Abstract
A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).
Introduction
A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita 1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um certo número de causas de perda de audição. Entrada de AAV na célula é mediada por receptores específicos 2; assim, a escolha de um serotipo particular, deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. AAV pode eficazmente transfectar células ciliadas 3 e incorporar no genoma hospedeiro, resultando em estabilidade, expressão de longo prazo do traproteína nsgenic e mudança fenotípica na célula 4. Embora não seja necessariamente vantajoso para as aplicações de curto prazo, tais como a regeneração de células de cabelo, expressão de longo prazo é muito importante para o salvamento estável de defeitos genéticos. Porque os AAV não estão associados com qualquer doença humana ou infecção e não demonstram 5,6,7 ototoxicidade, que é um candidato ideal para utilização na terapia de gene para formas herdadas de perda auditiva 8.
Transferência de material genético exógeno para o ouvido interno de mamíferos utilizando vetores virais tem sido estudada ao longo da última década e está emergindo como uma técnica promissora para o tratamento de ambas as formas genéticas e adquiridas de perda auditiva 9. A cóclea é potencialmente um alvo ideal para terapia génica, por várias razões: 1) o seu volume pequeno necessita de uma quantidade limitada do vírus necessária; 2) seu relativo isolamento de outros efeitos limites de sistemas de órgãos secundários; e 3) suas câmaras cheias de líquido facilitar viralentrega ao longo do labirinto 10, 11,12,13,14, 15.
Modelos de ratos com surdez congênita permitir o uso de vários métodos de estudo para monitorar o desenvolvimento do ouvido interno de uma forma sistemática, replicável. Enquanto o pequeno tamanho do rato cochleae não apresenta alguma dificuldade cirúrgica, o mouse funciona como um modelo extremamente importante no estudo de surdez genética, com várias vantagens em relação a outras espécies experimentais 16. Modelos de ratos permitir a avaliação de um conjunto de características por meio de análise de ligação genética, a coleta de observações morfológicas detalhadas, e simulação de cenários patogénicos; como tal, eles são bons candidatos para a terapia génica mediada por vírus. Estudos genéticos extensas em ratos, combinados com os avanços tecnológicos tornaram possível gerar camundongos geneticamente modificados de forma reproduzíveis em laboratório 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existem inúmeros modelos para ambas adquiridas e herdou auditivos fenótipos perda em ratos, permitindo testes rigorosos neste modelo animal 22, 23,24. Assim, corrigindo audiência usando terapia genética mediada por vírus em um modelo de rato é um primeiro passo adequado na busca de uma cura para a doença humana.
Nós já mostraram que camundongos transgênicos que faltam glutamato vesicular transporter 3 (VGLUT3) nascem surdos devido à falta de liberação de glutamato na fita sinapse IHC 25. Porque esta mutação não leva a uma degeneração primária das células sensoriais ciliadas, estes ratinhos mutantes são potencialmente um excelente modelo em que para testar a terapia genética coclear para a perda auditiva congênita.
Até à data, foram descritos um número de técnicas de entrega virais para terapia genética coclear, incluindo membrana da janela redonda difusão, injecção membrana da janela redonda, e entrega através de um cocleostomias. Existem potenteial vantagens e desvantagens de cada uma destas abordagens 9.
Aqui nós relatamos um método cirúrgico para entrega gene viral mediada para o ouvido interno VGLUT3 KO rato através da membrana da janela redonda (VM). O método de injeção RWM pós-auricular é minimamente invasivo, com excelente preservação auditiva, e é relativamente rápido. Como já publicado anteriormente, num esforço para restaurar a audição neste modelo de ratinho, um vector que transporta o gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) foi introduzido na cóclea destes ratinhos surdos, dia pós-natal 12 (P! @), Resultando em a restauração da audição 26. Ouvindo nos ratos VGLUT3 KO foi verificada por audiometria de tronco encefálico (ABR), enquanto que a expressão da proteína transgene foi verificada através de imunofluorescência (IF). Esta metodologia demonstra, portanto, que a terapia génica mediada por vírus pode corrigir um defeito genético que de outra forma seria resulta em surdez.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco.
1. Preparar o animal para a cirurgia
- Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia.
NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós-natal (10-12 P10-12) camundongos FVB. Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usados para atender às necessidades de um projeto específico. Ratos com idade superior a P40 pode ser um desafio, porque o osso bolha fica mais difícil. - Anestesiar os ratos com injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg), hidrocloreto de xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Comece a preparação cirúrgica só depois que o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. Se necessary, administrar uma dose de reforço (um quinto da dose original) do cocktail de anestésico para restaurar o plano anestésico originais.
Nota: Tenha cuidado nesta etapa porque a maioria da mortalidade observada nesta idade é causada por overdose de anestésico. - Cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica de proteção para manter os olhos úmidos durante a anestesia, suprimindo piscar reflexo do animal.
