Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forvandle lin hjelp Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dip. Denne protokollen er enkel å utføre og billig, men likevel gir en høyere transformasjon rente enn dagens tilgjengelige metoder for lin transformasjon.
Abstract
Agrobacterium-formidlet transformasjon anlegget via blomster-dip er en mye brukt teknikk innen plantetransformasjon og har blitt rapportert å være vellykket for mange plantearter. Imidlertid har lin (Linum usitatissimum) transformasjon av floral-dip ikke blitt rapportert. Målet med denne protokollen er å fastslå at Agrobacterium og floral-dip metoden kan brukes til å generere transgene lin. Vi viser at denne teknikken er enkel, billig og effektiv, og enda viktigere, gir en høyere transformasjon rente enn dagens tilgjengelige metoder for lin transformasjon.
Oppsummert ble blomsterstander av lin dyppet i en oppløsning av Agrobacterium bærer en binær vektor plasmid (T-DNA-fragmentet pluss Linum innskuddssekvens, LIS-1), 1 - 2 min. Plantene ble lagt flatt på sin side i 24 timer. Deretter planter ble opprettholdt under normale vekstforhold frem til neste behandling. Forarbeides av dipping ble gjentatt 2-3 ganger, med ca 10 - 14 dagers mellomrom mellom dipping. Den T1 frø ble samlet og spiret på jord. Etter ca to uker, ble behandlet progenies testet ved direkte PCR; 2-3 blader ble brukt per plante pluss de passende T-DNA-primere. Positive transformanter ble valgt ut og vokst til forfall. Omformingen raten var uventet høy, med 50 - 60% av frøene fra behandlede planter blir positive transformanter. Dette er en høyere transformasjon rente enn det som er rapportert for Arabidopsis thaliana og andre plantearter, ved hjelp av floral-dip transformasjon. Det er også den høyeste, som har blitt rapportert så langt, for lin transformasjon ved hjelp av andre metoder for transformasjon.
Introduction
Lin (Linum usitatissimum) er en viktig avling dyrkes mye for sine fiber og oljer. Transformasjon av lin-genom som er mulig med teknikker som såret, Agrobacterium-infeksjon, og ko-dyrking i vevskultur, påføring biolistic partikler eller ultralyd sonikering, etterfulgt av regenerering. Imidlertid har disse teknikker har mange ulemper, blant annet tilbøyeligheten til mange mutasjonshendelser og en forlenget tid for å oppnå de transgene linjer. Noen av disse metodene kan også være kostbart og krever dyktig og effektiv manipulering av instrumentene, noe som resulterer i lave utvinning frøplanter. Viktigst, disse teknikken ofte resultere i lave transformasjon prisene 2,6.
Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dip er en enkel og effektiv metode for å generere transgene planter. Det har blitt rutinemessig og med hell brukt i mange plantearter slik som Arabidopsis Thalianen 1,4, Medicago truncatula 11, tomat 12, hvete 13 og mais 10. Imidlertid har det ikke vært tenkt som en levedyktig teknikk for lin transformasjon på grunn av flere faktorer, som den lave tall for blomster produsert av lin, begrenset antall frø hentet fra hver blomst, den store frø størrelse, og den tykke pelsen, som også kan være problematisk for eksempel genetiske transformasjonsprosessen. I tillegg er utvalget segment av floral-dip teknikken krever spirende forvandlet frø på en plante medier som inneholder et antibiotikum, med transform progenies utmerker basert på deres evne til å spire og bli grønn, mens ikke-transformert progenies enten ikke spire eller spire men blekemiddel ut raskt og dø. I den aktuelle litteratur, er det blitt bemerket at villtype-lin har en tendens til å unnslippe høy konsentrasjon av antibiotika valg, produserer falske positive resultater, og gjør valg av T1 progenies basertpå antibiotikaresistens vanskeligere 6,14. Også når en høy konsentrasjon av antibiotikum ble tilsatt til seleksjonsmedium, frekvensen av den observerte forandring falt dramatisk 9.
