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Neuroscience

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187

Abstract

La terapia génica, que se utiliza para lograr la recuperación funcional de la sordera neurosensorial, se compromete a conceder una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos subyacentes que contribuyen a la pérdida de la audición. Introducción de vectores en el oído interno debe hacerse de una manera que distribuye ampliamente el agente a lo largo de la cóclea al tiempo que minimiza la lesión a las estructuras existentes. Este manuscrito describe un enfoque quirúrgico post-auricular que se puede utilizar para la terapia coclear ratón usando molecular, farmacológica, y la entrega viral a ratones día postnatal 10 y mayores a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). Este abordaje quirúrgico permite una entrega rápida y directa en la rampa timpánica y reducir al mínimo la pérdida de sangre y evitar la mortalidad de los animales. Esta técnica implica un daño insignificante o no a las estructuras esenciales del oído medio e interno, así como los músculos del cuello, mientras su totalidad preservar la audición. Para demostrar la eficacia de esta técnica quirúrgica, el glutam vesicularcomió transportador 3 knockout (KO VGLUT3) los ratones se utilizará como un ejemplo de un modelo de ratón de la sordera congénita que recupera la audición después de la entrega de VGLUT3 al oído interno utilizando un virus adeno-asociado (AAV-1).

Introduction

La terapia génica durante mucho tiempo ha sido sugerido como un posible tratamiento para la pérdida auditiva genética, pero el éxito en esta área ha sido difícil de alcanzar 1. Hasta la fecha, las metodologías mediadas por virus han predominado por la capacidad teórica para dirigirse a tipos específicos de células dentro de la cóclea relativamente inaccesible. Ambos adenovirus (AV) y el virus adeno-asociado (AAV) se han utilizado para la entrega de genes coclear. AAV son ventajosos en la cóclea por un número de razones. Ellos son virus deficientes en la replicación y pueden transferir de manera eficiente moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluyendo neuronas, un objetivo importante para un número de causas de la pérdida de audición. Entrada AAV en la célula está mediada por receptores específicos 2; Por lo tanto, la elección de un serotipo particular, debe ser compatible con los tipos de células a ser transducidas. AAV puede transfectar eficazmente células ciliadas 3 e incorporar en el genoma del huésped, lo que resulta en una expresión estable y a largo plazo de la traproteína nsgenic y cambio fenotípico en la celda 4. Aunque no necesariamente ventajoso para aplicaciones de corto plazo, tales como la regeneración de células de pelo, expresión a largo plazo es muy importante para el rescate estable de defectos genéticos. Debido AAV no están asociados con ninguna enfermedad humana o infección y demuestran no ototoxicidad 5,6,7, son un candidato ideal para su uso en la terapia génica para formas heredadas de la pérdida de audición 8.

Transferencia de material genético exógeno en el oído interno de los mamíferos utilizando vectores virales se ha estudiado en la última década y se perfila como una técnica prometedora para el tratamiento de las formas tanto genéticas y adquiridas de la pérdida de 9 de la audición. La cóclea es potencialmente una diana ideal para la terapia génica por varias razones: 1) su volumen pequeño requiere una cantidad limitada de que el virus sea necesario; 2) su relativo aislamiento de otros efectos secundarios límites del sistema de órganos; y 3) sus cámaras llenas de líquido facilitan viralentrega en todo el laberinto 10, 11,12,13,14, 15.

Los modelos de ratón de la sordera congénita permiten el uso de muchos métodos de estudio para monitorear el desarrollo del oído interno de una manera sistemática, replicable. Mientras que el pequeño tamaño de cochleae ratón no presenta cierta dificultad quirúrgica, el ratón sirve como un modelo extremadamente importante en el estudio de la pérdida auditiva genética, con varias ventajas sobre otras especies experimentales 16. Los modelos de ratón permiten la evaluación de una serie de características a través de análisis de ligamiento genético, colección de observaciones morfológicas detalladas, y la simulación de escenarios patógenos; Como tales, son buenos candidatos para la terapia génica mediada por virus. Extensos estudios genéticos en ratones combinados con los avances tecnológicos han hecho posible la generación de ratones modificados genéticamente de forma reproducible a través de laboratorios de 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existen numerosos modelos para ambos adquiridas y heredadas de la audición fenotipos de pérdida en ratones, lo que permite a rigurosas pruebas en este modelo animal 22, 23,24. Por lo tanto, la corrección de la audición mediante la terapia génica mediada por virus en un modelo de ratón es un primer paso apropiado en la búsqueda de una cura para la enfermedad humana.

