Summary
여기, 우리는 꽃 딥 통해 아그로 박테 리움을 매개 성 식물 형질 전환을 사용하여 아마 변환하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 수행 간단하고 저렴하면서도 아마 변환에 대한 현재 가능한 방법보다 더 높은 변환 속도를 산출한다.
Abstract
플로랄 딥 아그로 박테 리움 - 매개를 통해 식물 형질 전환 식물의 분야에서 널리 사용되는 기술이며, 많은 식물 종에 대한 성공적인 것으로보고되었다. 그러나, 꽃 딥에 의해 아마 (LINUM의 usitatissimum) 변환은보고되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목표는 아그로 박테 리움을 확립하고 플로랄 딥 방법은 형질 아마를 생성하는데 사용될 수있다. 우리는이 기술이, 간단 저렴하고 효율적이고, 더 중요한 것은, 아마 변환 가능한 현재의 방법보다 더 높은 변환 속도를 보여 준다.
2 분 - 요약하면, 아마씨 화서는 1 이진 벡터 플라스미드 (T-DNA 단편 플러스 LINUM 삽입 서열 LIS-1)을 운반하는 아그로 박테 리움 용액에 침지 하였다. 식물은 24 시간 동안 옆으로 젖혀졌다. 이어서, 식물은 다음 처리 될 때까지 정상 성장 조건하에 유지 하였다. 사전 처리디핑 (14) 사이에 일 간격 - 약 10으로 3 회, - 침지 S 2를 반복 하였다. T1 씨앗 수집 및 토양에 발아했다. 약 2 주 후, 처리 자손이 직접 PCR에 의해 시험 하였다; 2-3 잎 식물 플러스 적절한 T-DNA 프라이머 당 하였다. 긍정적 인 형질 전환을 선택하고 만기로 성장했다. 긍정적 인 형질 전환되는 처리 식물 씨앗의 60 % - 변환 속도는 50, 예기치 않게 높았다. 이 애기 장대와 꽃 - 딥 변환을 사용하여 다른 식물 종에 대해보고 된 것보다 더 높은 변환 속도이다. 이 변환을위한 다른 방법을 이용하여 형질 전환 아마, 또한 지금까지보고 된 가장 높은 것이다.
Introduction
아마 (LINUM의 usitatissimum)는 자사의 섬유 및 오일 널리 재배 중요한 작물이다. 아마 게놈의 변환은 상처, 아그로 박테 리움 감염 및 조직 문화에서의 공동 재배, 재생 다음과 유전자 입자 또는 초음파 초음파를 적용하는 등의 방법으로 가능하다. 그러나, 이들 기술은 많은 돌연변이 사건 성향 및 트랜스 제닉 라인을 얻기 위해 장시간을 포함하여 많은 단점을 가지고있다. 이러한 방법 중 일부는 비용이 낮은 복구 모종의 결과로, 악기의 유능하고 효율적인 조작을 필요로 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 종종 저 변태 속도 2,6 초래한다.
플로랄 딥 아그로 박테 리움 - 매개를 통해 식물 형질 전환은 형질 전환 식물체를 생성하는 간단하고 효과적인 방법이다. 그것은 일상적 성공적으로 애기 장대 thalian으로 많은 식물 종에 사용 된1,4, 개자리 속에서 truncatula (11), 토마토 (12), 밀 (13) 옥수수 (10). 그러나, 이로 인해 아마 의해 생성 꽃의 낮은 번호 등의 여러 가지 요인에 아마 변환을위한 실용적인 기술로서 간주되지 않은 각 꽃, 큰 종자 크기, 후막로부터 얻은 종자 제한된 수 또한, 유전 적 변형 과정에 문제가 될 수있다. 자손을 미 변태 어느 발아 또는 발아하지만 표백제 없지만 또한, 플로랄 딥 방법의 선택 부분은, 발아 및 녹색 유지하는 능력에 기초하여 구별 형질 전환 된 자손과 항생제를 함유 식물 매체에 형질 전환 종자 발아 필요 밖으로 신속하고 죽는다. 현재의 문헌에서, 야생형 아마 기반 위양성 결과를 생성하고, T1의 자손의 선택을, 항생제 선택 고농도 벗어날 경향이 주목 받고항생제 내성에 6,14 더 어렵다. 항생제의 고농도 선발 배지에 첨가 될 때 또한, 관찰 된 변형의 속도는 급격히 떨어 구.