I denne protokoll har vi brukt Agrobacterium og blomster-dip metode for å transformere en linje av fiber lin, Stormont Cirrus (responsiv og plast), som har vist seg å svare til spenninger i miljøet ved å endre sitt genom 3,5. For å overvinne den antibiotika flukt problem, har vi valgt å gjøre direkte PCR-testing av DNA fra T1 blader, i stedet for valg ved å legge antibiotika til anlegget media. Vi tok fordel av den enkle anatomi av lin å spore bestemte blomster på tidspunktet for behandlingen. Denne sporingssystem tillatt utvalg av frø fra bestemte blomster og spiring på jord uten å legge antibiotika. Positive transformanter ble rett og slett identifisert ved å teste DNA hentet fra bladene ved hjelp av rask og effektiv metode of direkte PCR. Våre resultater viser at floral-dip metoden fungerte veldig bra i denne linjen av lin og overraskende resulterte i en meget høy transformasjonsraten (50 - 60%), høyere enn de som tidligere er observert for Arabidopsis thaliana, som ble rapportert å være 0,1 til 1 1%, og også høyere enn andre plantearter 10,12. Vi testet også en annen variasjon av linfrø (olje lin), Bethune (stabil og ikke-responsive), og vår foreløpige data indikerer at floral-dip fungerer også for denne varianten av lin.
Målet med denne protokollen er å vise at Agrobacterium og floral-dip kan brukes til å generere transgene lin. Vi viser at denne teknikk er enkel, billig, og raskere enn andre metoder for lin transformasjon. Enda viktigere det resulterer i en mye høyere transformasjon rente enn de andre metodene for lin transformasjon 2,6. Anatomi av Arabidopsis thaliana, som har mange grener og blomster, makes det vanskelig å skille dyppet og ikke-dyppet blomster på samme plante. Derfor et stort antall frø, ca. 20.000 frø per plante, må være skjermet for å identifisere positive transformanter 8. Flax, på den annen side, har færre grener (en hovedgren og noen sidegrener) og færre blomster, produserer ca 100 frø per planter, som gjør det mulig å spore enkelte blomster og for å velge bestemte frø under screening prosessen.
Vi foreslår at floral-dip er en anvendelig metode for å forvandle noen beslektede arter av lin, en slekt av ca 200 arter. Denne metoden gir mye høyere transformasjon rente enn andre metoder for lin transformasjon. Vi foreslår også at den direkte PCR-screening av T1 blad DNA er en effektiv måte til å overvinne problemet med antibiotikaresistens flukt som ofte frembringer mange falske positiver. Direct PCR-screening kan anvendes på andre plantearter, og er ikke begrenset to lin. Den enkle frø sporing teknikk ansatt i denne protokollen kan brukes på alle andre plantearter med forgrening anatomi ligner på lin.
Protocol
1. Økende Planter
- 6 uker før dipping, fylle fem tommers potter med jord og sår linfrø ¼ tommers dypt i jorda (4 frø per pott). Sørg for å stramme jord over frøene. Vanne plantene jevnlig og holde dem i lang dagslys (14 timers lys og 10 timer mørke).
- Sjekk plantene regelmessig for primær inflorescences (klynger av blomster organer). Plantene er klar for transformasjon når knoppene er synlige og har nettopp dannet i blomsterstand (figur 1 og 2). Å se knoppene, klippe bladene rundt det om nødvendig.
MERK: Bruk den beste blomsten fasen er kritisk, og er beskrevet i diskusjon.- Bruk den viktigste grenen av anlegget for eksperimentell behandling som den produserer mer blomster enn side greiner. Bruk sidegreiner enten som kontroller (for ikke å bli dyppet) eller for andre eksperimentelle behandlinger.
- Alternativt kan du bruke de viktigste og sidegrenersamme anlegg for eksperimentell behandling og bruke et annet anlegg som en kontroll eller av andre eksperimentelle behandlinger. Bruk etiketter for å markere enkelte grenene og individuelle blomster med dato og type behandling.
2. Kloning og Transformasjon i å Escherichia coli (E. coli) Cells
- Klone fragmentet / genet av interesse inn i det multiple kloningssete av en plante binære vektoren som rommer det T-DNA.
- Utføre kloning i ett trinn eller to trinn.