Hemos demostrado previamente que los ratones transgénicos que carecen de glutamato vesicular transportador 3 (VGLUT3) nacen sordos debido a la falta de liberación de glutamato en la sinapsis cinta IHC 25. Debido a que esta mutación no conduce a una degeneración primaria de las células ciliadas sensoriales, estos ratones mutantes son potencialmente un excelente modelo en el que para probar la terapia génica coclear para la pérdida de audición congénita.

Hasta la fecha, un número de técnicas de administración virales para la terapia génica coclear se han descrito, incluyendo la difusión membrana de la ventana redonda, la inyección de membrana de la ventana redonda, y la entrega a través de una cocleostomía. Hay potenteventajas ial y desventajas de cada uno de estos enfoques 9.

Aquí mostramos un método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus en el oído interno VGLUT3 KO ratón a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). El método de inyección de RWM post-auricular es mínimamente invasiva con la preservación audiencia excelente, y es relativamente rápido. Como hemos publicado anteriormente, en un esfuerzo para restaurar la audición en este modelo de ratón, un vector de AAV1 que lleva el gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) se introdujo en la cóclea de estos ratones sordos en el día postnatal 12 (P! @), Resultando en la restauración de la audición 26. Audición en los ratones KO VGLUT3 se verificó por la respuesta del tronco encefálico (ABR), mientras que la expresión de proteínas transgén se verificó mediante inmunofluorescencia (IF). Por tanto, esta metodología demuestra que la terapia génica mediada por virus-puede corregir un defecto genético que de otro modo resulta en sordera.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos y manejo de los animales cumplido con las pautas de ética NIH y los requisitos del protocolo aprobado del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Francisco.

1. Preparación del Animal de Cirugía

  1. Llevar a cabo procedimientos quirúrgicos en un espacio dedicado limpio. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, esterilizar con un esterilizador de vidrio de grano antes de la cirugía.
    NOTA: En este protocolo, utilice el día postnatal 10-12 (P10-12) ratones FVB. Diferentes edades y razas de ratones se pueden utilizar para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Ratones mayores de P40 puede ser un reto porque el hueso bulla se hace más difícil.
  2. Anestesiar a los ratones con inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg), clorhidrato de xilazina (10 mg / kg) y acepromacina (2 mg / kg). Comienza la preparación quirúrgica sólo después de que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie. Si necessary, administrar una dosis de refuerzo (un quinto de la dosis original) del cóctel anestésico para restaurar el plano original de anestésico.
    NOTA: Tenga cuidado en este paso porque la mayor parte de la mortalidad observada en esta edad es causada por sobredosis de anestésico.
  3. Cubrir los ojos del animal con una pomada oftálmica de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, la supresión de parpadeo reflejo del animal.
  4. Coloque el ratón con cuello extendido sobre una almohadilla caliente durante todo el procedimiento hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia.
  5. Afeitarse la región post-auricular izquierda con un clipper y desinfectar con etanol al 70% y la povidona yodada antes de la manipulación quirúrgica.

2. El procedimiento quirúrgico y la inyección del vector

  1. Utilice un enfoque post-auricular para exponer la bulla timpánica. Incisión en el tejido subcutáneo con unas tijeras pequeñas para exponer el músculo post-auricular. Después de la retracción del tejido adiposo a Mlado posterior e de la incisión, separar los músculos a la derecha y el lado izquierdo perpendicular a la incisión para exponer el hueso temporal. Asegúrese de que esta incisión es el tiempo suficiente para trabajar cómodamente con una visualización adecuada.
  2. Perforar la bulla timpánica con una aguja 25 G y ampliar el agujero como sea necesario con unas pinzas por el pelado de la columna vertebral para permitir el acceso a la espira basal de la cóclea, y luego ampliar suficientemente para visualizar la arteria estapedial y la membrana de la ventana redonda (RWM) .
  3. Perforar el RWM suavemente en el centro con una pipeta capilar de borosilicato. Observe flujo de salida de líquido a través de la RWM en este punto; esto es normal. Esperar hasta que el flujo de salida se ha estabilizado (el líquido effluxed de la cóclea se seca con un papel de filtro estéril).
    NOTA: Tenga cuidado al sostener y hacer avanzar la aguja de vidrio para que la perforación RWM es lo más pequeño posible. Dependiendo del microscopio usado, tienen las pipetas usando un micromanipulador o a mano usando una pipetatitular.
  4. Preparar las pipetas para inyección con una pipeta extractor se preparan de la misma manera pipetas de patch clamp. Asegúrese de que el diámetro de la punta es grande (unos 15 m de diámetro) para que dispensó el virus de entrada y salida se hace fácilmente.
  5. Elaborar 1 a 2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP en una pipeta de inyección. Después se estabiliza el flujo de salida (5 a 10 minutos), microinyectar este volumen fijo en la rampa timpánica por el mismo agujero hecho previamente en RWM.
  6. Sellar el nicho RW rápidamente después de sacar la pipeta con un pequeño tapón de músculo y seguro que con una pequeña gota de adhesivo tisular colocado en el músculo para evitar la fuga de la ventana redonda.
    NOTA: Selle este agujero muy bien después se retira la aguja con un pequeño tapón de músculo para evitar cualquier fuga perilinfa de la cóclea, este paso es fundamental para preservar la audición. El fracaso para sellar completamente el VM se traducirá en la pérdida de audición en el tiempo.
  7. Después de la inyección, cubra elagujero en la ampolla auditiva con el tejido adiposo, los músculos de regreso post-auricular y el tejido adiposo a su posición normal y la sutura de la herida en capas con una sutura absorbible crómico 6-0 o más pequeño.
  8. Desinfectar la herida con povidona yodada.