이 프로토콜에서는 게놈 3,5-을 변경함으로써 환경 스트레스에 반응하는 것으로 나타났다 섬유 아마, 스토 몬트의 촉 (응답 및 플라스틱)의 라인을 변형하는 아그로 박테 리움과 플로랄 딥 방법을 사용 하였다. 항생제 이스케이프 문제를 극복하기 위해, 우리는 식물 미디어에 항생제를 첨가하여 선택하는 대신에, T1 잎에서 DNA의 직접 PCR 시험을 위해 선택했다. 우리는 처리시 특정 꽃을 추적 아마씨 단순한 해부학 이용했다. 이 추적 시스템은 항생제를 추가하지 않고 토양에 대한 특정 꽃과 발아 종자의 선택을 허용했다. 포지티브 형질 전환 DNA는 단순히 신속하고 효율적인 방법을 사용하여 O 잎에서 얻어진 시험함으로써 확인되었다F 직접 PCR. 우리의 결과는 꽃 딥 방법은 아마이 줄을 매우 잘 작동하고 놀라 울 정도로 매우 높은 변환 속도 결과 입증 - 이전 것으로보고 된 애기 장대, 관찰보다 높은 (50 ~ 60 %) 0.1-1 % 1, 그리고 다른 식물 종 (10, 12)보다도 더 높은. 우리는 또한 아마씨 (오일 아마)의 또 다른 다양한 베순 테스트 (안정적이고 무응답), 우리의 예비 데이터가 꽃 딥도 아마이 다양한 작동을 나타냅니다.
이 프로토콜의 목적은 아그로 플로랄 딥이 트랜스 제닉 아마를 생성하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 우리는이 기술이 간단하고 저렴하고, 아마 변환의 다른 방법보다 빠르다 것을 보여준다. 더 중요한 것은 아마 2,6 변형의 다른 방법보다 훨씬 높은 레이트 변환을 초래한다. 많은 가지와 꽃이 애기 장대의 해부학, 엄마KES는 어려운 감소와 같은 공장에 꽃을 비침 구분하기 위해. 따라서, 많은 수의 씨는 당 약 20,000 식물 씨앗, 양성 형질 전환 체를 식별하는 8 스크리닝 될 필요가있다. 아마, 다른 한편으로는, 그것이 가능 개별 꽃을 추적하고 처리를 스크리닝하는 동안 특정 종자를 선택하게 식물 당 약 100 개의 종자를 생산 적은 브랜치 (하나의 메인 분기 및 몇 곁가지) 적은 꽃을 갖는다.
우리는 꽃 딥은 아마의 모든 관련 종, 약 200 종의 속을 변환 할 수있는 적용 방법이라고 제안한다. 이 메소드는 아마 변환의 다른 방법보다 훨씬 높은 변형 속도를 제공한다. 우리는 또한 T1 잎 DNA의 직접 PCR 검사는 종종 많은 오탐 (false positive)을 생산하고 항생제 내성 탈출의 문제를 극복 할 수있는 효율적인 방법이라고 제안한다. 직접 PCR 검사는 다른 종의 식물에 적용 할 수 있고, t를 한정되지아마 오. 이 프로토콜에서 사용되는 간단한 시드 추적 기술은 아마 비슷한 해부학 분파 모든 다른 식물 종에 적용될 수있다.
Protocol
1. 식물 성장
- 육주 이전 찍기에, 토양 5 인치 냄비를 작성하고 아마 씨앗을 뿌리는 ¼ (포트 당 4 씨앗) 토양에 깊은 인치. 씨앗 위에 흙을 굳게해야합니다. 정기적으로 식물을 물과 긴 일광 (14 시간 빛과 10 시간의 어둠)에서 그들을 유지합니다.
- 정기적으로 차 화서 (꽃 '기관의 클러스터)에 대한 식물을 확인합니다. 싹이 볼 수 있습니다 그냥 꽃이 핌 (그림 1, 2)에 형성된 때 식물은 변환을위한 준비가되어 있습니다. , 새싹을 볼 필요하면 주위에 잎을 잘라합니다.
참고 : 최고 꽃 단계를 사용하여이 중요하며 토론에 자세히 설명되어 있습니다.- 이 사이드로 분기보다 꽃을 생성로서 실험적 치료 식물의 주요 지점을 사용한다. 사이드 가지 중 하나를 컨트롤로 (감소되지 않는) 또는 다른 실험 트리트먼트를 사용합니다.
- 또한, 메인과 사이드 가지를 사용같은 실험 치료를위한 공장 및 제어 또는 다른 실험적인 치료를 위해 다른 식물을 사용합니다. 개별 지점과 날짜와 치료의 종류와 각각의 꽃을 표시하는 라벨을 사용합니다.