- Direkte klone små innsatser i denne protokollen (~ 500 bp) inn i anlegget binær vektor. I denne protokollen, bruke anlegget binær vektor (PRI909). Ellers bruker noen andre plante binære vektorer i en lignende strategi.
- Alternativt klone store innsatser (≥6.5 kb) i to trinn: først ved hjelp av en generell kommersiell kloningssett (ikke plante spesifikk), så subklone inn i anlegget binær vektor.
- Utføre kloning i ett trinn eller to trinn.
- Sett opp en PCR REACsjon for å amplifisere genet av interesse. Designe primere med restriksjonssetene på 5 'enden (i henhold til multiple kloningssete av anlegget binær vektor i bruk).
- Utføre en standard PCR ved anvendelse av genomisk DNA lin med følgende sykkel betingelser: en innledende hold på 24 ° C, deretter 2 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser av 98 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sek, og 72 ° C i 2 min. Utføre en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 5 minutter etterfulgt av en ubestemt hold ved 4 ° C.
- Separate PCR-produkter på 1% Tris / Borate / EDTA (TBE) agarosegel, kjøre gelen ved 100 V i 1 time. Rense produkter fra gelen og kvantifisere via Nanodrop.
- Sett opp ligeringsblandingen å klone PCR-produktet i den kommersielle kloningsvektor. Følg produsentens protokoll.
- Forvandle den ringsblandingen inn i kjemisk kompetente E. coli-celler som følger.
- Tilsett 2 mL av ringsblandingen inn i ett hetteglass med chemically kompetente E. coli-celler. Inkuber på is i 30 min.
- Varmesjokk cellene i 30 sekunder ved 42 ° C (varmesjokk tid og temperatur er avhengig av typen av celler brukt).
- Inkuber på is og tilsett 250 mL av RT super optimal kjøttkraft med catabolitt undertrykkelse (SOC) medium.
- Kork på røret og inkuberes i en orbital rystemaskin ved 200 opm ved 37 ° C i en time.
- Spre 10-50 ul fra hver transformasjon på en forvarmet LB-plate (forvarmet ved 37 ° C) + hensiktsmessig selektive antibiotikum (avgjøre den selektive antibiotikum basert på typen av kommersiell kloningsvektor brukes). Inkuber platene ved 37 ° CO / N.
- Plukk ~ 10 kolonier for mini prep plasmid rensing, ved hjelp av et kommersielt kit. Mini-prep plasmid rensing er generelt utført som følger.
MERK: Buffer navnene er spesifikke for den kommersielle kit brukt, men deres generelle funksjoner er like.- Vaksinere de enkeltkolonier i to- 5 ml LB-medium inneholdende den riktige selektive antibiotikum (bestemt på grunnlag av den type som brukes kommersielt vektor).
- Inkuber i omtrent 8 timer ved 37 ° C under kraftig risting (~ 300 rpm).
- Høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 10 min.
- Resuspender pelleten i 250 pl buffer resuspensjon. Bland og virvle å fullstendig spre pelleten.
- Lyse bakteriecellene ved tilsetning av 250 pl av lyseringsbuffer, blandes grundig ved å snu rørene 4 - 6 ganger.
- Nøytralisere lysat i nøytralisering buffer og invertere 4 - 6 ganger for å blande. Sentrifuger i 10 min på ~ 17 900 xg på en table-top mikrosentrifuge.
- Overfør supernatanten fra forrige trinn til en spin kolonne. Sentrifuger igjen på ~ 17 900 xg i 30 - 60 s.
- Vask spinnkolonne ved å tilsette 0,75 ml vaskebuffer og sentrifuger i 30 - 60 s. Kast gjennomstrømning.
- Sentrifuger i ytterligere 1 min til Remove rester av vaskebuffer. Plasser spinnkolonne i et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør. For å eluere DNA, tilsett 50 pl vann til sentrum av hver kolonne. La stå i 1 min, og sentrifuger i 1 min.
