden en het bevorderen van de glazen naald zodat de RWM perforatie is zo klein mogelijk. Afhankelijk van de microscoop gebruikt, houdt u de pipetten met een micromanipulator of met de hand met behulp van een pipethouder. - Bereid de pipetten voor injectie met een pipet trekker op dezelfde manier patchklem pipetten worden bereid. Zorg ervoor dat de tip diameter is groot (ongeveer 15 micrometer in diameter), zodat pipetteren het virus in en uit is eenvoudig te doen.
- Opstellen 1-2 pi AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP of AAV2-GFP in een injectie pipet. Nadat de efflux gestabiliseerd (5 tot 10 min), microinject deze vast volume in de scala tympani door hetzelfde gat eerder in RWM.
- Snel sluiten RW niche na het uittrekken van de pipet met een kleine stekker van de spieren en zet hem vast met een kleine druppel weefsel lijm geplaatst op de spier om lekkage van de ronde venster te vermijden.
OPMERKING: Sluit dit gat heel goed na de naald wordt verwijderd met een kleine stekker van de spier aan een perilymfe lekkage van de cochlea-deze stap te voorkomen is het van cruciaal belang om gehoor te beschermen. Mislukking te verzegelen volledig de RWM zal resulteren in gehoorverlies in de tijd. - Na injectie, hebben betrekking op degat in de auditieve bulla met vetweefsel, de terugkeer van de post-auriculaire spieren en vetweefsel in de normale stand en hechten van de wond in lagen met een 6-0 of kleiner absorbeerbare chroomzuur hechtdraad.
- Ontsmet de wond met povidonjood.
3. postoperatieve zorg
- Plaats muizen in een warme kooi en laat ze niet onbeheerd achter tot ze volledig hersteld verplaats ze dan terug met de moeder. Het wordt aanbevolen om de man uit de kooi te verwijderen alvorens de pups terug met de moeder.
- Onderhuids Carprofen (2 mg / kg) voor postoperatief analgesie en elke 24 uur daarna gedurende 3 dagen, ontsteking en pijn te verminderen. Dagelijks toezicht op de dieren tekenen van angst, abnormaal gewichtsverlies, pijn of infectie. Algemeen door de 3 dagen na de operatie alle muizen normaliter handelen. Als enige tekenen van nood of ziekte verschijnen in een muis na de 3 e dag, overwegen euthanizing tHij muis als per institutionele richtlijnen.
4. Beoordeling van Cochlear Functie Na Viral Bezorging Met behulp van BAER-test (ABR) Recordings
OPMERKING: De auditieve hersenstam respons (ABR) is een auditieve evoked potential onttrokken lopende elektrische activiteit in de hersenen en opgenomen via elektroden onder de hoofdhuid geplaatst. Het dier wordt gestimuleerd met geluid. De resulterende opname bestaat uit vijf golven die de elektrische activiteit van opeenvolgende punten in de gehoorbaan in de eerste 10 msec na het begin van een auditieve stimulus geven.
- Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine hydrochloride en xylazinehydrochloride zoals beschreven in paragraaf 1.2 van dit protocol, maar dan zonder acepromazine.
- Plaats de muis op een verwarming pad gedurende de gehoortest totdat de muis is helemaal wakker, tot post-anesthesie onderkoeling te voorkomen.
OPMERKING: Gebruikde volgende geluid stimuli in dit experiment: klik (5 msec duur; 31 Hz presentatie tarief). - Plaats subdermale naald elektroden bij de top onder de oorschelp van het linkeroor (referentie), en onder het contralaterale oor (grond) en gestart ABRs zoals eerder beschreven in een geluiddichte kamer 27,28. Record ABR golfvormen in 5 dB geluidsdruk intervallen af van de maximale amplitude.
- Bepaal ABR drempels na de operatie zo vroeg als 4 dagen na virale aflevering
Opmerking drempel wordt gedefinieerd als de laagste stimulus niveau waarop respons pieken golven I-V waren duidelijk en herhaaldelijk aanwezig visuele inspectie. - Meet zwaai ik naar de activiteit te analyseren vanuit de cochleaire zenuw. De laagste prikkelniveau dat een detecteerbaar ABR golfvorm oplevert wordt gedefinieerd als de drempelwaarde.
5. Cochlear Transgene Protein Expression Met behulp van immunofluorescentie
- Verdoven muizen door een overdosis van intraperitoneal injectie van een mengsel van ketamine hydrochloride en xylazinehydrochloride zoals beschreven in paragraaf 1.2 van dit protocol, maar dan zonder acepromazine.
- Onthoofden het hoofd pas nadat het dier niet meer reageert op pijnprikkels, zoals teen knijpen.
- Ontleden de cochleae uit en het proces voor de hele-mount immunofluorescentie zoals beschreven 26. Een gedetailleerd protocol van cochleaire whole-mount immunofluorescentie met behulp van anti-VGLUT3 en anti-myosine 7a antilichamen wordt beschreven in Akil et al., 2013 29.