2. 클로닝 및 변환 대장균 (E. 콜라이) 세포에서
- T-DNA를 품고 식물 바이너리 벡터의 여러 복제 사이트에 관심있는 조각 / 유전자를 복제.
- 한 단계 또는 두 단계에서 복제를 수행합니다.
- 직접 공장 이진 벡터에이 프로토콜 (~ 500 BP)에 작은 삽입을 복제. 이 프로토콜에서 공장 바이너리 벡터 (PRI909)를 사용합니다. 그렇지 않으면, 비슷한 전략에 다른 식물 바이너리 벡터를 사용합니다.
- 또한, 두 단계로 큰 인서트 (≥6.5 KB)를 복제 : 첫 번째 (특정 식물되지 않음), 다음 식물 바이너리 벡터에 서브 클로닝 일반 상업 복제 키트를 사용하여.
- 한 단계 또는 두 단계에서 복제를 수행합니다.
- PCR의 REAC을 설정기 관심의 유전자를 증폭한다. (사용 식물 바이너리 벡터의 다중 클로닝 부위에 따라) 5 '말단에 제한 효소 부위와 프라이머를 설계한다.
- 다음 사이클링 조건 표준 PCR은 게놈 아마 DNA를 사용하여 수행 : 24 ° C의 초기 보류하고 5 초 동안 98 ° C의 조건으로 30 회 반응시킨 뒤 94 ℃에서 2 분, 15 초, 60 ° C, 및 2 분 72 ° C에서. 4 ° C에서 무기한 보류 한 다음 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 단계를 수행합니다.
- 1 % 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 아가 로스 겔상에서 분리 된 PCR 제품은 1 시간 동안 100 V에서 젤을 실행. 겔로부터 정제하고 제품을 Nanodrop 통해 정량화.
- 상업 클로닝 벡터에 PCR 제품을 복제 할 결찰 믹스를 설정합니다. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 화학적 유능한 E.로 결찰 믹스 변환 다음과 같이 대장균 세포.
- 채널의 한 유리 병에 결찰 믹스의 2 μl를 추가emically 관할 E. 대장균 세포. 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 열은 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 충격 (열충격 시간 및 온도는 사용되는 세포의 유형에 따라 달라짐).
- 얼음에 품어 catabolite 억압 (SOC) 매체와 RT 슈퍼 최적의 배지 250 μl를 추가합니다.
- 튜브 씌우고 한 시간 동안 37 ℃에서 200rpm으로 진탕 기에서 배양한다.
- 스프레드 10 - (37 ° C에서 데워진) 데워진 LB 플레이트 + 해당 선택적 항균제 각 변환에서 50 μl를 (상업적인 클로닝 벡터의 종류에 따라 선택적 항생제를 결정). 37 ° CO / N에서 번호판을 품어.
- 상용 키트를 사용하여, ~ 미니 준비 플라스미드 정제를위한 10 식민지를 선택합니다. 미니 준비 플라스미드 정제는 일반적으로 다음과 같이 수행된다.
참고 : 버퍼 이름을 사용하는 상용 장비에 고유하지만 그들의 일반적인 기능이 유사하다.- 2의 단일 콜로니를 접종- (상업적인 벡터의 유형에 따라 결정됨) 선택적 적절한 항생제를 함유하는 5 ㎖의 LB 배지.
- 격렬 (~ 300 RPM)와 37 ° C에서 약 8 시간 동안 품어.
- 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확.
- 250 μL에 재현 탁 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 믹스와 소용돌이 완전히 펠렛을 분산 할 수 있습니다.
- 6 회 - 용해 완충액 250 μl를 첨가하여 균체를 Lyse는 튜브 4 반전시킴으로써 철저히 혼합한다.
- 중화 완충액 해물 중화 4 반전 - 혼합 6 번. 테이블 탑 마이크로 원심에 ~ 17,900 XG에 10 분 동안 원심 분리기.
- 스핀 컬럼에 이전 단계의 상층 액을 전송합니다. 원심 분리기 다시 30 ~ 17,900 XG에 - 60 초.
- 60 초 - 30 0.75 ml의 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 스핀 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 추가 1 분 동안 원심 분리기 레모하기잔류 세척 버퍼를했습니다. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 스핀 컬럼을 놓습니다. DNA를 용출, 각 열의 중앙에 50 μL의 물을 첨가 하였다. 1 분간 방치하자, 1 분 동안 원심 분리.