3. Analyser Renset Plasmider for nærvær Sett
- Begrensning Digest:
- Sett opp en restriksjonskutting for å bestemme tilstedeværelsen av innskuddet ved spaltning av plasmidet med restriksjonsenzymene anvendt for å klone innsatsen. En typisk dobbelt restriksjon fordøye reaksjon som følger: 1 ug av renset plasmid, 1 ul av hvert restriksjonsenzymer, 2 ul 10 x restriksjonskutting buffer + 2 pl BSA (hvis aktuelt), X ul vann (til totalt 20 mL)
- Bland forsiktig og inkuber ved anbefalt temperatur (varierer fra ett enzym til en annen).
- Analyser begrensning fordøye reaksjon på 1% TBE agarosegel, kjører på 100 V i 1 time og ser for drop-out av passende størrelse.
- PCR-analyse:
- Sett opp en PCR med det rensede plasmid, ved å bruke primere fra den kommersielle vektor regionen for å forsterke inne i innsatsen eller overgangen mellom vektoren og innskuddet. Vanlige primere er M13 forover og bakover og T3 / T7 primere.
- I denne protokoll ved å bruke følgende PCR sykkel betingelser: en innledende hold på 24 ° C, deretter 2 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 18 sykluser ved 98 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sek, og 72 ° C i 2 min. Utføre en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 5 minutter etterfulgt av en ubestemt hold ved 4 ° C.
- Belastnings PCR-produkter på en 1% agarosegel TBE og kjørt i 100 til 120 V i 1 time.
- Sekvensering:
- Send den rensede plasmid til en kommersiell sekvense innretning for å analysere og bekrefter nærvær av innsatsen.
- Når den korrekte konstruksjon blir oppnådd ved å bruke den for det andre trinnet av kloning (inn i anlegget binær vektor).
MERK: Trinnene 02.03 til 03.03kan elimineres hvis kloning er ferdig i ett trinn.
4. Kloning inn i Plant Binary Vector (PRI909) og E. coli Transformation
- Sett opp en dobbelt begrensning fordøye reaksjoner for å linearisere anlegget binær vektor og isolere den tidligere klonet innsatsen ved hjelp av de samme restriksjonsenzym-seter som ble lagt til primerene (trinn 2.2).
- Analyser restriksjonsspaltninger bruker gel elektroforese, kjører på 100 V, 1 - 2 timer. Skjær innsatsen og den lineariserte plante binær vektor fra gelen.
- Bruke et kommersielt kit å rense gel produkter. Henvise til produsentens håndbok.
- Sett opp en ligeringsreaksjon for å ligere innsatsen inn i anlegget binær vektor. Innsatsen til vektor forholdet avhenger av størrelsen på innsatsen og anlegget binær vektor. I denne protokollen den LIS1 innsatsen var 6,5 kb og anlegget binær vektor var 9 kb. Derfor bruker en 1: 2 innsatsen til vektor ratio.
5. Electroporation inn Agrobacterium tumefaciens elektrisk kompetente celler
- Tine en ampulle med Agrobacterium tumefaciens elektrisk kompetente celler på is.
- Tilsett 1 ng av binær vektor plasmid-DNA i 20 pl av kompetente celler, på is, og bland forsiktig.
- Chill en 0,1 cm elektroporering kyvette på is.
- Overføre vedkommende celle / DNA mix til electroporation kyvetter, og trykk for å samle opp blandingen på bunnen. Sett kyvetten i electroporator maskin og puls (spennings- og tidsbetingelser avhenger av størrelsen av kyvetten og electroporator brukes).
- Tilsett 1 ml SOC materiale og overføre cellene til en 15 ml-rør.
- Inkuber i 1 time ved 28-30° C, rist ved 100 rpm. Platen 50 til 100 ul av celler på LB-agar + hensiktsmessig selektive antibiotikum (avhenge av planten binært plasmid og stamme av Agrobacterium anvendt i denne protokollen bruk 50 pg / ml kanamycin og 100 ug / ml streptomycin.).
- Inkuber platene opp til 48 timer ved 28 - 30 ° C.
- Gjenta trinn 2.5 for koloni utvalg og plasmid rensing.