- Posicione o mouse com o pescoço estendido sobre uma almofada de aquecimento durante todo o processo até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia.
- Raspar a região pós-auricular esquerdo com um clipper e desinfectar com álcool 70% e iodopovidona antes de manipulação cirúrgica.
2. O procedimento cirúrgico e Vector Injection
- Use uma abordagem pós-auricular para expor a bula timpânica. Inciso a tecido subcutâneo com uma tesoura pequena para expor o músculo pós-auricular. Depois de recolher o tecido adiposo para poe lado posterior da incisão, para separar os músculos do lado direito e esquerdo perpendicularmente à incisão para expor o osso temporal. Certifique-se de que esta incisão é tempo suficiente para trabalhar confortavelmente com visualização adequada.
- Perfurar a bula timpânica com uma agulha de 25 G e expandir o buraco, se necessário com uma pinça por descascar o osso de volta para permitir o acesso ao giro basal da cóclea, e, em seguida, ampliar o suficiente para visualizar a artéria estapediana ea membrana da janela redonda (VM) .
- Perfurar o VM suavemente no centro com uma pipeta de borosilicato capilar. Observe efluxo fluido através da VM neste ponto; isso é normal. Aguarde até que o efluxo estabilizou (o fluido effluxed da cóclea é seca com um papel de filtro estéril).
NOTA: Tome cuidado ao segurar e fazer avançar a agulha de vidro para que a perfuração RWM é tão pequeno quanto possível. Dependendo do microscópio utilizado, segurar as pipetas utilizando um micromanipulador ou à mão, utilizando uma pipetatitular. - Prepare as pipetas para injecção utilizando uma pipeta extrator da mesma forma que as pipetas de fixação de membranas são preparadas. Certifique-se de que o diâmetro da ponta é grande (cerca de 15 m de diâmetro), de modo que a pipetagem do vírus dentro e para fora é feito facilmente.
- Elaborar 1-2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP em uma pipeta de injeção. Depois do efluxo é estabilizada (5 a 10 min), microinject este volume fixo na rampa timpânica através do mesmo orifício feito previamente RWM.
- Selar o nicho RW rapidamente depois de retirar a pipeta com uma pequena porção de músculo e fixe-o com uma pequena gota de cola de tecido colocado no músculo para evitar fugas da janela redonda.
NOTA: Selar este furo muito bem após a agulha é removida com uma pequena camada de músculo para impedir qualquer fuga de perilinfa a cóclea-este passo é crítico para preservar audição. Falha para selar completamente o VM irá resultar em perda de audição ao longo do tempo. - Após a injeção, cobrir oburaco na bula auditivo com o tecido adiposo, os músculos retornar pós-auricular e tecido adiposo para a sua posição normal e suturar a ferida em camadas com uma sutura absorvível 6-0 crómico ou menor.
- Desinfectar a ferida com iodopovidona.
3. Cuidados Pós-Operatórios
- Coloque os ratos em uma gaiola quente e não deixá-los abandonados até que sejam totalmente recuperado depois movê-los de volta com a mãe. Recomenda-se a remover o macho da gaiola antes de colocar os filhotes de volta com a mãe.
- Administrar Carprofeno subcutânea (2 mg / kg) para analgesia pós-operatória e a cada 24 horas depois durante 3 dias, para gerir a inflamação e dor. Monitorar os animais diariamente para sinais de sofrimento, perda de peso anormal, dor ou infecção. Geralmente pelo 3º dia após a cirurgia todos os ratos devem estar agindo normalmente. Se quaisquer sinais de angústia ou doença aparecer em um rato após o 3º dia, considerar a eutanásia de tele rato conforme diretrizes institucionais.
4. Avaliação da função coclear Após Parto Viral Usando Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) Recordings
NOTA: O tronco encefálico (ABR) é um potencial auditivo extraído da atividade elétrica em curso no cérebro e gravado através de eletrodos colocados sob o couro cabeludo evocado. O animal é estimulado com som. A gravação resultante consiste de cinco ondas que reflectem a actividade eléctrica dos pontos sucessivos da via auditiva nos primeiros 10 ms após o início do estímulo auditivo.
- Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina.
- Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento durante todo o teste de audição até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia.
NOTA: Useos seguintes estímulos sonoros nesta experiência: clique (5 ms de duração, 31 de taxa de apresentação Hz). - Coloque eletrodos de agulha subdérmicos no vértice, abaixo do pavilhão auricular esquerdo (de referência), e abaixo da orelha contralateral (terra) e começar a gravação ABRs como descrito anteriormente em uma câmara à prova de som 27,28. Grave ondas ABR em 5 intervalos de nível de pressão sonora dB para baixo de amplitude máxima.
