Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

Sensörinöral sağırlık fonksiyonel iyileşme elde etmek için kullanılan gen terapisi, işitme kaybı katkıda yatan moleküler ve genetik mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını vermek için vaat ediyor. Iç kulak içine vektörlerin giriş mevcut yapılara yaralanmasına en aza yaygın koklea boyunca maddesi dağıtan bir şekilde yapılmalıdır. Bu yazının moleküler, farmakolojik ve fareler doğum sonrası gün 10 ve yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden eski viral teslim kullanarak fare koklear tedavisi için kullanılabilecek bir post-aurikular cerrahi yaklaşım anlatılmaktadır. Kan kaybını en aza indirmek ve hayvan ölümleri kaçınarak bu cerrahi yaklaşım skala timpani'ye içine hızlı ve doğrudan teslim sağlar. Bu teknik, temel iç ve orta kulak yapıları yanı sıra boyun kasları tamamen işitme koruyarak ihmal edilebilir veya hiç hasar içerir. Bu cerrahi teknik, veziküler glutam etkinliğini göstermek için3 nakavt (KO VGLUT3) fareler bir adeno-bağlantılı virüs (AAV-1) iç kulağa VGLUT3 teslim aldıktan sonra işitme kurtarır konjenital sağırlık bir fare modelinde bir örnek olarak kullanılacaktır taşıyıcı yedi.

Introduction

Gen tedavisi uzun genetik işitme kaybı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür, ancak bu alanda başarı 1 zor kalmıştır. Bugüne kadar, viral aracılı metodolojiler nispeten ulaşılmaz koklea içinde belirli hücre türlerini hedef teorik yeteneği nedeniyle hakim olması. Her iki adenovirüs (AV), adeno-bağlantılı virüs (AAV), koklear gen aktarımı için kullanılmıştır. AAVler bir takım nedenlerden için kokleadaki avantajlıdır. Onlar çoğaltma eksikliği virüsler ve verimli nöronlar, işitme kaybının nedenleri bir dizi için önemli bir hedef gibi farklı hücre tiplerine transgenik molekülleri aktarabilirsiniz. Hücreye AAV giriş spesifik reseptörler 2 aracılık eder; hücre tipleri transduse edilmesi ile, böylece, belirli bir serotip tercih uyumlu olmalıdır. AAVler etkili saç hücreleri 3 transfekte Transformatörün istikrarlı, uzun vadeli ifade Elde edilen konakçı genomu içine dahil edilebilirnsgenic proteini ve hücre 4 fenotipik bir değişiklik. Bu tür saç hücre yenilenmesi gibi kısa süreli uygulamalar için gerekli olmayan, avantajlı olmasına rağmen, uzun vadeli ifade, genetik kusurların sabit kurtarma için çok önemlidir. AAVler herhangi bir insan hastalık ya da enfeksiyon ile bağlantılı hiçbir ototoksisiteye 5,6,7 göstermeyen, çünkü bunlar kaybı 8 işitme kalıtsal formları için gen terapisinde kullanım için ideal bir aday olup.

Viral vektörleri kullanılarak memeli iç kulak içine egzojen genetik madde aktarımı son on yıl içinde incelenmiştir ve zarar 9 işitme genetik ve elde edilen her iki formu da tedavisi için ümit vaadeden bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır. koklea potansiyel çeşitli nedenlerle, gen terapisi için ideal bir hedeftir: küçük hacimli gerekli virüs sınırlı miktarda gerektiren 1); Diğer organ sistemleri limitleri yan etkilerinden 2) göreceli izolasyon; ve 3) kendi sıvı dolu odaları viral kolaylaştırmakLabirent 10, 11,12,13,14, 15 boyunca teslim.

Konjenital sağırlık Fare modelleri sistematik, yinelenebilir bir şekilde iç kulak gelişimini izlemek için çalışmanın birçok yöntem kullanımına izin verir. Fare cochleae küçük boyutu, bazı cerrahi zorluk sunmak yok iken, fare diğer türlerin üzerinde 16 çeşitli deneysel avantajları ile genetik işitme kaybı çalışmada son derece önemli bir model olarak hizmet vermektedir. Fare modelleri genetik bağlantı analizi, detaylı morfolojik gözlemler toplanması ve patojenik senaryoları simüle edilerek özellikleri bir dizi değerlendirilmesine olanak; gibi, bu viral olarak aracılık edilen, gen terapisi için iyi adaylardır. Teknolojik gelişmeler ile birlikte farelerde Kapsamlı genetik çalışmalar mümkün laboratuvarlarda 17,18, 19, 20,21 arasında bir tekrarlanabilir şekilde genetiği değiştirilmiş fareler üretmek için yaptık. Furthermorhem edinilmiş ve bu hayvan modelinde 22, 23,24 titiz test sağlayan, farelerde işitme kaybı fenotipleri kalıtsal e, sayısız modelleri de bulunmaktadır. Bu durumda, bir fare modelinde, viral aracılı gen terapisi kullanılarak işitme düzeltmek insan hastalığı için bir tedavi arayışında uygun bir ilk adımdır.