3. 삽입 체의 존재에 대해 분석 정제 된 플라스미드
- 제한 다이제스트 :
- 삽입물을 복제하는 데 사용되는 제한 효소로 절단함으로써 플라스미드 삽입 체의 존재를 결정하는 제한 다이제스트를 설정한다. 다음과 같이 전형적인 이중 제한은 반응을 소화 : 정제 플라스미드의 1 μg의 각 제한 효소 1 μL, 2 μL 10 배 제한 (20 μL의 총에) 버퍼 + 2 μL의 BSA (해당하는 경우) 물 μL, X 다이제스트
- 부드럽게 믹스와 권장 온도 (하나의 효소에서 다른 다름)에 품어.
- 제한이 1 시간 동안 100 V에서 실행, 1 % TBE 영동 반응을 소화하고 적절한 크기의 드롭 아웃을 찾아 분석.
- PCR 분석 :
- 삽입 또는 벡터와 인서트 사이의 접합 내부 증폭 상업 벡터 지역에서 프라이머를 이용하여, 정제 된 플라스미드 PCR을 설정합니다. 일반 M13 프라이머는 순방향 및 역방향 및 T3 / T7 프라이머이다.
- 이 프로토콜에서, 다음의 PCR 사이클링 조건을 사용하고 5 초, 15 초, 60 ° C 98 ° C에서 18 회 반복 94 ℃에서 2 분, 72 ° C 24 ° C의 초기 잡아 2 분. 4 ° C에서 무기한 보류 한 다음 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 단계를 수행합니다.
- 1 시간 동안 120 V - 1 % TBE 아가 로스 겔에로드 PCR 제품과는 100 실행합니다.
- 시퀀싱 :
- 분석하고 삽입물의 존재를 확인하기 위해 시퀀싱 상업 시설로 정제 플라스미드를 보낸다.
- 정확한 구조가 얻어지면, (식물 바이너리 벡터 내로) 클로닝 번째 단계 사용.
참고 : 2.3 단계 - 3.3클로닝 한 단계에서 종료되는 경우 제거 될 수있다.
식물 바이너리 벡터 (PRI909)와 E에 4 복제 대장균 변환
- 식물 바이너리 벡터를 선형화 소화 반응을 이중 제한을 설정하고 프라이머 (단계 2.2)을 첨가하여 동일한 제한 효소 부위를 사용하여 클로닝 된 삽입물을 미리 격리.
- 2 시간 - 1, 100 V에서 작동 겔 전기 영동을 사용하여 제한 효소 소화 분석. 삽입 겔에서 선형화 된 식물 바이너리 벡터를 잘라.
- 겔 제품을 정화하는 상용 키트를 사용합니다. 제조업체의 설명서를 참조하십시오.
- 식물 바이너리 벡터에 삽입을 결찰하는 결찰 반응을 설정합니다. 벡터 비율 인서트 인서트의 크기 및 식물 바이너리 벡터에 의존한다. 이 프로토콜에서 LIS1 인서트는 6.5 킬로바이트이고 공장은 바이너리 벡터는 9 KB했다. 벡터 비율이 삽입 : 따라서, 1을 사용합니다.
아그로 박테 리움에 5 일렉트로는 전기 관할 세포를 아그로 박테
- 아그로 박테 리움의 유리 병이 얼음에 전기적으로 유능한 세포를 박테 리움 해동.
- 얼음에, 유능한 세포의 20 μL 이진 벡터 플라스미드 DNA의 1 NG를 추가하고 부드럽게 섞는다.
- 얼음에 0.1 cm의 전기 큐벳을 풀어.
- 전기 큐벳에 관할 세포 / DNA 믹스를 전송하고, 하단의 혼합물을 수집하는 누릅니다. electroporator 기계와 펄스에 큐벳을 넣어 (전압과 시간 조건은 큐벳의 크기와 사용 electroporator에 따라 다릅니다).
- 15 ML 튜브에 SOC 미디어 및 전송 세포의 1 ML을 추가합니다.
- 28-30에서 1 시간 동안 품어100 rpm으로 진탕, C를 °. 판 (50) - LB 한천 + 적절한 선택적 항생제에 세포를 100 ㎕는 (공장 이진 플라스미드 및 사용 아그로 박테 리움의 변형에 따라 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신이 프로토콜을 사용합니다.).
- 30 °의 C - 28에서 48 시간까지 번호판을 품어.
- 식민지 선택 및 플라스미드 정제 단계를 반복 2.5.