- Gjenta trinn 3 for å analysere plasmid og sjekke integriteten av innsatsen og T-DNA før du bruker konstruere en blomstrete-dipping. Gjenta trinn 3.2, ved hjelp av flere PCR-primere i hele innsatsen regionen og på tvers av T-DNA-områder og ved sekvensering som i trinn 3.3.
MERK: I denne protokollen fire forskjellige primere ble utformet på tvers av T-DNA og 10 primere over innsatsen. - Når tilstedeværelsen av anlegget binære plasmid i den valgte Agrobacterium kolonien er bekreftet, place celler In 50% glyserol og oppbevares ved -80 ° C. Butikkværende kolonier på plate ved 4 ° C hvis de skal brukes i løpet av en uke 7.
6. Blomster-Dipping
MERK: 2 dager før floral-dipping:
- Vokse Agrobacterium celler til den stasjonære fasen (OD 600 mellom 0,5 - 1 er akseptabelt) i LB + egnede antibiotika i flytende medier.
MERK: Dette er det samme antibiotikum som i trinn 5.6, basert på planten binær vektor og typen av Agrobacterium-stammen anvendes. - Start kultur med 1: 100 fortynninger av en mettet (5 ml), O / N kultur og vokse i 24-48 timer ved 28-30 ° C under risting ved 150 rpm. Kulturen burde ha nådd midlogarithmic fase og mer sannsynlig vil bli nærmer seg eller i en stasjonær fase. OD på ca. 0,8 (igjen OD mellom 0,5 til 1 er alle akseptable) 8. Utlevering av cellene ved sentrifugering ved 5000 xg ved RT.
- Resuspender cellene i infiltrasjons medium (5,0% sukrose + 0,05 til 0,003% Silwet L-77). For den første runden av dipping, bruker 0,05% Silwet-77. For det andre og tredje rundene, redusere konsentrasjonen til 0,03% (beskrevet i diskusjon).
- Fortsett med floral-dip trinn. Lå anlegget på siden og dyppe bare de synlige knopper i infiltrasjonsmedium i 1-2 min. Forlater anlegget på sin side og dekke den med plastfolie for å opprettholde høy luftfuktighet i kuppelen (figur 3).
- På neste dag, plassere anlegget i oppreist stilling og opprettholde normalt.
- Når knoppen blir større (vanligvis etter ca 10 - 14 dager), gjenta trinn 06.01 til 06.04. Reduser dipping tid til 30 - 60 s og Silwet-77 konsentrasjon til 0,003%.
- Vedlikeholde anleggene normalt inntil deres frø er moden og klar til å bli samlet (figur 4).
7. Valg av Positive Transformants med direkte PCR
- Purke T1 frø på jord som i trinn 1.1.
- Alternativt gjør Murashige og Skoog basalsaltmedium (MS-medium) ved å tilsette 2,2 g MS-medium + 4 g agar i 500 ml vann. Autoklav og hell i små blomsterpotter. Oppbevares i 4 ° C inntil brukt.
- Sår frøet ved å plassere dem på den størknet MS medium. Holde under lang dagslys (14 timers lys og 10 timer mørke). Frøene vil spire i ca 4-6 dager (figur 5).
- Bruk ett frø fra hver blomst som et utgangspunkt. Hvis ingen positiv -transformant oppnås, gjenta dette trinnet ved å plukke et annet frø fra blomsten.
MERK: Test ulike frø fra de samme blomstene, fordi i noen tilfeller ikke alle frø fra en blomst vil bli forvandlet. Velge tilleggs frø fra eksperimentelle blomster er noen ganger nødvendig.
- Sjekk på frøplantene regelmessig. I ca 10 - 14 dager etter spiring, når santlater utvikle, teste plantene med direkte PCR.
- Forberede blad DNA ekstrakt ved å kutte 2-3 blader (5-10 mg i vekt) fra hver frøplante og plassere dem i en mikro tube.
- Legg 180 ul 50 mM NaOH i hvert rør, og inkuber i 10 min ved 95 ° C.
- Nøytralisere ekstrakten ved tilsetning av 20 pl av 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
- Bruk 1 pl av ekstraktet i den direkte PCR-reaksjon, ved anvendelse av primere utformet på tvers av T-DNA eller innsatsen (figur 7), for å velge ut for positive transformanter.