Biz daha önce veziküler glutamat taşıyıcı 3 (VGLUT3) eksik transgenik fareler nedeniyle İHK şerit sinaps 25 glutamat salınımı eksikliği sağır doğarlar olduğunu göstermiştir. Bu mutasyon duyusal saç hücrelerinin birincil dejenerasyonuna yol olmadığından, bu mutant fareler potansiyel doğumsal işitme kaybı için koklear gen tedavisi sınamak için mükemmel bir modeldir.

Bugüne kadar, koklear gen terapisi için viral uygulama teknikleri sayıda kokleostomisi ile yuvarlak cam membran yayılma, yuvarlak cam membran enjeksiyonu ve verme dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Güçlü vardırial avantajları ve bu yaklaşımların 9 her dezavantajları.

Burada yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden VGLUT3 KO fare iç kulağa viral aracılı gen aktarımı için cerrahi bir yöntem sunulmaktadır. sonrası auricular RWM enjeksiyon yöntemi mükemmel işitme koruma ile minimal invaziv ve nispeten hızlı. Daha önce yayınlanmış gibi, bu fare modelinde işitme geri bir çaba, VGLUT3 genini (AAV1-VGLUT3) taşıyan bir AAV1 vektör doğum sonrası 12. günde de bu sağır farelerin koklea içine tanıtıldı (P! @), Sonuçlanan 26 işitme restorasyonu. Transgen protein ifadesi immünoflüoresans (IF) ile doğrulandı iken VGLUT3 KO farelerde İşitme, işitsel beyin sapı cevabı (ABR) tarafından doğrulandı. Bu metodoloji, böylece viral-aracılı gen terapisi olur, aksi takdirde sağırlık neden genetik kusur düzeltmek olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: NIH etik kurallar ve Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, San Francisco onaylanan protokol şartlarına uyulması Tüm prosedürler ve hayvan taşıma.

1. Cerrahi Hayvan Hazırlama

  1. Temiz, özel alanda cerrahi işlemleri yürütmek. Ameliyat öncesinde bir cam boncuk sterilizatör ile sterilize, tüm cerrahi aletler otoklav.
    NOT: Bu protokolde, doğum sonrası geçen gün 10-12 (P10-12) FVB fareler kullanın. Farklı yaş ve farelerin suşları belirli bir projenin ihtiyaçlarını karşılamak için kullanılabilir. Bül kemik zorlaşıyor çünkü P40 daha yaşlı Fareler zor olabilir.
  2. Ketamin hidroklorür (100 mg / kg), ksilazin hidroklorür (10 mg / kg) ve asepromazin (2 mg / kg) karışımı intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi. Hayvan artık böyle ayak tutam gibi ağrılı uyaranlara, cevap sonra cerrahi hazırlık başlayın. Eğer Mutlakay orijinal anestezi uçağı geri anestezik kokteyl bir rapel doz (beşte biri orijinal doz) yönetmek.
    NOT: Bu yaşta görülen mortalitenin en anestezik doz aşımı nedeniyle çünkü bu aşamada dikkat edin.
  3. Hayvanın göz kırpma refleksi baskılayarak, anestezi sırasında gözleri nemli tutmak için koruyucu bir oftalmik merhem ile hayvanın gözlerini örtün.
  4. Fare tamamen uyanık olduğu kadar anestezi sonrası hipotermi önlemek için, işlem boyunca bir ısıtma yastığı genişletilmiş boyun ile fare yerleştirin.
  5. Bir kesme makinesi ile sol sonrası kulaktan bölgeyi Tıraş ve cerrahi manipülasyon öncesi% 70 etanol ve povidon-iyot ile dezenfekte edin.