- 3 단계를 반복하여 플라스미드를 분석하고 꽃-찍기 위해 구조를 사용하기 전에 삽입 및 T-DNA의 무결성을 검사 할 수 있습니다. 단계 3.3에서와 같이 전체 삽입 지역에 걸쳐 및 T-DNA 영역에 걸쳐 시퀀싱 여러 PCR 프라이머를 사용하여 단계를 반복 3.2.
참고 :이 프로토콜에서 4 개의 프라이머를 T-DNA와 삽입에 걸쳐 10 프라이머를 통해 설계되었다. - I 아그로 선택된 콜로니에서 플라스미드 바이너리 식물의 존재가 확인되면, 도시 세포-80 ° C에서 N 50 % 글리세롤 및 저장. 이들은 1 주일 이내에 7 사용될 경우 쇼핑몰 4 ° C에서 플레이트에 콜로니 잔존.
6. 꽃 - 디핑
참고 : 2 일 전에 플로럴 찍기를하기 :
- 액체 미디어 LB + 적절한 항생제 - 정지상 (허용 1 600 0.5 사이 OD)에 아그로 박테 리움 세포를 성장.
참고 : 이들은 식물 바이너리 벡터 및 이용 아그로 균주의 종류에 따라, 단계 5.6에서와 같은 항생제이다. - 1 문화를 시작 포화 (5 ml)을 O / N 문화 (100) 희석과 24에 대한 성장 - 150 rpm으로 진탕하면서 28 ~ 30 ℃에서 48 시간. 문화는 midlogarithmic 단계에 도달해야하며, 가능성이 접근 또는 정지 1 단계에있을 것입니다. 약 0.8 OD (0.5-1 사이에 다시 OD는 모두 허용) 8. 5000 X에서 원심 분리하여 세포를 수집RT에서 g.
- 침투 배지에서 세포를 재현 탁 (5.0 % 자당 + 0.05-0.003 % 실 웨트 L-77). 찍기의 첫 번째 라운드를 들어, 0.05 % 웨트-77을 사용합니다. 두 번째와 세 번째 라운드를 들어, (설명에서 상세한) 0.03 %의 농도를 감소시킨다.
- 꽃 딥 단계를 진행합니다. 옆에 공장을 놓고 1-2 분 동안 침투 매체에서만 볼 수 싹을 찍어. 옆에 공장을두고 돔 (그림 3) 높은 습도를 유지하기 위해 플라스틱 포장으로 커버.
- 다음 날, 수직 위치에 공장을 배치하고 정상적으로 유지한다.
- 꽃 봉오리 (일반적으로 약 10 후 - 14 일) 더 큰 성장하면 - 6.4 반복 6.1 단계를 반복합니다. 0.003 %로 60 초와 웨트-77 농도 - (30)에 침지 시간을 줄일 수 있습니다.
- 자신의 씨앗 (그림 4) 수집 될 성숙하고 준비가 될 때까지 일반적으로 식물을 유지한다.
긍정적 인 트라 7. 선택직접 PCR과 nsformants
- 단계 1.1에서와 같이 토양에 T1의 씨앗을 뿌리고.
- 대안 적으로, 500 ㎖의 물에서 MS 한천 배지 + 4g 중 2.2 g을 첨가하여 무라 시게 및 스쿡 염 배지 (MS 배지)를 만든다. 압력솥과 작은 식물 냄비에 붓는다. 사용까지 4 ° C의하십시오.
- 고화 MS 배지에 넣어서 뿌린 씨. 긴 일광 (14 시간 빛과 어둠 10 시간)에서 보관하십시오. 6 일 (그림 5) - 씨앗은 약 4 발아합니다.
- 시작 지점으로 각각의 꽃에서 하나의 씨앗을 사용합니다. 더 포지티브 형질 전환 체 얻어지지 않으면, 꽃에서 다른 시드를 선택하여이 단계를 반복한다.
참고 : 같은 꽃에서 테스트 다른 씨앗, 어떤 경우에는 하나의 꽃에서 모든 씨앗이 변형 될 수 없습니다 때문입니다. 실험 꽃에서 추가 씨앗을 선택하면 때로는 필요하다.
- 정기적으로 모종에 확인합니다. 약 10 년 - 발아 후 14 일, 때 진정한개발, 직접 PCR과 식물을 테스트 잎.
- 3 잎 - 2 절단하여 잎 DNA 추출물을 준비 - 각 묘목에서 (5 중량 10 mg)을하고 microcentrifuge 관에 배치합니다.