- I denne protokoll, bruke direkte PCR med en innledende hold på 24 ° C, deretter 2 minutter ved 98 ° C, etterfulgt av 40 sykluser av (98 ° C i 10 sekunder, annealing trinn i 15 sekunder, og et forlengelsestrinn ved 68 ° C). Utføre en avsluttende forlengelsestrinn ved 68 ° C i 5 minutter etterfulgt av en ubestemt hold ved 4 ° C. (Se tabell 1 for detaljer om primere, annealing temperaturer og skjøte ganger for syklusene).
- Identifisere positive transformanter og dyrke dem til forfall. Hvis frøene ble spirer i MS medium, transplantasjon til jord i en større pott (Figur 5).
Representative Results
Figur 1-4 illustrerer noen av trinnene i protokollen. I figur 1 og 2, bladene rundt blomsterstanden knopper er kuttet for å avsløre dem til Agrobacterium celler og de ulike bud etapper som ble brukt til å utvikle protokollen. Figur 3 viser prosessen med lin floral-dip. Figur 4 viser en eksempel på hvordan de viktigste og sidegreiner kan merkes og hvordan enkelte blomster kan spores og identifiseres. Figur 5 viser hvordan T1 progenies kan spirer på MS plante media og deretter transplantert til jord for modenhet. Figur 6 illustrerer hvordan vill typen lin kan unnslippe høye konsentrasjoner av kanamycin, bekrefter tidligere funn i litteraturen 6,9,14.
Figur 7 viser et eksempel på direkte PCR-amplifisering fra positive transformanter T1. Den T1 blomster ble samlet inn fra main og sideskudd av en enkelt T0 plante. Som det kan ses fra den direkte PCR, 8/12 T1 planter testet positive ved PCR, og er forsterket på de forskjellige områder på tvers av T-DNA. Våre primere ble også utformet mellom LIS-en innsats og flere kloningsseter (Figur 7B og C). Vi brukte ytterligere primere fra anlegget binær vektor for å forsterke forskjellige segmenter av T-DNA, slik som den venstre kant og en NOS-terminator (data ikke vist) eller rett kant, og det multiple kloningssete (figur 7D). Primere spesifikke for LIS-1-innskuddet ble også brukt i denne protokoll (data ikke vist). En liste over primere er gitt i tabell 1. Imidlertid sekvensene av disse primere er avhengig av sekvensen av T-DNA-anlegg binære vektoren og innskuddet anvendt for blomster-dip. Vi har også bemerket at det var ingen signifikant forskjell i transformasjonsraten mellom blomster samlet fra de viktigste og sidegreiner.
Figur 1. Cutting bladene rundt de primære blomsterstanden knopper å utsette dem for de Agrobacterim celler. (A) Knoppene er dekket av løv. (B) Løv har blitt kuttet rundt knoppene å avsløre dem. (C) Forstørret bilde fra anlegget i (A) etter klipping å utsette knopper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. De ulike bud etapper som ble brukt i denne protokollen for å finne den beste scenen for å bruke for floral dukkert. (A) Den tidlige stadium knopp er den tilnærmet tely 2 mm. (B) Den midterste fasen knopp er ca 5 mm. (C) The Late scenen knopp er ca ca 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Prosessen med lin floral-dipping. (A) De primære inflorescences er dyppet i infiltrasjons media inneholder Agrobacterium celler. (B) Forstørret fra (A). (C) De dyppet planter er lagt flatt til neste dag, og de dyppet grenene er dekket med plast for å opprettholde høy luftfuktighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 4. Prosessen med blomst sporing og frøsamlinger, fra T0 behandlet planter (A) Et eksempel av hele anlegget med den viktigste grenen (den høyeste grenen i midten) og sidegreiner (B - D). En . eksempel på blomstene fra de ulike grenene (E) Et eksempel på frøene som samles inn fra enkelte blomster (merket a - k). fra den viktigste grenen Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Den T1 spirene dyrkes uten antibiotika utvalg. (A) T1 frø erspirer på MS anlegget media. (B) Positive