2. Cerrahi Prosedür ve Vektör Enjeksiyon

  1. Timpanik bülü maruz sonrası aurikular yaklaşımı kullanın. Post-aurikular kas maruz küçük makas ile deri altı doku İnsizyon. Adipoz dokusu geri çekilmeden inci sonraKesi e arka tarafında, zamansal kemik açığa kesi dik sağ ve sol tarafına kasları ayrı. Bu kesi yeterli görselleştirme ile rahat çalışmak için yeterince uzun olduğundan emin olun.
  2. 25 G iğne ile kulak bülü perfore ve koklea bazal dönüş erişime izin vermek için geri kemik soyulması ile forseps ile gerekli delik genişletin ve sonra da stapes arter ve yuvarlak pencere membranı görselleştirmek için yeterince genişletmek (RWM) .
  3. Bir borosilikat kılcal pipet ile merkezde hafifçe RWM delinme. Bu noktada RWM yoluyla sıvı akışını gözlemlemek; Bu normaldir. Akış stabilize kadar bekleyin (koklea gelen effluxed sıvı steril bir filtre kağıdı ile kurutulur).
    NOT: tutma ve RWM perforasyon mümkün olduğunca küçük olması, böylece cam iğne ilerleyen dikkatli olun. Kullanılan mikroskop bağlı olarak, pipetler, bir pipet kullanarak bir micromanipulator kullanarak veya elle tutuntutucu.
  4. Aynı şekilde yama kelepçe pipetler hazırlanır çektirmenin bir pipet kullanarak enjeksiyon için pipetler hazırlayın. Uç çapı büyük (yaklaşık 15 mikron çapında), dışarı virüs pipetle ve kolayca yapılır böylece olduğundan emin olun.
  5. Bir enjeksiyon pipet içine AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP veya AAV2-GFP 1 ila 2 ul kadar çizin. Akış (5 dakika 10) stabilize microinject aynı delikten skala timpani'ye içine bu sabit bir hacim, daha önce RWM yapılır sonra.
  6. Kas küçük bir fiş ile pipet çekerek sonra hızla RW niş Seal ve yuvarlak penceresinden sızıntıyı önlemek için kas üzerine yerleştirilen doku yapıştırıcı küçük bir damla ile sabitleyin.
    Not: çok iyi iğne koklea-Bu aşama bir perilenf sızıntıyı önlemek için kas küçük bir tıpa ile kaldırıldıktan sonra, bu delik Seal işitme korumak için önemlidir. Sızdırmaz takdirde tamamen RWM zaman içinde işitme kaybı ile sonuçlanacaktır.
  7. Enjeksiyon sonrası, kapakadipoz dokusu ile işitsel bül delik, normal pozisyona sonrası aurikular kasları ve adipoz dokusu dönmek ve 6-0 ya da daha küçük emilebilir kromik sütür ile katmanlar halinde yara sütür.
  8. Povidon-iyot ile yarayı dezenfekte edin.

3. Ameliyat Sonrası Bakım

  1. Sıcak kafeste fareler yerleştirin ve tam geri anne ile taşıyabilirsiniz kurtarıldı kadar onları yalnız bırakmayın. Bu anne ile geri yavrular koymadan önce kafesinden erkek kaldırmak için tavsiye edilir.
  2. Inflamasyon ve ağrı yönetmek için deri altına karprofen postoperatif analjezi ve 3 gün boyunca her 24 saat için (2 mg / kg), yönetme. Sıkıntı, anormal kilo kaybı, ağrı, ya da enfeksiyon belirtileri günlük hayvanları izleyin. Genellikle tüm fareler normal hareket edilmelidir ameliyat sonrası 3. gün. Sıkıntı veya hastalık belirtileri 3. günden sonra bir fare görünüyorsa, t euthanizing düşününkurumsal kurallarına göre o fare.

İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) Kayıtlar kullanma Viral Teslimat ardından Koklear Fonksiyon 4. Değerlendirme

NOT: işitsel beyin sapı cevabı (ABR) işitsel bir kafa derisi altına yerleştirilen elektrotlar aracılığıyla beynin devam eden elektriksel aktivite çıkarılan ve kaydedilen potansiyeli uyarılmış olduğunu. Hayvan sesi ile uyarılır. Elde edilen kayıt işitsel uyarının başlamasından sonra ilk 10 msn işitsel yolda ardışık noktaları elektriksel aktivitesini yansıtan beş dalgalar oluşur.