- 각 튜브의 50 mM NaOH를 180 μl를 추가하고 95 ° C에서 10 분 동안 품어.
- 1 M Tris-HCl (pH8.0)을 20 μl를 첨가하여 추출물을 중화.
- 양성 형질 전환 체를 선택하는, 또는 T-DNA 삽입 체 (도 7)에 걸쳐 설계된 프라이머를 사용하여 직접 PCR 반응에서의 추출물 1 μl를 사용한다.
- 이 프로토콜에서 24 ° C의 초기 홀드 직접 PCR을 사용하여, 다음 10 초, 15 초 동안 어닐링 단계, 68 °에서 확장 단계에 98 ° C (40 회 반복 98 ° C에서 2 분, C). 39 ° C에서 무한정 보류이어서 5 분 동안 68 ℃에서 최종 연장 단계를 수행한다. (사이클 프라이머, 어닐링 온도와 연장 시간에 대한 자세한 내용은 표 1 참조).
- 긍정적 인 형질 전환 체를 확인하고 만기에 성장합니다. 씨앗이 더 큰 냄비에 토양 MS 배지, 이식에 발아 된 경우 (그림 5).
Representative Results
도 1-4는 프로토콜 내에서 단계들의 일부를 도시한다. 도 1 및도 2, 핌 싹 주위 잎을 아그로 박테 리움 세포 및 프로토콜을 개발하는 데 사용 된 다른 봉오리 단계에 노출하기 위해 절단된다. 3 아마 플로랄 딥 방법을 도시한다.도 4를 나타내고 추적과 식별 할 수있는 방법을 메인과 사이드 가지 표시 할 수 방법 개별 꽃의 예. 그림 5는 T1의 자손은 MS 공장 용지에 발아하고 성숙 토양에 이식 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그림 6은 어떻게 wild- 보여 아마 형은 문헌 6,9,14 이전에 확인 결과, 고농도의 카나마이신을 피할 수있다.
도 7은 포지티브 T1 형질 전환 체에서 직접 PCR 증폭의 일례를 도시한다. T1 꽃은 m에서 수집단일 T0 공장의 아인과 측면 촬영. 직접 PCR로부터 알 수있는 바와 같이, 8/12 T1 식물을 PCR에 의해 양성과 T-DNA에 걸쳐 상이한 영역을 증폭했다. 우리의 프라이머는 LIS-1 삽입 및 여러 복제 사이트 (그림 7B 및 C) 사이에 설계되었다. 우리는 왼쪽의 경계와 NOS 터미네이터 (데이터는 도시하지 않음) 또는 오른쪽의 경계와 여러 복제 사이트 (그림 7D)과 T-DNA의 다른 세그먼트를 증폭하는 식물 바이너리 벡터에서 추가 프라이머를 사용했다. LIS-1 인서트에 특이 적 프라이머는이 프로토콜에서 사용되었다 (데이타 미기재). 프라이머의 목록은 표 1에 제공된다. 그러나, 이들 프라이머 서열은 T-DNA를 식물 바이너리 벡터의 서열과 플로랄 딥 사용 인서트에 의존한다. 우리는 또한 주 및 분기 측으로부터 수집 꽃 간의 변환 속도에는 큰 차이가 없다는 것을 밝혔다.