3. Cuidado posoperatorio

  1. Coloca los ratones en una jaula caliente y no los deje sin supervisión hasta que estén completamente recuperados luego pasar de nuevo con la madre. Se recomienda retirar el macho de la jaula antes de poner los cachorros de vuelta con la madre.
  2. Administrar subcutánea carprofeno (2 mg / kg) para la analgesia después de la operación y cada 24 h durante 3 días a partir de entonces, para gestionar la inflamación y el dolor. Monitorear los animales diariamente para detectar signos de sufrimiento, pérdida anormal de peso, dolor o infección. Generalmente por el 3er día después de la cirugía todos los ratones deberían estar actuando normalmente. Si cualquier signo de sufrimiento o la enfermedad aparecen en un ratón después de los 3 días, considere la eutanasia de tél ratón según las directrices institucionales.

4. Evaluación de la función coclear después de un parto Viral Utilizando respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) Grabaciones

NOTA: La respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) es una auditivo potencial extraído de la actividad eléctrica en curso en el cerebro y grabado a través de electrodos colocados bajo el cuero cabelludo evocado. El animal se estimula con el sonido. La grabación resultante consiste en cinco ondas que reflejan la actividad eléctrica de los puntos sucesivos en la vía auditiva en los primeros 10 mseg después de la aparición de un estímulo auditivo.

  1. Anestesiar ratones por inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina.
  2. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción en toda la prueba de audición hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia.
    NOTA: El usolos siguientes estímulos sonoros en este experimento: haga clic (5 milisegundos de duración; 31 Hz tasa de presentación).
  3. Coloque los electrodos de aguja subdérmicos en el vértice, por debajo del pabellón auricular del oído izquierdo (de referencia), y por debajo de la oreja contralateral (tierra) y empezar ABRs grabación como se describe anteriormente en una cámara insonorizada 27,28. Grabar formas de onda ABR en 5 intervalos de nivel de presión sonora dB por debajo del máximo de amplitud.
  4. Determinar los umbrales ABR postoperatorio tan pronto como 4 días después del parto viral
    NOTA: Umbral se define como el nivel de estímulo más bajo al que de respuestas de los picos para las ondas I-V eran claramente y repetidamente presente en la inspección visual.
  5. Mida Wave I para analizar la actividad del nervio coclear. El nivel de estímulo más bajo que produce una forma de onda de ABR detectable se define como el umbral.

5. Coclear Transgén expresión de la proteína mediante inmunofluorescencia

  1. Anestesiar ratones por una sobredosis de intrapinyección eritoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina.
  2. Decapitar la cabeza solamente después que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie.
  3. Diseccionar las cócleas y proceso para todo el montaje de inmunofluorescencia como se describe 26. Un protocolo detallado de coclear inmunofluorescencia de montaje en toda utilizando anticuerpos anti-7a anti-miosina VGLUT3 y se describe en Akil et al., 2013 29.
  4. Para el etiquetado GFP, incubar los cocleares enteros monta la noche a 4 ° C con un anticuerpo de conejo anti-GFP en dilución 1: 250.
  5. Enjuague el cochleae dos veces durante 10 min con PBS y luego se incuba durante 2 horas en IgG de cabra anti-conejo conjugado con Cy2 diluido 1: 4000 en PBS.
  6. Enjuague el cochleae dos veces con PBS durante 10 minutos y se incuba con DAPI durante 15 min.
  7. Monte el cochleae en portaobjetos de vidrio y observar under un microscopio con inmunofluorescencia confocal.