  1. Asepromazin olmaması haricinde, bu protokolün Bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi ketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi.
  2. Fare tamamen uyanık olduğu kadar anestezi sonrası hipotermi önlemek için, işitme testi boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde fare yerleştirin.
    NOT: kullanBu deneyde aşağıdaki ses uyaranlar: (; 31 Hz sunum hızı 5 ms süresi) tıklayın.
  3. Sol kulakta (referans) kepçesi altında, tepe de deri altı iğne elektrotları yerleştirin ve kontralateral kulakta altında (toprak) ve daha önce bir ses geçirmez odasına 27,28 açıklandığı gibi kayıt ABRS başlar. Aşağı maksimum genlik 5 dB ses basınç seviyesi aralıklarla Tutanak ABR dalga.
  4. ABR eşik Ameliyat sonrası erken 4 gün olarak viral doğumdan sonra belirleyin
    NOT: Eşik dalgalar için zirveleri tepki hangi düşük uyarıcı seviyesi olarak tanımlanan I-V açıkça ve görsel inceleme üzerine tekrar tekrar mevcut.
  5. Ben koklear sinir aktivitesini analiz Dalga ölçün. saptanabilir ABR dalga verir düşük uyaran eşik seviyesi olarak tanımlanır.

Immunofluorescence Kullanılması 5. Koklear Transgen Protein Ekspresyonu

  1. Intrap aşırı dozda fareler uyutmakketamin hidroklorür ve ksilizin hidroklorür karışımı eritoneal enjeksiyon asepromazin olmadan hariç, bu protokolün Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi.
  2. Hayvan artık böyle ayak tutam gibi ağrılı uyaranlara, cevap sonra başını başını kesmek.
  3. 26 anlatıldığı gibi tüm montaj Immünofloresan için dışarı ve süreç cochleae incelemek. Anti-VGLUT3 ve anti-miyozin 7a antikorları kullanılarak koklear tüm montaj imünofloresans ayrıntılı bir protokol Akil ve diğ., 2013, 29 tarif edilmiştir.
  4. 250 seyreltme GFP etiketleme için, 1 ile bir tavşan anti-GFP antikor ile 4 ° C'de bir gece boyunca koklear tam bağlar inkübe edin.
  5. PBS içinde 4000: PBS ile 10 dakika boyunca iki kez cochleae yıkayın ve daha sonra 2'ye ait konjuge keçi anti-tavşan IgG 2 saat süreyle inkübe 1 seyreltilmiştir.
  6. 10 dakika boyunca PBS ile iki kez cochleae yıkayın ve 15 dakika boyunca DAPI ile inkübe edilir.
  7. Cam slaytlar cochleae monte ve und gözlemlemekkonfokal immünflörosans bir mikroskop er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teknik özellikleri ve koklear moleküler tedavi için post-aurikular yaklaşımın faydasını doğrulamak için, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ve AAV2-GFP RWM üzerinden P10-12 fareler iç kulak içine teslim edildi. Bu yaklaşım, iç saç hücreleri içinde başarılı bir şekilde, transgen ekspresyonunu gösterir (IHC); (VGLUT3 Şekil 1 ve GFP Şekil 2 ve GFP Şekil 3A), dış saç hücreleri (OHC) (GFP Şekil 2) ve destek hücreleri (GFP Şekil 2 ve Şekil 3A) 26 Corti yaralanma önemli organı yoktur. koklear tüm montaj imüno-görüntülerinin (Şekil 2 ve Şekil 3A) görülen GFP ifade eden farklı hücre tiplerinin gözlem AAV serotip seçimi aktarılacak olan hücre tipleri ile uyumlu olması gerektiğini gösterir. Şekil 2 ve Şekil 3A Şekil 1 ' 26 çok iyi tr göstermekIHCs ve OHCs hem ansfection yanı sıra, AAV1 veya AAV2 bir GFP veya AAV1-VGLUT3 transfeksiyondan sonra koklea boyunca transgen proteininin (GFP / VGLUT3) dağılımı. AAV1-VGLUT3 transfeksiyonu (Şekil 3B) daha sonra VGLUT3 ifade IHCs dağılımı 26 RWM ile transfeksiyon, viral yakın teslimat yerinde daha yüksek transfeksiyon oranları bildirmiştir diğer yöntemlere göre bütün koklea ile daha etkin ve üniform olduğunu göstermektedir. Biz transfeksiyon oranları (Şekil 1) 26 iç kulak enjekte virüsün hacmini artırarak daha verimli hale getirilebilir bulduk.