차 꽃이 핌 싹 주위에 잎을 절단 그림 1. Agrobacterim 세포에 노출합니다. (A) 싹이 잎으로 덮여있다. (B) 잎을 노출 싹 주위를 잘라왔다. (C) 공장에서 이미지 확대 싹을 노출 절단 후 (A)에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 꽃 딥에 사용할 수있는 가장 좋은 단계를 결정하기 위해이 프로토콜에 사용 된 다른 꽃 봉오리 단계. (A) 초기 단계의 새싹 approxima입니다 tely 2mm. (B) 중간 단계 봉오리가 약 5 mm이다. (C) 말기 새싹 약 약 1cm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 아마 꽃 - 찍기의 과정. (A) 주 화서는 침지 식물 다음날까지 평면 레이아웃된다 (C). (A)로부터 확대 된 (B). 아그로 박테 리움 세포를 함유하는 침투 매체에 침지하고, 침지 분기가 유지하는 플라스틱으로 덮여 높은 습도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 4. T0 처리 식물에서 꽃 추적 및 종자 수집에있어서, (A)의 주요 지점 (중앙에있는 가장 높은 지점)으로 전체 공장의 예와 측면 지점 (B - D). . 다른 지점에서 꽃의 예 (E) 개별 꽃에서 수집 된 씨앗의 예 (레이블 - K). 주요 지점에서를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. T1 모종 항생제 선택하지 않고 재배한다. (A) T1 씨앗이MS 공장 용지에 발아. (B) 양의 형질 전환, 직접 PCR에 의해 결정, 토양에 이식 만기로 성장하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 항생제 탈출, T1 선택에 대한 문제는, 직접 PCR 검사에 의해 극복된다. 항생제없이 MS 공장 용지에 발아 (A) 야생 형 아마 씨앗. (B) 야생 형 아마 씨앗은 MS 식물 미디어 + 농도 증가에 발아 의 가나 마이신 (200 ㎍ / ㎖, 600 μg의 / ㎖, 1 ㎎ / ㎖). 야생형 아마 및 T1에서 2 ㎎ / ㎖ 카나마이신. (D) PCR로 MS 식물 미디어 발아 (C) 야생형 아마 씨앗 카나마이신 프라이머를 이용하여 모종, 모든 AMPL, C를 DNA 마커, FlaxS, 야생형 flaxS : EZ1을 : 카나마이신 유전자 (전설에서 지정 비침 분기를 제어, 엄마 : 꽃에서 T1의 자손 ""주요 지점에서 수집, 사우스 캐롤라이나, SD, 괜찮다, SF : 사이드 지점, W에서 수집 한 다른 꽃 "C, D, E, F"의 T1의 자손 :. 노 DNA) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 직접 PCR 방법을 사용하여 T1의 자손의 성공적인 PCR 증폭을의 예. 식물 바이너리 벡터 클로닝 LIS + 1 인서트의 (A) 다이어그램. 파란색 화살표 (다카라에서 수정) 직접 PCR 검사에 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 나타냅니다. (B) PCR 프라이머 M13F와 + 3 '(C) PCR 프라이머와 M13R + 18A
| 정방향 프라이머 서열 소스 | 서열 5'-3 ' | 역방향 프라이머 시퀀스 소스 | 서열 5'-3 ' | 어닐링 TEMPRATURE (° C) | 연장 시간 (초) | 예상 크기 (BP) |
| M13F (T-DNA) | CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG | 3 '(LIS-1 삽입) | GAGGATGGAA GATGAAGAAGG | 57 | (40) | (450) |
| 18A (LIS-1 삽입) | TATTTTAACCC | M13R (T-DNA) | ATTAGGCACC CCAGGCTTTA | 57 | (40) | (520) |
| MCS (T-DNA) | TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG | RB (T-DNA) | TTTAAACTGA AGGCGGGAAA | (60) | (20) | (200) |
| LB (T-DNA) | TTTGATGGTG GTTCCGAAAT | NOS (T-DNA) | GAATCCTGTT GCCGGTCTT | (60) | (30) | (380) |
| NPTII (T-DNA) | GCGATACCGT AAAGCACGAG | NTPII (T-DNA) | GCTCGACGTT GTCACTGAAG | (65) | (45) | (502) |
표 1. PCR 직접 실험에 사용 된 프라이머의 일부.
Discussion
이러한 아마 (LINUM의 usitatissimum)와 같은 일부 식물 종에서, 성공적인 식물 형질 전환은 제한되고있다. 이전의 변환은 아마 부상과 공동 배양, 유전자 총 입자를 적용하거나 재생이어서 초음파 초음파를 이용하여 아그로 박테 리움 감염을 요구하고있다; 긴 경향이 둘 다 과정은 많은 돌연변이 이벤트 수반된다. 또한, 이들 기술의 선택 프로세스 카나마이신과 같은 항생제 선별 마커의 사용을 요구한다. 그러나, 아마 항생제 6,9,14의 높은 농도를 탈출하는 경향이 선택이 방법은 많은 잘못된 반응을 생산 문헌에서 언급되고있다. 아마 변환 이전의 기술의 다른 단점은 낮은 변형 속도 2,6이었다.
여기에 설명 된 프로토콜에서 꽃-찍기를 통해 아그로 박테 리움 - 매개 식물 형질 전환이 나타났다(50-60%) 아마에 대한 높은 변환 속도가 발생할 수 있습니다. 형질 전환 주 및 측면 지점에서 담근 수집 꽃에서 얻어졌다. 긍정적 인 형질 전환 체의 선택은 단순히 의해 통과 항생제 선택의 사용을 토양에 T1 식물 성장하고 발아 직후 잎을 선별에 의해 수행되었다, 단계 이전에 다른 종의 식물 꽃 딥의 표준으로 사용. 나뭇잎의 직접 PCR 시험을 수행하고, 해당 T-DNA 프라이머를 사용하여, 양성 형질 빠르게 선택할 수있다. 이 기술은이 방법 1,10,12를 사용하여 이전에 애기 장대와 다른 식물 종에 대해보고 된 것보다 훨씬 더 높은 변환 속도에, 간단한 저렴하고 편리하게 수행 할 수, 아직 결과. 또한 아마보고 된 가장 높은 변환 속도이다.