transformanter, som bestemmes ved direkte PCR, blir transplantert til jord og vokst til forfall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Antibiotika flukt, et problem for T1 utvalg, er overveldet av direkte PCR-screening. (A) Wild-type lin frø spirer på MS plante media uten antibiotika. (B) Wild-type lin frø spirer på MS plante media + økende konsentrasjoner kanamycin (200 ug / ml, 600 pg / ml, 1 mg / ml). (C) Vill-type linfrø spirer på MS plantemateriale med 2 mg / ml kanamycin. (D) PCR fra villtype-lin og T1 frøplante hjelp kanamycin primere, alt amplsert kanamycingenet (legender: EZ1: DNA markør, FlaxS, vill-type flaxS, C: kontrollere non-dyppet gren, Ma: T1 avkom fra blomst "a" hentet fra den viktigste grenen, Sc, Sd, Se, Sf: T1 progenies av forskjellige blomster "c, d, e, f" samlet inn fra sidegren, W:. no-DNA) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Et eksempel på vellykket PCR presiseringer av T1 progenies ved hjelp av direkte PCR-metoden. (A) Diagram av Plant binær vektor + klonet LIS-en innsats. Blå piler indikerer posisjonen av PCR-primere som brukes i direkte PCR-screening (modifisert fra Takara). (B) PCR med primere M13F + 3 '(C) PCR med primere M13R + 18a
| Forward primer sekvens kilde | sekvensen 5'-3 ' | Revers primer sekvens kilde | Sekvensen 5'-3 ' | Annealing Temprature (° C) | Extension Tid (Sec) | Forventet størrelse (bp) |
| M13F (T-DNA) | CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG | 3 '(LIS-en innsats) | GAGGATGGAA GATGAAGAAGG | 57 | 40 | 450 |
| 18a (LIS-en innsats) | TATTTTAACCC | M13R (T-DNA) | ATTAGGCACC CCAGGCTTTA | 57 | 40 | 520 |
| MCS (T-DNA) | TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG | RB (T-DNA) | TTTAAACTGA AGGCGGGAAA | 60 | 20 | 200 |
| LB (T-DNA) | TTTGATGGTG GTTCCGAAAT | NOS (T-DNA) | GAATCCTGTT GCCGGTCTT | 60 | 30 | 380 |
| NPTII (T-DNA) | GCGATACCGT AAAGCACGAG | NTPII (T-DNA) | GCTCGACGTT GTCACTGAAG | 65 | 45 | 502 |
Tabell 1. Noen av primerne anvendt for den direkte PCR-testing.
Discussion
I enkelte plantearter, for eksempel lin (Linum usitatissimum), har vellykket plante transformasjon vært begrenset. Tidligere har transformasjon i lin kreves en agrobakteriuminfeksjon av såret og co-dyrking, søker biolistic partikler eller ved hjelp av ultralyd ultralyd, etterfulgt av regenerering; en prosess som er både lange og utsatt for å bli ledsaget av mange mutasjonshendelser. Videre krever utvelgelsen av disse teknikkene ved bruk av antibiotiske seleksjonsmarkører slik som kanamycin. Det har imidlertid blitt bemerket i litteraturen at denne metoden for utvelgelse produserer mange falske positiver, som lin har en tendens til å unnslippe høye konsentrasjoner av antibiotika 6,9,14. En annen ulempe ved de tidligere teknikker i lin transformasjon vært den lave transformasjons prisene 2,6.
I protokollen som er beskrevet her, ble Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dipping visttil å resultere i en høy transformasjonsfrekvens for lin (50 - 60%). Transformanter ble hentet fra blomster dyppet og samlet inn fra hoved- og sidegreiner. Utvalg av positive transformanter ble rett og slett gjort ved å dyrke T1 planter på jord og screening sine blader snart etter at de spirer, og unngår bruk av antibiotika utvalg, et skritt tidligere brukt som en norm i floral-dip for andre plantearter. Ved å utføre direkte PCR-testing av blader, og bruke de riktige T-DNA primere, kan positive transformanter være raskt valgt. Denne teknikk er enkel, billig og lett å utføre, men resulterer i en mye høyere transformasjonsrate enn de som tidligere er rapportert for Arabidopsis og andre plantearter ved hjelp av denne metoden 1,10,12. Det er også den høyeste rapporterte transformasjonsraten for lin.