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Representative Results

Para verificar las características técnicas y utilidad del enfoque post-auricular para la terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP y AAV2-GFP se entregaron en ratones P10-12 oído interno a través de la RWM. Este enfoque demuestra con éxito la expresión del transgén dentro de las células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 y Figura 2 GFP y GFP Figura 3A), las células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) y células de soporte (GFP Figura 2 y Figura 3A) 26 sin órgano importante de daño Corti. La observación de diferentes tipos de células que expresan GFP se ve en las imágenes de inmunofluorescencia de todo el montaje cocleares (Figura 2 y Figura 3A) demuestra que la elección de serotipo AAV debe ser compatible con los tipos de células para ser transducidas. Figura 1, Figura 2 y Figura 3A 26 muestran muy buena transfection en ambos centros de salud integrados y OHCs, así como la distribución de la proteína transgén (GFP / VGLUT3) a lo largo de la cóclea después de AAV1 o AAV2-GFP o AAV1-VGLUT3 transfección. La distribución de los centros de salud integrados expresar VGLUT3 después de AAV1-VGLUT3 transfección (Figura 3B) 26 sugiere que la transfección a través de la RWM es más eficaz y uniforme a través de toda la cóclea que otros métodos que han informado de tasas más altas de transfección más cerca del sitio de administración viral. Hemos encontrado que las tasas de transfección se pueden hacer más eficiente aumentando el volumen del virus se inyecta en el oído interno (Figura 1) 26.

Nuestra observación de éxito expresión VGLUT3 en VGLUT3 KO ratón centros de salud integrados sin daño coclear nos llevó a probar la audición mediante la medición de ABR en los ratones KO rescatados. Figura 4A y Figura 4B 26 documento la capacidad de entrega RWM post-auricular de AAV1-VGLUT3 en el interior ear de los ratones KO VGLUT3 para producir rescate de audición en este modelo de ratón de la pérdida de audición congénita. De respuesta auditiva del tallo cerebral (ABR) rastros fueron restaurados en el VGLUT3 rescatado KO (Figura 4), ​​y los umbrales ABR eran medibles y comparables a los observados en los ratones de tipo salvaje (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1:. VGLUT3 IHC transfección después RWM entrega viral para P10-P12 ratones KO El cochleae transfectadas fueron examinados en P30 por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-MYO7A, un marcador de células de pelo, y un anticuerpo contra VGLUT3. MYO7A y VGLUT3 se expresaron en todos los centros de salud integrados sólo en el WT, mientras que centros de salud integrados de ratones KO expresa sólo MYO7A. El cochleae ratón rescatado mostró algunos centros de salud integrados que expresan VGLUT3, y todos los centros de salud integrados expresó MYO7A (fila 3) IHC:. Células ciliadas internas. Reimpresión con permiso de26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Ratón coclear todo el montaje de inmunofluorescencia después del parto RWM AAV2-GFP de tipo salvaje ratones P10-P12 AAV2-GFP se utilizó para evaluar la entrega viral utilizando el enfoque post-auricular a la cóclea del ratón.. Entrega AAV2-GFP se realizó en P10-12 y la expresión de GFP transgénica se examinó en la cóclea en P21 usando un anticuerpo anti-GFP. La expresión de GFP (verde) en ratones WT coclear todo el montaje muestran fuerte expresión de GFP en células ciliadas externas (OHC) que las células ciliadas internas (IHC).

Figura 3
Figura 3: Ratón coc hlear inmunofluorescencia todo el montaje después de la entrega RWM AAV1-GFP de tipo salvaje ratones P10-P12. Después de la entrega AAV1-GFP a la expresión de GFP cóclea se ve en células internas de pelo (IHC) y células de soporte (A), pero no OHCs , mientras que la entrega AAV1-VGLUT3 a la cóclea de los ratones KO VGLUT3 (B) resultó en la expresión de VGLUT3 sólo en centros de salud integrados. El número de centros de salud integrados expresar VGLUT3 en el VGLUT3 ratones KO cóclea después de la entrega AAV1-VGLUT3 depende de la cantidad de virus suministrado al oído interno; por ejemplo, el 40% de los centros de salud integrados expresó VGLUT3 cuando se inyectaron 0,6 l de virus, mientras que el 100% de los centros de salud integrados expresó VGLUT3 después de 1 l de virus fue entregado. No hubo diferencias en la expresión VGLUT3 entre el ápice, a mitad de turno, o base cuando se inyectaron 0,6 l de virus. Reimpresión con permiso de 26.