Hiçbir koklear hasar VGLUT3 KO fare IHCs başarılı VGLUT3 ifade Bizim gözlem kurtarıldı KO farelerde ABRS ölçerek işitme test götürdü. Şekil 4A ve 4B Şekil 26 belge içine AAV1-VGLUT3 sonrası aurikular RWM teslim yeteneği İç eVGLUT3 KO farelerin ar konjenital işitme kaybı bu fare modelinde kurtarma işitme üretmek. İşitsel beyinsapı cevabı (ABR) izleri KO (Şekil 4A) kurtarıldı VGLUT3 restore ve ABR eşikleri wild-tip farelerde (Şekil 4B) görülen bu ölçülebilir ve karşılaştırılabilir edildi.

Şekil 1,
Şekil 1:. P10-P12 KO ​​fareleri için RWM virüs doğum sonrası VGLUT3 IHC transfeksiyon transfekte cochleae anti Myo7a antikoru, bir saç-hücresi markeri ve VGLUT3 karşı bir antikor kullanılarak, bağışıklık fluorışımasıyla P30 incelendi. KO farelerden IHCs Myo7a sadece ifade ederken Myo7a ve VGLUT3 sadece WT tüm IHCs olarak ifade edildi. Kurtarılan Fare cochleae VGLUT3 ifade bazı IHCs gösterdi ve tüm IHCs Myo7a (satır 3) IHC ifade:. İç saç hücreleri. Izni ile yeniden yazdırmak26. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2: Fare koklear tüm montaj vahşi tip P10-P12 farelere RWM AAV2-GFP teslim AAV2-GFP fare cochlea'ya sonrası aurikular yaklaşım kullanılarak viral teslim değerlendirmek için kullanıldıktan sonra immünoflüoresans.. AAV2 GFP dağıtım P10-12 yapılır ve transgenik GFP tanımı, bir anti-GFP antikoru kullanılarak P21 koklea incelenmiştir. WT farelerde GFP (yeşil) koklear tüm montaj iç saç hücreleri (İHK) daha dış saç hücrelerinin (OHC) güçlü GFP göstermektedir.

Şekil 3,
Şekil 3: Fare coc GFP salyangozunun ifadesi AAV1-GFP dağıtım iç saç hücreleri (IHC) ve destek hücreler (A), ancak OHCs görülür vahşi tip P10-P12 farelere RWM AAV1-GFP doğum sonrası. Sonra immünofloresan-bütün montaj hlear , VGLUT3 KO fareleri (B) 'nin kokleaya AAV1-VGLUT3 dağıtım VGLUT3 ekspresyonuyla sonuçlandı ancak IHCs kalınmıştır. AAV1-VGLUT3 doğumdan sonra VGLUT3 KO fareler kokleadaki VGLUT3 ifade IHCs sayısı iç kulağa teslim virüsün miktarına bağlıdır; virüs, 0.6 ul enjekte edildiği zaman, virüsün 1 ul teslim sonra IHCs% 100 VGLUT3 ifade ise, örneğin, IHCs% 40, VGLUT3 ifade edilmiştir. Virüsün 0.6 ul enjekte edildiğinde apeks, orta-dönüş, ya da baz arasındaki VGLUT3 ifadesinde hiçbir fark yoktu. 26 izniyle yeniden yazdırın.