Imidlertid er det kritiske trinn i fremgangsmåten, inkludert valg av det beste blomsterstadiet, og det beste overflateaktive konsentrasjon, slik atden Agrobacterium kan trenge inn i planteceller uten å drepe de blomster organer. Hvis et tidlig stadium knopp benyttes (figur 2A) med høy Silwet-77-konsentrasjon på mer enn 0,05%, vil blomsten ikke utvikle eller sette frø. Hvis sent knopp scenen brukes (figur 2C), selv om transformasjonen kan fungere, vil det skje på en mye lavere pris. Lignende resultater ble oppnådd med Arabidopsis floral dukkert transformasjon 1,4. For denne protokollen, ble alle flor stadier testet med forskjellige Silwet-77-konsentrasjoner og den beste fasen ble bestemt til å være den midtre knopp stadium (figur 2C) med Silwet-77 0.05% for den første dyppingen, etterfulgt av en andre dyppe i sen knopptrinnet (figur 2C) med en litt redusert Silwet-77 konsentrasjon på 0,03%. Omformingen også fungert bra med tidlig stadium knopp (figur 2A) med et lavt Silwet-77 konsentrasjon på 0,003%, etterfulgt aven andre dyppe med midtknoppstadiet (figur 2B) ved høyere Silwet-77 konsentrasjon på 0,05%.
I denne protokollen ble noen andre parametere forsøkt å optimalisere transformasjonsraten, men funnet å ha noen effekt på det endelige utfallet. Eksempler er å forlenge tiden etter dypping at plantene lå på sin side og dekket av plast fra en dag til to dager; ved hjelp av en OD på mer enn 1 for Agrobacterium kultur, i stedet for 0,5 til 1; å øke dyppetiden til 5 - 15 minutter i stedet for 1 - 2 min. Igjen har vi ikke merket noen effekt på transformasjonsraten ved hjelp av disse strategiene. De mest effektive faktorer, men ble funnet å være ved hjelp av sunne planter i de riktige blomster trinn, og ved å bruke den beste Silwet-77 konsentrasjon. Vi la merke til at to dipping intervaller, fungerer liksom bedre enn én gang, selv om en gang dipping fungerer også.
Modifikasjon til denne protokollen kan oppnås ved reducing av Silwet-77 konsentrasjon til så lite som 0,003% i det andre eller tredje dypping. Siden Silwet-77 er giftig, for høy konsentrasjon resulterer i blomster utvikler dårlig, noe som resulterer i ingen frø utbytte. Dipping frekvensen kan reduseres til en, med den andre eller tredje hendelser eliminert hvis plantene ikke ser sunn og knoppene er ikke god utvikling.
En viktig begrensning ved denne teknikk er den lave antall blomster produsert av lin, det begrensede antall frø oppnådd fra hver blomst, og den lange levetid av lin. Det tar 6 - 8 uker fra frø såing å ha de primære knopper klar for første dipping og en ytterligere 8-10 uker etter dipping å komme til T1 generasjon. Totalt, et utvalg av 5 - er 6 måneder ha for å få T1 generasjon. I motsetning til andre plantearter, som blomstrer når som helst på året, noen lin varianter blomst bedre på bestemte tider av året. Så gjennomtenkt planlegging for denne teknikken er viktig.
Agrobacterium - mediert plante transformasjon via floral-dip er en anvendelig og effektiv metode for lin transformasjon og kan brukes til å erstatte de tidligere brukte teknikker for lin transformasjon. De modifikasjoner av floral-dip metode i denne protokollen vil være aktuelt for bruk med noen andre plantearter og ikke begrenset til lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| Potting soil | |||
| Greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | Promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4595-01 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | ||
| Electroporator and cuvettes | Bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| Spinner | |||
| Plastic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | Sigma | M5524 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 |
References
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
- Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
- Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
- Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2 (16), (2006).
- Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
- Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
- Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).
- Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).
- Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
- Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
- Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).