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. Figura 4: respuesta auditiva del tallo cerebral (ABR) Evaluación de formas de onda ABR representativos después del parto AAV1-VGLUT3 fueron similares entre los ratones rescatados y de tipo salvaje; En contraste, no hay formas de onda de ABR se observaron en los ratones KO (A). Ratones KO rescatados también mostraron umbrales ABR medibles. Estos umbrales de ABR eran comparables a los observados en los ratones WT para todas las frecuencias de medición (B). I:. ABR ola I. Reimpresión con permiso de 26 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo, se describe en detalle una técnica que se puede utilizar para la terapia génica coclear, con el objetivo de restaurar o rescatar la función auditiva normal que se ve comprometida por un defecto genético. Como es típicamente atraumática, este enfoque es seguro para la transferencia de genes coclear u otras terapias moleculares potenciales 30. Se han descrito otros enfoques para la terapia coclear, incluyendo un enfoque ventral 24, cocleostomía 31,32 y el saco endolinfático entrega 33 en el ratón y cobaya. En nuestra experiencia, el enfoque post-auricular es más rápido, más sencillo, y se asocia con la reducción del daño y la mortalidad de los animales. Además, el enfoque post-auricular ofrece una mejor visualización de la RWM con menos posibilidades de trauma y la pérdida asociada de escuchar 34,35,36. Este informe documenta los aspectos técnicos y la utilidad del enfoque post-auricular para la terapia molecular coclear mediante la demostración de entrega de AAV1-VGLUT3 en ªe oído interno a través de la RWM, lo que resulta en la expresión transgénica de tanto VGLUT3 y GFP (Figura 1 y la Figura 2 y la Figura 3A) y de rescate de audición en este modelo de ratón de la pérdida de audición congénita. Estudios previos que describen métodos para la entrega de genes mostraron sólo la expresión transgénica limitado en áreas críticas del órgano de Corti 12,37,38,39,40,41. Estas diferencias pueden deberse a la calidad de la preparación viral, el título del vector viral, el serotipo utilizado, o la entrega viral simplemente insuficiente en la cóclea. En contraste, el uso de este enfoque post-auricular fuimos capaces de obtener muy buenas tasas de transfección a ambas células ciliadas internas y externas y la distribución de un gen reportero (GFP) después de AAV2-GFP de transfección (Figura 2 y Figura 3A) a lo largo de la cóclea. Con base en el porcentaje de centros de salud integrados transfectadas con AAV1-VGLUT3 (Figura 3B), sugerimos que la transfección mediante RWM es más efreflexivo y uniforme a través de toda la cóclea que otros métodos, incluyendo el descrito en el conejillo de indias, que reportó mayores tasas de transfección en la espira basal, cerca del sitio de aplicación viral 42. La expresión a largo plazo de la GFP / VGLUT3 dentro de la cóclea, durante al menos un año y medio, es coherente con los datos obtenidos a partir de otros modelos animales y diferentes sistemas de órganos 38,43.

Además, el análisis histológico de la cóclea transfectadas demostrado la ausencia de una respuesta inflamatoria, con una excelente conservación de la citoarquitectura del órgano de Corti, incluyendo la estría vascular y las neuronas del ganglio espiral 26. Además, en contraste con los métodos que empleaban una cocleostomía, la transfección RWM utilizado en el presente estudio no causó daño coclear, y los volúmenes más altos puede ser inyectado 31,32. La falta de trauma usando esta técnica se verificó mediante la demostración de thresho ABR equivalentelds entre oídos operados y controlar, un hallazgo similar a la observada por Xia et al. 4 Por último, la entrega-AAV VGLUT3 a través de la RWM resultó en ABR umbrales comparables a los observados en los ratones WT (Figura 4A y Figura 4B) 26. Hemos utilizado esta técnica en todas las edades de los ratones, pero es técnicamente difícil en ratones mayores de P40 porque el hueso bulla hace más difícil de perforar y el hueso roto de la bulla es más aguda en los mayores que en los ratones más jóvenes. A edades más avanzadas, sangrado si no se toman precauciones, se pueden producir si un pedazo de hueso bulla lacera los tejidos del cuello.

En conclusión, este informe documenta la transferencia de genes con éxito en varios tipos de células cocleares en el ratón utilizando un vector basado en AAV como se mostró anteriormente. Esta técnica de la entrega de genes minimiza el trauma, no conduce a la pérdida de la audición, y puede resultar en la transfección generalizada de una variedad de tipos de células dentro de la cóclea, incLuding células ciliadas y neuronas del ganglio espiral. Tiene un gran potencial de aplicación para otros tipos de formas congénitas y adquiridas de la pérdida de audición, y también se podría aplicar a una variedad de terapias moleculares en modelos de ratón de la pérdida de audición.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

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Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

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