- Voor GFP labeling, incubeer de cochleaire hele mounts nacht bij 4 ° C met een konijn anti-GFP antilichaam bij 1: 250 verdunning.
- Tweemaal Spoel de cochleae gedurende 10 min met PBS en vervolgens geïncubeerd gedurende 2 uur bij geiten anti-konijn IgG geconjugeerd met Cy2 verdund 1: 4000 in PBS.
- Spoel de cochleae met PBS tweemaal gedurende 10 minuten en incubeer ze met DAPI gedurende 15 min.
- Monteer de cochleae op glasplaatjes en observeren under een microscoop met confocale immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de technische kenmerken en het nut van de post-auriculaire benadering voor cochleaire moleculaire therapie te controleren werden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP en AAV2-GFP in P10-12 muizen binnenoor geleverd via de RWM. Deze benadering houdt echter succesvol transgenexpressie binnen binnenste haarcellen (IHC) (VGLUT3 Figuur 1 en Figuur 2 GFP en GFP figuur 3A), buitenste haarcellen (OHC) (GFP figuur 2) en steuncellen (GFP Figuur 2 en Figuur 3A) 26 zonder significante orgaan van Corti letsel. De waarneming van de verschillende celtypen die GFP waargenomen in de cochleaire geheel gemonteerde immunofluorescentie beelden (Figuur 2 en Figuur 3A) toont dat de keuze van AAV serotype verenigbaar met de celtypen worden getransduceerd zijn. Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3A 26 tonen zeer goede transfection zowel iHCS en OHCS, alsmede de verdeling van het transgen eiwit (GFP / VGLUT3) gedurende de cochlea na AAV1 of AAV2-GFP of AAV1-VGLUT3 transfectie. De verdeling van iHCS expressie VGLUT3 na AAV1-VGLUT3 transfectie (figuur 3B) 26 stelt transfectie via de RWM effectiever en uniform door de gehele cochlea dan andere methoden die dichter bij de plaats van virale levering gemeld hogere transfectie tarieven. We hebben gevonden dat transfectie tarieven efficiënter door het volume van het virus geïnjecteerd in het binnenoor (figuur 1) 26 kunnen worden gemaakt.
Onze waarneming van succesvolle VGLUT3 meningsuiting in VGLUT3 KO muis iHCS zonder cochleair schade leidde ons om te testen het horen door het meten van ABR in de geredde KO muizen. Figuur 4A en 4B 26 document van het vermogen van de post-auriculaire RWM levering van AAV1-VGLUT3 in de innerlijke ear van de VGLUT3 KO muizen te produceren horen redding in dit muismodel van aangeboren gehoorverlies. Auditieve hersenstam respons (ABR) sporen werden hersteld in de VGLUT3 geredde KO (figuur 4A) en de ABR drempelwaarden waren meetbaar en vergelijkbaar met die waargenomen in wild-type muizen (Figuur 4B).
Figuur 1:. VGLUT3 IHC transfectie na RWM virale levering aan P10-P12 KO muizen De getransfecteerde cochleae werden op P30 onderzocht door immunofluorescentie met behulp van anti-Myo7a antilichaam, een haar-cel marker, en een antilichaam tegen VGLUT3. Myo7a en VGLUT3 werden uitgedrukt in alle iHCS alleen in de WT, terwijl iHCS van KO muizen uitgedrukt alleen Myo7a. De geredde muis cochleae toonde enkele iHCS uiten VGLUT3, en al iHCS uitgedrukt Myo7a (rij 3) IHC:. Binnenste haarcellen. Herdruk met toestemming van26. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Muis cochleair whole-mount immunofluorescentie na RWM AAV2-GFP levering aan wildtype P10-P12 muizen AAV2-GFP werd gebruikt om virale aflevering beoordelen met de post-auriculaire benadering van de muis slakkenhuis.. AAV2-GFP aflevering werd gedaan op P10-12 en transgene GFP-expressie werd in het slakkenhuis onderzocht op P21 met behulp van een anti-GFP antilichaam. GFP expressie (groen) in WT muizen cochleair hele-mount tonen sterker GFP expressie in de buitenste haarcellen (OHC) dan binnenste haarcellen (IHC).
Figuur 3: Muis coc hlear whole-mount immunofluorescentie na RWM AAV1-GFP levering aan wildtype P10-P12 muizen. Na AAV1-GFP levering aan de cochlea expressie van GFP wordt gezien binnenste haarcellen (IHC) en steuncellen (A), maar niet OHCS , terwijl AAV1-VGLUT3 levering aan het slakkenhuis van de VGLUT3 KO muizen (B) resulteerde in VGLUT3 expressie alleen in iHCS. Het aantal iHCS expressie VGLUT3 in de VGLUT3 KO muizen cochlea na AAV1-VGLUT3 levering is afhankelijk van de hoeveelheid virus afgegeven aan het binnenoor; bijvoorbeeld, 40% van iHCS VGLUT3 uitgedrukt als 0,6 ul van het virus werd geïnjecteerd, terwijl 100% van iHCS uitgedrukt VGLUT3 na 1 ul van het virus werd geleverd. Er was geen verschil in VGLUT3 expressie tussen de apex, mid-turn, of basis toen 0,6 ul van het virus werd geïnjecteerd. Herdruk met toestemming van 26.
g "/>
. Figuur 4: BAER-test (ABR) evaluatie Vertegenwoordiger ABR golfvormen na AAV1-VGLUT3 levering waren vergelijkbaar tussen gered en wild-type muizen; Daarentegen werden geen ABR golfvormen gezien KO muizen (A). Gered KO muizen bleek ook meetbare ABR drempels. Deze ABR drempels waren vergelijkbaar met die bij WT muizen voor alle frequenties gemeten (B). Ik:. ABR wave I. Herdruk met toestemming van 26 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk hebben we in detail een techniek die kan worden gebruikt voor cochleaire gentherapie met als doel het herstellen of reddings- normale gehoorfunctie die gecompromitteerd door een genetisch defect. Aangezien het typisch atraumatische, deze benadering is veilig voor cochleaire gentransfer of andere potentiële moleculaire therapieën 30. Andere benaderingen voor cochleaire therapie zijn beschreven, waaronder een ventrale benadering 24, cochleostomie 31,32 en endolymfatische zak aflevering 33 in de muis en cavia. In onze ervaring, de post-auriculaire benadering is sneller, eenvoudiger, en geassocieerd met een verminderde letsel en sterfte van dieren. Verder, de post-auriculaire benadering biedt een verbeterde visualisatie van de RWM met minder kans op trauma en bijbehorende gehoorverlies 34,35,36. Dit rapport beschrijft de technische aspecten en het nut van de post-auriculaire benadering voor cochleaire moleculaire therapie door aan te tonen levering van AAV1-VGLUT3 in the binnenoor via het RWM, waardoor transgene expressie van zowel VGLUT3 en GFP (Figuur 1 en Figuur 2 en Figuur 3A) en horen redden in dit muismodel van aangeboren gehoorverlies. Voorafgaande studies beschrijven van methoden voor genlevering toonde slechts beperkte transgene expressie in kritieke gebieden van het orgaan van Corti 12,37,38,39,40,41. Deze verschillen kunnen het gevolg zijn van de kwaliteit van het viruspreparaat, de titer van de virale vector, serotype gebruikt, of simpelweg onvoldoende virale plaatsing in de cochlea. In tegenstelling met deze post-auriculaire benadering konden we zeer goede transfectie koers die zowel binnenste en buitenste haarcellen en distributie van een reportergen (GFP) na AAV2-GFP transfectie (Figuur 2 en Figuur 3A) gedurende de cochlea. Gebaseerd op het percentage van iHCS getransfecteerd met AAV1-VGLUT3 (figuur 3B), stellen we voor dat transfectie via RWM is meer effecterende en uniform door de gehele cochlea dan andere methoden, zoals die beschreven in de cavia, die hogere transfectie aanbiedingen in de basale beurt dicht bij de plaats van virale aanvraag 42 gemeld. De lange-termijn expressie van het GFP / VGLUT3 in de cochlea, ten minste een jaar en een half, is consistent met gegevens van andere diermodellen en verschillende orgaansystemen 38,43.
Bovendien histologische analyse van de getransfecteerde cochlea toonden geen bewijs van een ontstekingsreactie, met Behoud van de cytoarchitecture van het orgaan van Corti, waaronder de stria vascularis en spiraal ganglion neuronen 26. Verder, in tegenstelling tot methoden die een cochleostomie toegepast, de RWM transfectie die in de onderhavige studie niet veroorzaakt cochleaire schade en hogere kan worden geïnjecteerd 31,32. Gebrek aan trauma deze techniek werd geverifieerd door demonstreren gelijkwaardige ABR threshoLDS tussen bediend en controle oren, een vinden vergelijkbaar met dat van Xia et al. 4 tenslotte AAV-VGLUT3 deze via het RWM geleid ABR drempelwaarden vergelijkbaar met die in WT-muizen (Figuur 4A en Figuur 4B) 26. Wij hebben deze techniek gebruikt bij alle leeftijden van muizen, maar het is technisch uitdagend muizen ouder dan P40, omdat de bulla bot wordt moeilijker te perforeren en het gebroken bot van de bulla scherper bij oudere dan bij jongere muizen. Op oudere leeftijd, kan als voorzichtigheid is niet genomen bloeden optreden als een stuk van de bulla bot rijt de nek weefsels.
Tot slot, dit rapport documenteert succesvolle genoverdracht in verschillende types van cochleaire cellen in de muis met behulp van een AAV gebaseerde vector zoals eerder werd getoond. Deze techniek van de genafgifte minimaliseert trauma, niet tot gehoorverlies en kan tot wijdverspreide transfectie van verschillende celtypes in de cochlea, IncLuding haarcellen en spiraal ganglion neuronen. Het heeft een groot potentieel, voor andere soorten van aangeboren en verworven vormen van gehoorverlies, en ook kan worden toegepast op een verscheidenheid van moleculaire therapieën in muismodellen van gehoorverlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