- Determinar os limiares ABR postoperatively logo aos quatro dias após o parto viral
NOTA: Threshold é definido como o nível mais baixo de estímulo no qual a resposta picos de ondas I-V foram claramente e repetidamente presente na inspeção visual. - Medida da onda I analisar a atividade do nervo coclear. O nível mais baixo estímulo que produz uma forma de onda ABR detectável é definido como o limiar.
5. Coclear Transgene Expression Protein, através de imunofluorescência
- Anestesiar ratos com uma sobredosagem de intraperitoneal injeção de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina.
- Decapitar a cabeça somente após o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada.
- Dissecar o cochleae fora e processo para imunofluorescência todo o monte, como descrito 26. Um protocolo detalhado do conjunto de montagem coclear imunofluorescência utilizando anticorpos anti-VGLUT3 7a e anticorpos anti-miosina é descrito em Akil et al., 2013 29.
- Para a etiquetagem de GFP, incubar as cocleares inteiras montagens durante a noite a 4 ° C com um anticorpo de coelho anti-GFP em 1: 250 de diluição.
- Lavar as cócleas duas vezes durante 10 min com PBS e depois incubar durante 2 horas em IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy2 diluído 1: 4000 em PBS.
- Lavar as cócleas com PBS duas vezes durante 10 minutos e incubar com DAPI durante 15 min.
- Monte o cochleae em lâminas de vidro e observar under um microscópio com imunofluorescência confocal.
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Representative Results
Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP Figura 2 e Figura 3A) 26 sem órgão significativa de prejuízo Corti. A observação de diferentes tipos de células que expressam GFP visto nas imagens de imunofluorescência cocleares inteiras de montagem (Figura 2 e Figura 3A) demonstra que a escolha do serotipo do AAV deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. Figura 1, Figura 2 e Figura 3A 26 mostram muito bom transfection em ambos os IHCS e CCEs, bem como a distribuição da proteína do transgene (GFP / VGLUT3) ao longo da cóclea após AAV1-GFP ou AAV2 ou AAV1-VGLUT3 transfecção. A distribuição de IHCS expressando VGLUT3 após AAV1-VGLUT3 transfecção (Figura 3B) 26 sugere que a transfecção via RWM é mais eficaz e uniforme através de toda a cóclea do que outros métodos que têm relatado taxas de transfecção superior mais perto do local de entrega viral. Verificou-se que as taxas de transfecção pode ser feito mais eficiente, aumentando o volume do vírus injectado no ouvido interno (Figura 1) 26.
Nossa observação de expressão VGLUT3 sucesso em VGLUT3 KO rato IHCS com nenhum dano coclear nos levou a testar ouvir medindo ABRs nos camundongos KO resgatados. Figura 4A e 4B 26 documento a capacidade de entrega RWM pós-auricular de AAV1-VGLUT3 no e interiorar dos ratos VGLUT3 KO para produzir resgate ouvir neste modelo de ratinho de perda auditiva congênita. Audiometria de tronco encefálico (ABR) vestígios foram restaurados no VGLUT3 resgatado KO (Figura 4A), e os limiares ABR eram mensuráveis e comparáveis aos observados em camundongos selvagens (Figura 4B).
Figura 1:. VGLUT3 IHC transfecção após a entrega viral RWM para P10-P12 KO O cochleae transfectadas foram examinados no P30 por imunofluorescência utilizando anticorpos anti-MYO7A, um marcador de células de cabelo, e um anticorpo contra VGLUT3. MYO7A e VGLUT3 foram expressos em todos os IHCS apenas no WT, enquanto IHCS de camundongos KO expresso apenas MYO7A. O cochleae resgatado rato mostrou alguns IHCS expressam VGLUT3, e todos os IHCS expressa MYO7A (linha 3) IHC:. Células ciliadas internas. Reimpressão com permissão de26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rato coclear todo o monte de imunofluorescência após o parto RWM AAV2-GFP para camundongos selvagens P10-P12 AAV2-GFP foi usado para avaliar a entrega viral utilizando a abordagem pós-auricular para a cóclea mouse.. Entrega AAV2-GFP foi feito em P10-12 e expressão da GFP transgénico foi examinada na cóclea em P21 utilizando um anticorpo anti-GFP. Expressão GFP (green) em camundongos WT coclear todo-mount mostrar mais forte expressão da GFP em células ciliadas externas (CCE) do que as células ciliadas internas (CCI).