그러나, 가장 꽃 스테이지의 선택과 최고의 계면 활성제의 농도를 포함하는 절차에 중요한 단계가되도록 존재아그로 박테 리움은 꽃의 장기를 죽이지 않고 식물 세포에 침투 할 수 있습니다. 초기 새싹 스테이지 0.05 % 이하의 높은 웨트-77 농도 (도 2A)를 사용하는 경우, 개발이나 꽃 씨앗을 설정하지 않을 것이다. 변환 일 수도 있지만 늦은 봉오리 단계는, (도 2C)를 사용하는 경우 훨씬 더 낮은 비율로 발생한다. 유사한 결과가 애기 플로랄 딥 변환 1,4 얻었다. 이 프로토콜의 경우, 모든 꽃 단계는 초 침지에이어서 다른 웨트-77 농도로 시험하고, 최선 단은 제 찍기 위해 0.05 %의 웨트 - (77)와 중간 봉오리 단계 (도 2C)로 측정되었다 0.03 %의 약간 감소 웨트-77 농도 늦은 봉오리 단계 (도 2C). 변환은 또한 다음에, 0.003 %의 낮은 웨트-77 농도의 초기 봉오리 단계 (도 2A)를 사용하여 잘 작동0.05 %의 높은 웨트-77 농도의 중간 새싹 단계 (그림 2B)와 두 번째 찍기.
이 프로토콜에서, 몇몇 다른 파라미터 변환 속도를 최적화하기 위해 시도하지만, 최종 결과에 아무런 효과가없는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면 식물이 자신의 옆에 누워 한 날부터 이틀 플라스틱으로 덮여 있음을 침지 후 시간을 연장 포함; 아그로 배양 중 하나 이상을 사용하여 OD 대신 0.5-1; 15 분 대신 1 - - 2 분 5 침지 시간을 증가시킬 수있다. 다시 우리는 이러한 전략을 사용하여 변환 속도에 영향을 발견하지 않았습니다. 가장 효과적인 인자 그러나, 정확한 꽃 단계에서 건강한 식물을 사용하고 최상의 웨트-77의 농도를 사용하는 것으로 밝혀졌다. 우리는 두 찍기 간격, 한 시간 침지도 작동하더라도, 어떻게 든 더 이상 시간을 작동하는 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 대한 수정은 reducin에 의해 달성 될 수있다g 번째 또는 세 번째 디핑 같이 작은 0.003 %까지 웨트-77 농도. 웨트-77 독성이기 때문에, 꽃에 너무 높은 농도 결과 시드의 수율로 수득 저조한 현상. 식물 건강 찾고되지 않고 싹이 잘 개발되어 있지 않은 경우 두 번째 또는 세 번째 이벤트를 제거하여 침지 주파수는 1로 삭감 할 수있다.
이 기술의 주요 제한은 아마, 꽃에서 얻어지는 각 씨의 제한된 수 및 아마의 긴 수명에 의해 생성 꽃의 수가 적은 것이다. T1 세대에 도착 십주 후 찍기 - 첫번째 찍기 위해 준비 차 새싹과 추가 8을 가지고 종자 파종에서 팔주 - 그것은 6 걸립니다. 총 5의 범위 - 6 개월 T1 세대를 얻을 필요가있다. 다른 종의 식물과는 달리 어떤 꽃 언제든지 올해의 올해 특정 시간에 일부 아마 품종 꽃보다. 이 기술에 대한 그래서 사려 깊은 계획이 중요합니다.
아그로 박테 리움을 보여 - 플로랄 딥 통해 매개 된 식물 형질 전환은 아마 변환을위한 적용하고 효율적인 방법이며 아마 변환에 대한 이전에 사용 된 기법을 대체하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜의 꽃 딥 방법의 수정은 다른 식물 종에 사용하기 위해 적용하고 아마로 제한되지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| Potting soil | |||
| Greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | Promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4595-01 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | ||
| Electroporator and cuvettes | Bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| Spinner | |||
| Plastic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | Sigma | M5524 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 |
References
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