g "/>
. Şekil 4: İşitsel beyinsapı cevabı (ABR) değerlendirme AAV1-VGLUT3 doğumdan sonra Temsilcisi ABR dalga kurtarıldı ve wild-tip fareler arasında benzerdi; aksine, herhangi bir ABR dalga KO fareleri (A) 'da görülmüştür. Kurtarılan KO fareleri de ölçülebilir ABR eşik göstermiştir. Bu ABR eşikleri ölçüldü bütün frekanslarda (B) WT farelerinde görülen değerler ile karşılaştırılabilir olmuştur. Ben:. 26 izniyle ABR dalga I. Yeniden bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, ayrıntılı olarak yeniden veya bir genetik kusur tarafından tehlikeye normal işitsel fonksiyon kurtarmak amacı ile, koklear gen terapisi için kullanılan bir tekniği açıklar. Genellikle atravmatik olduğu için, bu yaklaşım koklear gen transferi ya da diğer olası moleküler tedaviler 30 için güvenlidir. Koklear tedavisi için başka bir yaklaşım, ventral yaklaşımla 24, fare ve gine domuzunda kokleostomisi 31,32 ve endolenfatik kese teslimat 33 de dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, post-aurikular yaklaşım hızlı, basit ve düşük yaralanma ve hayvan mortalite ile ilişkili. Ayrıca, post-aurikular yaklaşım travma az şans ve 34,35,36 işitme kaybı ile ilişkili RWM geliştirilmiş görselleştirme sunuyor. Bu rapor th içine AAV1-VGLUT3 teslim göstererek koklear moleküler tedavi için post-aurikular yaklaşımın teknik yönlerini ve yardımcı belgelerVGLUT3 ve GFP (Şekil 1 ve Şekil 2 ve Şekil 3A), her iki transgenik ekspresyonu ile sonuçlanan ve konjenital işitme kaybı, bu fare modelinde kurtarma işitme RWM üzerinden e iç kulak. Gen aktarımı için yöntemleri tarif Önceki çalışmalar Corti 12,37,38,39,40,41 organı kritik alanlarda çok az transgenik ekspresyonu gösterdi. Bu farklılıklar, koklea viral hazırlanması kalitesi viral vektörün titresi, kullanılan serotip, ya da sadece yetersiz virüs teslimat nedeniyle olabilir. Buna karşılık, bu post-aurikular yaklaşım kullanarak biz koklea boyunca AAV2-GFP transfeksiyon (Şekil 2 ve Şekil 3A) sonra hem iç ve dış saç hücrelerinin ve bir raportör gen (GFP) dağılımı çok iyi transfeksiyon oranları elde başardık. AAV1-VGLUT3 (Şekil 3B) ile transfekte IHCs yüzdesine dayanarak, RWM ile transfeksiyon daha eff olduğunu göstermektedirViral uygulama 42 yerine yakın bazal da daha yüksek transfeksiyon oranları bildirmiştir kobay, tarif de dahil olmak üzere diğer yöntemler, daha bütün koklea yoluyla açarak etkin ve düzgün. en az bir yıl ve bir buçuk koklea içindeki GFP / VGLUT3 uzun vadeli ifade, diğer hayvan modelleri ve farklı organ sistemlerinde 38,43 elde edilen veriler ile tutarlıdır.

Ayrıca, transfekte Kokleanın histolojik analiz stria vaskularis ve spiral ganglion nöronları 26 olmak üzere Corti organı hücre mimarisini mükemmel korunması ile, bir inflamatuar yanıtın hiçbir kanıt gösterdi. Bundan başka, bir kokleostomisi kullanılan yöntemlerden farklı olarak, bu çalışmada kullanılan RWM transfeksiyon koklear hasara neden olmadığını ve daha yüksek miktarlar 31,32 enjekte edilebilir. Bu tekniği kullanarak travma eksikliği eşdeğer ABR thresho göstererek doğrulandıameliyat ve kontrol kulak arasındaki lds 4 Son olarak, RWM ile AAV VGLUT3 dağıtım ABR sonuçlandı vd. Xia ile görülene benzer WT farelerinde (Şekil 4A ve Şekil 4B) 26 görülene benzer eşikleri bulmak. Biz fareler her yaştan bu tekniği kullanmış, ancak bül kemik delmek için zorlaşıyor ve bül kırık kemik genç farelerde daha eski daha keskin olduğu için P40 daha yaşlı farelerde teknik zordur. Bül kemik bir parça boyun dokuları lacerates eğer yaşlarda, dikkatli alınmadığı takdirde kanama oluşabilir.

Daha önce görüldüğü gibi Sonuç olarak, bu rapor bir AAV-tabanlı vektör kullanarak fare koklear hücrelerin çeşitli tipte başarılı gen transferi belgelemektedir. Gen dağıtımından Bu teknik işitme kaybına yol açmaz, travma en aza indirir ve koklea, Inc. içinde hücre türleri çeşitli yaygın transfeksiyonu ile sonuçlanabilirsaç hücrelerini ve spiral ganglion nöronları luding. Bu işitme kaybı doğumsal ve edinsel formlarının diğer türleri için büyük bir potansiyel uygulaması vardır, ve aynı zamanda işitme kaybı fare modellerinde moleküler tedaviler çeşitli uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Tags

Neuroscience Sayı 97 Gen tedavisi transfeksiyonu Adeno-ilişkili virüs (AAV) fare koklea iç saç hücreleri (IHC) ve veziküler glutamat taşıyıcı 3 (VGLUT3).
Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter