Summary
Hier presenteren we een protocol om vlas te transformeren met behulp van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van planten via florale-dip. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en goedkoop, maar levert een hogere transformatie tarief dan de huidige beschikbare methoden voor vlas transformatie.
Abstract
Agrobacterium-gemedieerde plantentransformatie via floral dip is een veel gebruikte techniek op het gebied van plantentransformatie en gerapporteerd succesvol voor vele plantensoorten. Echter, vlas (Linum usitatissimum) transformatie door florale-dip niet gemeld. Het doel van dit protocol is dat Agrobacterium stellen en floral dip werkwijze kan worden gebruikt om transgene vlas genereren. We tonen aan dat deze techniek is eenvoudig, goedkoop, efficiënt, en nog belangrijker, geeft een hogere omzettingssnelheid dan de huidige beschikbare wijzen van vlas transformatie.
Samengevat, werden bloeiwijzen van vlas gedompeld in een oplossing van Agrobacterium die een binaire vector plasmide (T-DNA-fragment plus het Linum insertiesequentie, LIS-1) 1 - 2 min. De planten werden plat gelegd op hun kant voor 24 uur. Daarna werden planten gehandhaafd onder normale groeiomstandigheden tot de volgende behandeling. Het proces3 keer, met ongeveer 10 - - s van dompelen werd 2 herhaald 14 dagen intervallen tussen dompelen. De T1 zaden werden verzameld en ontkiemd op de grond. Na ongeveer twee weken werden behandeld nakomelingen getest door directe PCR; 2-3 bladeren werden gebruikt per plant plus de geschikte T-DNA-primers. Positieve transformanten werden geselecteerd en gegroeid naar volwassenheid. De omzettingssnelheid was onverwacht hoog, 50 - 60% van de zaden van behandelde planten positief transformanten. Dit is een hogere omzettingssnelheid dan die gerapporteerd voor Arabidopsis thaliana en andere plantensoorten, met behulp van bloemen-dip transformatie. Het is ook de hoogste die tot dusver gerapporteerd, vlas transformatie met andere methoden voor transformatie.
Introduction
Vlas (Linum usitatissimum) is een belangrijk gewas op grote schaal gekweekt voor zijn vezels en oliën. Transformatie van de vlas genoom mogelijk technieken zoals verwonding Agrobacterium infectie en het tezamen kweken in weefselkweek, aanbrengen biolistische deeltjes of ultrageluid sonicatie gevolgd door regeneratie. Maar deze technieken hebben vele nadelen, waaronder neiging om veel mutatie gebeurtenissen en langere tijd de transgene lijnen te verkrijgen. Sommige van deze methoden kan ook duur en vereisen deskundige en efficiënte manipulatie van de instrumenten, resulterend in lage herstel zaailingen. Belangrijker nog, deze techniek die vaak resulteren in een lage transformatie tarieven 2,6.
Agrobacterium-gemedieerde plantentransformatie via floral dip is een eenvoudige en efficiënte aanpak om transgene planten te genereren. Het is routinematig en met succes gebruikt voor vele plantensoorten zoals Arabidopsis Thalianeen 1,4, Medicago truncatula 11, 12 tomaat, tarwe en maïs 13 10. Er is echter niet gezien als een levensvatbare techniek voor vlas transformatie door verschillende factoren, zoals het lage aantal bloemen door vlas, beperkt aantal zaden verkregen uit elke bloem, het grote zaadgrootte en de dikke laag, die ook problematisch dergelijke genetische transformatie proces kan zijn. Daarnaast is de selectie segment van de bloemen-dip techniek vereist kiemende getransformeerd zaden op een plant media met een antibioticum, met getransformeerd nakomelingen onderscheiden op basis van hun vermogen om te ontkiemen en groen blijven, terwijl niet-getransformeerde nakomelingen ofwel niet ontkiemen of ontkiemen maar bleekwater snel uit en sterven. In de huidige literatuur is geconstateerd dat wildtype vlas neiging hoge concentratie antibioticum selecties ontsnappen, waardoor vals positieve resultaten en de selectie van T1 nageslachten gebaseerdeover antibioticaresistentie moeilijker 6,14. Ook bij een hoge concentratie van antibioticum toegevoegd aan het selectiemedium, de snelheid van de waargenomen verandering drastisch gedaald 9.