Figura 3: Rato coc hlear imunofluorescência conjunto de montagem após a entrega RWM AAV1-GFP para ratinhos de tipo selvagem P10-P12. Após a entrega AAV1-GFP para a expressão de GFP cóclea é visto em células ciliadas internas (IHC) e células de suporte (A), mas não CCEs , ao passo que a entrega AAV1-VGLUT3 para a cóclea do VGLUT3 KO ratinhos (B) resultou na expressão VGLUT3 apenas em IHCS. O número de IHCS expressando VGLUT3 nos ratinhos KO cóclea VGLUT3 após o parto AAV1-VGLUT3 depende da quantidade de vírus entregue ao ouvido interno; por exemplo, 40% de IHCS quando expressa VGLUT3 0,6 ul do vírus foi injectada, ao passo que 100% dos IHCS expressa VGLUT3 após 1 ul do vírus foi entregue. Não houve diferença na expressão de VGLUT3 entre o vértice, meados de mudança de direcção ou de base quando 0,6 ul de vírus foi injectado. Reimpressão com permissão de 26.
g "/>
. Figura 4: Audiometria de tronco encefálico (ABR) avaliação de formas de onda ABR representativos após o parto AAV1-VGLUT3 foram semelhantes entre os camundongos resgatados e do tipo selvagem; em contraste, não há formas de onda ABR foram observadas nos ratinhos KO (A). KO resgatados também mostrou limiares ABR mensuráveis. Estes limiares ABR foram comparáveis aos observados nos ratinhos WT para todas as frequências de medição (B). I:. ABR onda I. Reprint com a permissão de 26 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais 30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral 24, cocleostomias 31,32 e saco endolinfático entrega 33 em rato e cobaia. Na nossa experiência, a abordagem pós-auricular é mais rápido, mais simples e associada com lesão reduzida e mortalidade dos animais. Além disso, a abordagem pós-auricular oferece melhor visualização do VM com menos chance de trauma e perda associada de ouvir 34,35,36. Este relatório documenta os aspectos técnicos e de utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, demonstrando entrega de AAV1-VGLUT3 em the ouvido interno via o VM, resultando em expressão transgênica de ambos VGLUT3 e GFP (Figura 1 e Figura 2 e Figura 3A) e salvamento de ouvir neste modelo de ratinho de perda auditiva congênita. Estudos anteriores que descrevem métodos para entrega gene mostrou apenas expressão transgênica limitada em áreas críticas do órgão de Corti 12,37,38,39,40,41. Estas diferenças podem ser devidas à qualidade da preparação virai, o título do vector viral, o serotipo utilizado, ou simplesmente entrega viral insuficiente para dentro da cóclea. Em contraste, usando esta abordagem pós-auricular, que foram capazes de obter muito boas taxas de transfecção para ambas as células ciliadas externas e internas e distribuição de um gene repórter (GFP) após transfecção AAV2-GFP (Figura 2 e Figura 3A) em toda a cóclea. Com base na percentagem de IHCS transfectadas com AAV1-VGLUT3 (Figura 3B), que sugerem que a transfecção através de VM é mais efcaz e uniforme através de toda a cóclea do que outros métodos, incluindo a descrita na cobaia, que relatou as taxas mais elevadas de transfecção, no giro basal, próximo ao local de aplicação viral 42. A expressão de longo prazo da GFP / VGLUT3 dentro da cóclea, durante pelo menos um ano e meio, é consistente com os dados obtidos a partir de outros modelos animais e diferentes sistemas de órgãos 38,43.
Além disso, a análise histológica da cóclea transf não demonstraram evidência de uma resposta inflamatória, com excelente preservação da citoarquitetura do órgão de Corti, incluindo a estria vascular e neurônios do gânglio espiral 26. Além disso, em contraste com os métodos que utilizaram um cocleostomias, a transfecção RWM utilizado no presente estudo não causar danos na cóclea, e maiores volumes podem ser injectados 31,32. Falta de trauma usando esta técnica foi verificada por demonstrando thresho ABR equivalentelds entre as orelhas operadas e controle, um achado semelhante ao observado por Xia et al. 4 Finalmente, a entrega AAV-VGLUT3 através da VM resultou em ABR limiares comparáveis aos observados em camundongos WT (Figura 4A e 4B) 26. Temos usado essa técnica em todas as idades de camundongos, mas é tecnicamente desafiador em camundongos com idade superior a P40 porque o osso bolha se torna mais difícil para perfurar e o osso quebrado da bula é mais acentuada em mais velho do que nos ratos mais jovens. Em idades mais avançadas, o sangramento se precaução não é tomada pode ocorrer se um pedaço do osso bula dilacera os tecidos do pescoço.
Em conclusão, este relatório documenta a transferência de genes de sucesso em vários tipos de células da cóclea do rato usando um vector à base de AAV como foi mostrado anteriormente. Esta técnica de entrega de genes minimiza o trauma, não conduz a perda de audição, e pode resultar em transfecção de uma ampla variedade de tipos de células no interior da cóclea, including células ciliadas e neurônios do gânglio espiral. Ela tem um grande potencial de aplicação para outros tipos de formas congênitas e adquiridas de perda auditiva, e também pode ser aplicada a uma variedade de terapias moleculares em modelos de ratos de perda auditiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
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