In dit protocol, gebruikten we Agrobacterium en florale-dip werkwijze om een lijn van vezelvlas Stormont Cirrus (responsief en kunststof), waarvan is aangetoond reageren spanningen in het milieu door het veranderen van het genoom 3,5 transformeren. Tegen het antibioticum ontsnapping probleem op te lossen, hebben wij ervoor gekozen om directe PCR testen van DNA van T1 bladeren te doen, in plaats van de selectie door het toevoegen van het antibioticum aan de plant media. We maakten gebruik van de eenvoudige anatomie van vlas specifieke bloemen bij de behandeling te volgen. Dit volgsysteem toegestaan selectie van zaden van bepaalde bloemen en kieming op de bodem zonder toevoeging van antibiotica. Positieve transformanten werden gewoon geïdentificeerd door het testen van DNA verkregen uit de bladeren met behulp van de snelle en efficiënte methode of directe PCR. Onze resultaten tonen aan dat de bloem-dip methode werkt goed in deze lijn vlas en verrassend tot een zeer hoge omzettingssnelheid (50 - 60%), hoger dan eerder waargenomen voor Arabidopsis thaliana, die naar verluidt 0,1-1 % 1, en ook hoger dan andere plantensoorten 10,12. We testten ook een verscheidenheid van lijnzaad (vlas olie), Bethune (stabiel en niet-responsief) en onze voorlopige gegevens blijkt dat floral dip werkt ook voor deze variëteit van vlas.
Het doel van dit protocol is aangetoond dat Agrobacterium en bloem-dip kan worden gebruikt om transgene vlas genereren. We tonen aan dat deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en sneller dan andere methoden van vlas transformatie. Belangrijker resulteert in een veel hogere omzettingssnelheid dan andere methoden van vlas transformatie 2,6. De anatomie van Arabidopsis thaliana, die vele takken en bloemen heeft, makes het moeilijk om onderscheid te maken ondergedompeld en niet-ondergedompeld bloemen op dezelfde plant. Daarom is een groot aantal zaden, ongeveer 20.000 zaden per plant, moeten worden gescreend om positieve transformanten 8 identificeren. Vlas, daarentegen, heeft minder vertakkingen (een hoofdtak en enkele zijtakken) en minder bloemen produceert ongeveer 100 zaden per plant, waardoor het afzonderlijke bloemen te volgen en om specifiek zaad bij screening proces te selecteren.
Wij stellen voor dat de bloemen-dip is een toepasbare methode om eventuele verwante soort van vlas, een geslacht van ongeveer 200 soorten te transformeren. Deze methode geeft veel hogere omzettingssnelheid dan andere methoden van vlas transformatie. We stellen ook dat de directe PCR-screening van T1 blad DNA is een efficiënte manier om het probleem van de antibioticaresistentie ontsnapping die vaak produceert veel valse positieven te overwinnen. Directe PCR screening kan worden toegepast op elke andere plantensoorten en niet beperkt to vlas. De eenvoudige zaad volgen toegepaste techniek in dit protocol kan worden toegepast op andere plantensoorten met vertakking anatomie vergelijkbaar vlas.
Protocol
1. Groeiende de Planten
- 6 weken voor dompelen, vullen 5 inch potten met aarde en zaaien lijnzaad ¼ inch diep in de bodem (4 zaden per pot). Zorg ervoor dat de bodem onderneming over de zaden. De planten water regelmatig en te onderhouden in lange daglicht (14 uur licht en 10 uur donker).
- Controleer planten regelmatig voor primaire bloeiwijzen (clusters van organen bloemen '). De planten zijn klaar voor transformatie als de knoppen zichtbaar en hebben net gevormd in de bloeiwijze (figuur 1 en 2). Om de knoppen te zien, snijd de bladeren rond deze indien nodig.
LET OP: Het gebruik van de beste bloem stadium is kritisch en wordt gedetailleerd beschreven in de discussie.- Gebruik de belangrijkste tak van de fabriek voor de experimentele behandeling als het produceert meer bloemen dan de kant takken. Gebruik de zijtakken hetzij als controles (niet te dompelen) of voor andere experimentele behandelingen.
- U kunt ook gebruik maken van de hoofd- en zijtakken van dedezelfde plant voor de experimentele behandeling en gebruik een andere plant als een controle of voor andere experimentele behandelingen. Gebruik labels om individuele vestigingen en individuele bloemen met de datum en de aard van de behandeling te markeren.
2. Klonering en transformatie in Escherichia coli (E. coli) Cellen
- Kloon de fragment / gen van interesse in de meervoudige kloneringsplaats van een plant binaire vector die de T-DNA.
- Voeren klonen in een stap of twee stappen.
- Direct klonen kleine inserts in dit protocol (~ 500 bp) in de plant binaire vector. In dit protocol gebruiken de plant binaire vector (PRI909). Gebruik anders welke andere plant binaire vectoren in een soortgelijke strategie.
- Als alternatief klonen grote inserts (≥6.5 kb) in twee stappen: eerst met behulp van een algemene commerciële kloneringskit (niet specifiek te planten), dan subkloneren in de plant binaire vector.
- Voeren klonen in een stap of twee stappen.
- Het opzetten van een PCR reactie voor het gen van belang te amplificeren. Ontwerp van de primers met restrictieplaatsen aan het 5 '(volgens de meervoudige kloneringsplaats van de plant binaire vector wordt gebruikt).
- Voer een standaard PCR met genomisch vlas DNA met de volgende cyclusomstandigheden: een eerste greep 24 ° C, daarna 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 30 cycli van 98 ° C gedurende 5 seconden, 60 ° C gedurende 15 sec, en 72 ° C gedurende 2 min. Voer een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 min, gevolgd door een onbepaald greep bij 4 ° C.
- Afzonderlijke PCR-producten op 1% Tris / Boraat / EDTA (TBE) agarosegel, lopen de gel bij 100 V gedurende 1 uur. Zuiver de producten uit de gel en kwantificeren via Nanodrop.
- Stel het ligatiemengsel het PCR product in de commerciële kloneringsvector kloneren. Volg de protocol van de fabrikant.
- Transformeer de ligatiemengsel in chemisch competente E. coli-cellen als volgt.
- Voeg 2 pl van het ligatiemengsel in een flacon van chemically competente E. coli-cellen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Heat shock de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C (Heat shock tijd en temperatuur hangt af van het type gebruikte cellen).
- Incubeer op ijs en voeg 250 ul van RT super optimale bouillon met catabolietonderdrukking (SOC) medium.
- Cap de buis en incubeer in een orbitale schudder bij 200 rpm bij 37 ° C gedurende één uur.
- Spread 10-50 gl van elke transformatie op een voorverwarmde LB plaat (voorverwarmd bij 37 ° C) + geschikte selectieve antibioticum (bepalen selectieve antibioticum gebaseerd op het soort commerciële kloneringsvector gebruikt). Incubeer de platen bij 37 ° CO / N.
- Pick ~ 10 kolonies voor mini prep plasmidezuivering, met behulp van een commerciële kit. Mini prep plasmide zuivering wordt gewoonlijk uitgevoerd als volgt.
OPMERKING: Buffer namen zijn specifiek voor de commerciële kit gebruikt, maar de algemene functies zijn vergelijkbaar.- Inoculeer de enkele kolonies in 2- 5 ml LB medium dat het geschikte selectieve antibioticum (bepaald op basis van het soort commerciële vector gebruikt).
- Incubeer gedurende ongeveer 8 uur bij 37 ° C onder krachtig schudden (-300 rpm).
- Oogst de cellen door centrifugatie bij 6000 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de pellet in 250 ul resuspensie buffer. Mix en vortex volledig uiteen te drijven de pellet.
- Lyse de bacteriële cellen door toevoeging van 250 ul van de lysis buffer, meng zorgvuldig door de buizen 4 - 6 keer.
- Neutraliseren het lysaat in de neutralisatie buffer en omkeren 4-6 keer om te mengen. Centrifugeer gedurende 10 min bij ~ 17.900 xg op een tafelblad microcentrifuge.
- Breng de supernatanten uit de vorige stap een spinkolom. Centrifugeer opnieuw bij ~ 17.900 xg gedurende 30-60 sec.
- Was de kolom rotatie door toevoeging van 0,75 ml wasbuffer en centrifugeer gedurende 30-60 sec. Gooi de doorstroom.
- Centrifugeer gedurende nog 1 minuut Remove resten van het wassen buffer. Plaats de spin kolom in een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. DNA elueren, voeg 50 ul water aan het midden van elke kolom. Laat staan gedurende 1 min, en centrifugeer 1 min.
3. Analyseer de gezuiverde plasmiden voor de Aanwezigheid van Insert
- Beperking Digest:
- Stel een restrictiedigestie om de aanwezigheid van het insert bepaald door digestie van het plasmide met de restrictie-enzymen gebruikt voor de insertie klonen. Een typische dubbel restrictiedigestie reactie als volgt: 1 ug gezuiverd plasmide, 1 pi van elk restrictie-enzymen, 2 pl 10x restrictiedigestie buffer + 2 pl BSA (indien van toepassing), X ul water (in totaal 20 ui)
- Meng voorzichtig en incubeer bij aanbevolen temperatuur (varieert van één enzym naar de andere).
- Analyseer de restrictiedigest reactie op 1% TBE agarosegel, draaien op 100 V gedurende 1 uur en kijk voor drop-out van de juiste maat.
- PCR-analyse:
- Stel een PCR met het gezuiverde plasmide, met primers van de commerciële vector regio amplificeren binnen het inzetstuk of de verbinding tussen de vector en het insert. Gemeenschappelijke primers zijn M13 vooruit en achteruit en T3 / T7 primers.
- In dit protocol de volgende PCR-cycling condities: een eerste greep 24 ° C, daarna 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 18 cycli bij 98 ° C gedurende 5 seconden, 60 ° C gedurende 15 sec en 72 ° C gedurende 2 min. Voer een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 min, gevolgd door een onbepaald greep bij 4 ° C.
- Belasting PCR producten op een 1% TBE agarosegel en draaien voor 100-120 V gedurende 1 uur.
- Sequencing:
- Stuur het gezuiverde plasmide commerciële sequencing faciliteit te analyseren en bevestigen de aanwezigheid van het insert.
- Zodra de juiste construct wordt verkregen, te gebruiken voor de tweede stap van klonering (in de plant binaire vector).
OPMERKING: Stappen 2,3-3,3kunnen worden opgeheven indien de klonen in één stap voltooid.
4. Klonen in de Plant binaire vector (PRI909) en E. coli Transformatie
- Stel een dubbele restrictiedigestie reacties op de plant binaire vector lineariseren en isoleer het eerder gekloneerde insert met dezelfde restrictie-enzymplaatsen die zijn toegevoegd aan de primers (stap 2.2).
- Analyseer de restrictiedigestie met gelelektroforese uitgevoerd bij 100 V gedurende 1-2 uur. Snijd de insert en de gelineariseerde planten binaire vector uit de gel.
- Gebruik een commerciële kit om de gel te zuiveren. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant.
- Het opzetten van een ligatie reactie op het inzetstuk in de plant binaire vector afbinden. Het inzetstuk naar vector verhouding afhankelijk van de grootte van het insert en de plant binaire vector. In dit protocol was de LIS1 insert 6,5 kb en de plant binaire vector was 9 kb. Vandaar, gebruik dan een 1: 2 insert naar vector-ratio.
5. Elektroporatie in Agrobacterium tumefaciens elektrisch Competent Cells
- Dooi een flacon van Agrobacterium tumefaciens elektrisch competente cellen op ijs.
- Voeg 1 ng van binaire vector plasmide-DNA tot 20 ul van competente cellen, op ijs, en meng voorzichtig.
- Chill een 0,1 cm elektroporatiecuvet op ijs.
- Breng de bevoegde cel / DNA-mix op de elektroporatie cuvetten, en tik op om het mengsel op de bodem te verzamelen. Plaats de cuvet in de electroporator machine en hartslag (spanning en tijd hangen af van de grootte van de cuvet en de elektroporator gebruikt).
- Voeg 1 ml SOC media en overdracht cellen aan een 15 ml buis.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 28-30° C, onder schudden bij 100 rpm. Plate 50 - 100 ul van cellen op LB agar + geschikte selectieve antibioticum (afhankelijk van de plant binaire plasmide en de stam van Agrobacterium gebruikt in dit protocol gebruik 50 ug / ml kanamycine en 100 ug / ml streptomycine.).
- Incubeer de platen tot 48 uur bij 28-30 ° C.
- Herhaal stap 2.5 voor kolonieselectie en plasmide zuivering.
- Herhaal stap 3 om het plasmide te analyseren en de integriteit van de insert en T-DNA controleren alvorens de construct voor florale dompelen. Herhaal stap 3.2 met behulp van meervoudige PCR-primers in het gehele insert regio en in de T-DNA regio en sequentiebepaling zoals in stap 3.3.
Opmerking: In dit protocol 4 verschillende primers werden ontworpen in het T-DNA en 10 primers in de insert. - Zodra de aanwezigheid van de plant binaire plasmide in de geselecteerde kolonie Agrobacterium bevestigd, plaats cellen in 50% glycerol en bewaar bij -80 ° C. WINKEL overblijvende kolonies op de plaat bij 4 ° C indien zij binnen een week 7 te gebruiken.
6. Bloemen-Dompelen
OPMERKING: 2 dagen voor floral-dipping:
- Groei Agrobacterium cellen de stationaire fase (OD600 tussen 0,5-1 aanvaardbaar) in LB + geschikte antibiotica in vloeibare media.
Opmerking: Dit zijn dezelfde antibioticum als in stap 5.6 op basis van de plant binaire vector en het type Agrobacterium-stam gebruikt. - Begin de kweek met 1: 100 verdunningen van een verzadigde (5 ml) O / N kweek en groei van 24 - 48 uur bij 28-30 ° C onder schudden bij 150 rpm. De cultuur moet midlogarithmic fase bereikt en waarschijnlijk zal naderen of stationaire fase 1. OD van ongeveer 0,8 (weer OD tussen 0,5 tot 1 zijn allemaal aanvaardbaar) 8. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 5000 xg bij KT.
- Resuspendeer de cellen in infiltratie medium (5,0% sucrose + 0,05-0,003% Silwet L-77). Voor de eerste ronde van dompelen Gebruik 0,05% Silwet-77. Voor de tweede en derde ronde, verminderen de concentratie tot 0,03% (beschreven in discussie).
- Ga verder met de bloemen-dip stap. Leg de plant op zijn kant en dompel alleen de zichtbare knoppen in de infiltratie medium voor 1-2 min. Laat de plant op zijn kant en dek het af met plasticfolie te hoge luchtvochtigheid in de koepel (figuur 3) te behouden.
- Op de volgende dag, plaatst u de plant in een rechtopstaande positie en normaal te houden.
- Wanneer de kiem groeit groter (meestal na ongeveer 10-14 dagen), herhaal dan de stappen 6,1-6,4. Verminder het dompelen tijd tot 30-60 sec en Silwet-77 concentratie tot 0,003%.
- Handhaaf de planten normaal tot hun zaden rijp en klaar om te worden verzameld (figuur 4).
7. Selectie van Positive Transformants met Direct PCR
- Zaai de T1 zaden op de grond als in stap 1.1.
- Als alternatief maakt Murashige en Skoog basale zout medium (MS-medium) door het toevoegen van 2,2 g van MS-medium + 4 g agar in 500 ml water. Autoclaaf en giet het in kleine potten. Laat de 4 ° C tot gebruik.
- Zaai het zaad door ze op de gestolde MS-medium. Houd onder lange daglicht (14 uur licht en 10 uur donker). Zaden ontkiemen in ongeveer 4-6 dagen (Figuur 5).
- Gebruik een zaad van elke bloem als uitgangspunt. Als er geen positieve transformant wordt verkregen, herhaalt u deze stap door het plukken van een ander zaad uit de bloem.
OPMERKING: Test verschillende zaden van dezelfde bloemen, omdat in sommige gevallen niet alle zaden van de ene bloem zal worden omgevormd. Selecteren extra zaden experimentele bloemen is soms noodzakelijk.
- Controleer op de zaailingen regelmatig. In ongeveer 10-14 dagen na ontkieming, wanneer truelaat ontwikkelen, testen van de planten met directe PCR.
- Bereid het blad DNA extract door snijden 2-3 bladeren (5-10 mg in gewicht) van elke zaailing en plaats ze in een microcentrifugebuis.
- Voeg 180 ul van 50 mM NaOH aan elke buis en incubeer gedurende 10 min bij 95 ° C.
- Neutraliseer het extract door toevoeging van 20 ui 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
- Met 1 pl van het extract in de directe PCR-reactie met primers in het T-DNA of het inzetstuk (figuur 7), om te selecteren op positieve transformanten.
- In dit protocol gebruik maken van directe PCR met een eerste greep 24 ° C, daarna 2 minuten bij 98 ° C, gevolgd door 40 cycli van (98 ° C gedurende 10 seconden, annealing stap gedurende 15 sec, en een extensiestap bij 68 ° C). Voer een laatste verlenging stap bij 68 ° C gedurende 5 min, gevolgd door een onbepaald greep bij 4 ° C. (Zie tabel 1 voor meer informatie over primers, gloeien temperaturen en uitbreiding tijden voor de cycli).
- Identificeren positieve transformanten en groeien ze naar volwassenheid. Wanneer de zaden werden ontkiemd op MS-medium, transplantatie bodem in een grotere pot (figuur 5).
Representative Results
Figuur 1-4 illustreren enkele van de stappen in het protocol. In de figuren 1 en 2, de bladeren rond de bloeiwijze toppen gesneden blootgesteld aan de Agrobacterium cellen en de verschillende kiem stadia die werden gebruikt om het protocol te ontwikkelen. Figuur 3 toont het proces van vlas floral dip. Figuur 4 toont een voorbeeld van de hoofd- en zijtakken geëtiketteerde en hoe individuele bloemen kunnen worden getraceerd en geïdentificeerd. Figuur 5 toont hoe de T1 nageslacht kan worden ontkiemd op MS plantmediasamenstellingen en daarna overgeplant in grond voor volwassenheid. Figuur 6 illustreert hoe Wild- soort vlas kan ontsnappen hoge concentraties kanamycine, bevestigt eerdere bevindingen in de literatuur 6,9,14.
Figuur 7 toont een voorbeeld van directe PCR-amplificatie van positief T1 transformanten. De T1 bloemen werden uit de main en zijscheuten van een enkele T0 plant. Zoals blijkt uit de directe PCR 12/08 T1 planten getest positief met PCR en de verschillende regio's in de T-DNA geamplificeerd. Onze primers werden ook ontworpen tussen de LIS-1 insert en de meervoudige kloneringsplaatsen (Figuur 7B en C). We gebruikten extra primers van de plant binaire vector verschillende segmenten van de T-DNA, zoals de linkergrens en de NOS terminator (data niet getoond) of de rechterrand en de meervoudige kloneringsplaats (Figuur 7D) amplificeren. Primers specifiek voor de LIS-1 insert werden gebruikt in dit protocol (gegevens niet getoond). Een lijst van primers is opgenomen in tabel 1. De sequenties van deze primers afhankelijk van de sequentie van het T-DNA plantaardige binaire vector en de insert voor de bloem-dip. We hebben ook opgemerkt dat er geen significant verschil in de omzettingssnelheid tussen bloemen verzameld uit de hoofd- en zijtakken.
Figuur 1. Het snijden van de bladeren rond de belangrijkste bloeiwijze knoppen om blootgesteld aan de Agrobacterium cellen. (A) De knoppen onder bladeren. (B) Bladeren werden uitgesneden rond de knoppen aan worden blootgesteld. (C) vergrote beeld van plantaardige in (A) na het snijden aan knoppen bloot. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. De verschillende kiem stadia die werden gebruikt in dit protocol om de beste podium om te gebruiken voor de bloemen duik te bepalen. (A) De vroege stadium bud is approxima tely 2 mm. (B) De middelste fase bud is ongeveer 5 mm. (C) het late stadium bud is ongeveer ongeveer 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Werkwijze vlas bloemen dompelen. (A) De primaire bloeiwijzen zijn gedoopt in de infiltratie media met de Agrobacterium cellen. (B) Vergrote uit (A). (C) De gedoopt planten worden plat gelegd tot de volgende dag, en de gedimde takken zijn bedekt met plastic te onderhouden hoge luchtvochtigheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 4. Werkwijze bloem tracking en zaad verzamelingen van T0 behandelde planten (A) een voorbeeld van de hele plant met de hoofdtak (de langste tak in het midden) en de zijtakken (B - D). An . voorbeeld van de bloemen uit de verschillende takken (E) Een voorbeeld van het verzameld van individuele bloemen zaden (met label A - k). van de belangrijkste tak Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. De T1 zaailingen worden gekweekt zonder antibiotische selectie. (A) T1 zadenontkiemd op de MS-fabriek media. (B) Positieve transformanten, zoals bepaald door directe PCR, worden getransplanteerd naar de bodem en uitgegroeid tot volwassenheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Antibiotica ontsnapping, een probleem voor T1 selectie, wordt overwonnen door directe PCR-screening. (A) Wildtype lijnzaad ontkiemd op MS planten media zonder antibiotica. (B) Wildtype lijnzaad ontkiemd op MS planten media + toenemende concentraties kanamycine (200 ug / ml, 600 ug / ml, 1 mg / ml). (C) wild-type vlas zaden ontkiemd op MS plantmediasamenstellingen met 2 mg / ml kanamycine. (D) PCR uit wildtype vlas en T1 zaailing met kanamycine primers, alle amplven de kanamycinegen (legendes: EZ1: DNA-merker, FlaxS, wild-type flaxS, C: controle van niet-gedoopt tak, Ma: T1 nageslacht van bloem "a" verzameld uit de belangrijkste tak, Sc, Sd, Se, Sf: T1 nakomelingen van verschillende bloemen "c, d, e, f" verzameld uit de zijtak, W:. no-DNA) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Een voorbeeld van een succesvolle PCR amplificaties van T1 nakomelingen met behulp van de directe PCR-methode. (A) Schematische weergave van het Plant binaire vector + de gekloonde LIS-1 insert. Blauwe pijlen geven de positie van PCR primers die in de directe PCR screening (gewijzigd van Takara). (B) PCR met primers M13F + 3 '(C) PCR met primers M13R + 18a
| Voorwaartse primer opeenvolging bron | sequentie 5'-3' | Reverse primer opeenvolging bron | Sequentie 5'-3 ' | Gloeien Temprature (° C) | Extensie (sec) | Verwachte grootte (bp) |
| M13F (T-DNA) | CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG | 3 '(LIS-1 insert) | GAGGATGGAA GATGAAGAAGG | 57 | 40 | 450 |
| 18a (LIS-1 insert) | TATTTTAACCC | M13R (T-DNA) | ATTAGGCACC CCAGGCTTTA | 57 | 40 | 520 |
| MCS (T-DNA) | TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG | RB (T-DNA) | TTTAAACTGA AGGCGGGAAA | 60 | 20 | 200 |
| LB (T-DNA) | TTTGATGGTG GTTCCGAAAT | NOS (T-DNA) | GAATCCTGTT GCCGGTCTT | 60 | 30 | 380 |
| NPTII (T-DNA) | GCGATACCGT AAAGCACGAG | NTPII (T-DNA) | GCTCGACGTT GTCACTGAAG | 65 | 45 | 502 |
Tabel 1. Een aantal van de primers die voor de directe PCR-test.
Discussion
In sommige plantensoorten, zoals vlas (Linum usitatissimum), succesvol plantentransformatie beperkt. Eerder heeft de transformatie in de sector vezelvlas een Agrobacterium-infectie vereist door verwonden en co-teelt, het aanbrengen van biolistische deeltjes of met behulp van ultrasone geluidsgolven, gevolgd door regeneratie; een proces dat zowel lang en gevoelig voor gepaard met vele mutatie gebeurtenissen. Bovendien is de selectie van deze technieken is het gebruik van antibiotica selecteerbare merkers zoals kanamycine. Er is echter geconstateerd in de literatuur die deze selectiemethode produceert veel valse positieven, vlas neiging om hoge concentraties antibiotica 6,9,14 ontsnappen. Een ander nadeel van de voorgaande technieken vlas transformatie de lage omzettingssnelheid 2,6 geweest.
In de hier beschreven protocol, Agrobacterium-gemedieerde transformatie van planten via florale-dompelen werd getoondresulteren in een hoge omzettingssnelheid vlas (50 - 60%). Transformanten werden verkregen van bloemen gedoopt en verzameld van hoofd- en zijtakken. Selectie van positieve transformanten werd gedaan door simpelweg groeiende T1 planten op de bodem en het screenen van hun bladeren kort nadat ze ontkiemd, het omzeilen van het gebruik van antibiotica-selectie, een stap die eerder gebruikt als een norm in bloemen-dip voor andere plantensoorten. Door het uitvoeren van directe PCR testen van bladeren en met de geschikte T-DNA primers, kunnen positieve transformanten snel worden geselecteerd. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk uit te voeren, maar resulteert in een veel hogere omzettingssnelheid dan eerder gerapporteerde Arabidopsis en andere plantensoorten met deze methode 1,10,12. Het is ook de hoogste gemelde transformatie tarief voor vlas.
Er zijn kritische stappen in de procedures inclusief de selectie van de beste bloemstadium en de beste surfactant concentratie, zodatAgrobacterium kan doordringen in de plantencellen zonder het doden van de bloemorganen. Als een vroeg knopstadium wordt gebruikt (figuur 2A) met een hoge Silwet-77 concentratie van meer dan 0,05%, zal de bloem niet ontwikkelen noch ingesteld zaden. Als late bud fase gebruikt (figuur 2C), hoewel de transformatie zou kunnen werken, zal optreden met een veel lagere snelheid. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Arabidopsis bloemen dip transformatie 1,4. Voor dit protocol werden alle bloemen fasen getest met verschillende Silwet-77 concentraties en de beste fase werd bepaald aan de middelste knop fase (figuur 2C) met Silwet-77 0.05% voor de eerste dompelen, gevolgd door een tweede dompelen in het late stadium knop (figuur 2C) met een iets lagere Silwet-77 concentratie van 0,03%. De transformatie werkte ook goed met de eerste kiem stadium (figuur 2A) met een lage Silwet-77 concentratie van 0,003%, gevolgd dooreen tweede dompelen met middelste knop stadium (figuur 2B) bij hogere Silwet-77 concentratie van 0,05%.
In dit protocol, werden een aantal andere parameters geprobeerd om de transformatie tarief te optimaliseren, maar vond geen effecten op het uiteindelijke resultaat te hebben. Voorbeelden hiervan verlenging van de na onderdompelen dat de planten leggen aan hun kant en bedekt met plastic van een dag tot twee dagen; met een OD van meer dan 1 voor Agrobacterium kweek, in plaats van 0,5-1; verhogen van de dompeltijd 5 - 15 min in plaats van 1-2 min. Wederom hebben we niet opgevallen geen effect op de transformatie tarief met behulp van deze strategieën. De meest effectieve factoren echter bleken te zijn met gezonde planten op de juiste bloem stadia, en met de beste Silwet-77 concentratie. We hebben gemerkt dat twee dompelen intervallen, werkt een of andere manier beter dan één keer, ook al een keer dompelen werkt ook.
Wijziging van dit protocol kan worden bereikt door reducinG de Silwet-77 concentratie slechts 0,003% in het tweede of derde dompelen. Aangezien Silwet-77 toxisch, te hoge concentratie resulteert in de ontwikkeling van bloemen slecht, waardoor er geen zaadopbrengst. Het dompelen frequentie kan worden teruggebracht tot één, met de tweede of derde gebeurtenissen geëlimineerd als de planten zijn niet gezond uit en de knoppen zijn niet goed ontwikkelen.
Een belangrijke beperking van deze techniek is het lage aantal bloemen door de vlas, het beperkte aantal zaden verkregen uit elke bloem en de lange levensduur van vlas. Het duurt 6-8 weken uit zaad zaaien naar de primaire knoppen klaar voor de eerste dompelen en een extra 8 hebben - 10 weken na het dompelen van de T1 generatie te krijgen. In totaal werd een bereik van 5 - 6 maanden nodig T1 generatie verkrijgen. In tegenstelling tot andere plantensoorten, die bloem op elk moment van het jaar, wat vlas rassen bloem beter op bepaalde tijden van het jaar. Dus doordachte planning voor deze techniek is belangrijk.
Agrobacterium - gemedieerde plantentransformatie via bloem-dip een uitvoerbaar en efficiënte methode voor vlas transformatie en kan worden gebruikt om de eerder gebruikte technieken voor vlas transformatie vervangen. De wijzigingen van de bloemen-dip-methode in dit protocol van toepassing zal zijn voor gebruik met andere plantensoorten en niet beperkt tot vlas zijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| Potting soil | |||
| Greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | Promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4595-01 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | ||
| Electroporator and cuvettes | Bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| Spinner | |||
| Plastic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | Sigma | M5524 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 |
References
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
- Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
- Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
- Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2 (16), (2006).
- Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
- Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
- Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).
- Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).
- Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
- Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
- Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).
