Abstract
والهدف من التحليل فلوروميتريك هو بمثابة وفعالة من حيث التكلفة، طريقة إنتاجية عالية الكفاءة في تحليل البلعمة والعمليات الخلوية الأخرى. هذه التقنية يمكن استخدامها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، سواء ملتصقة وغير ملتصقة، لدراسة مجموعة متنوعة من الخصائص الخلوية. عند دراسة البلعمة، تقنية فلوروميتريك تستخدم أنواع الخلايا البلعمية مثل الضامة، والجزيئات opsonized fluorescently المسمى الذي يمكن أن تسقط في وجود الأزرق التريبان مضان. وبعد الطلاء الضامة ملتصقة في لوحات 96-جيدا، والجسيمات الفلورية (الأخضر أو الأحمر) تدار ويتم السماح خلايا في phagocytose لكميات متنوعة من الوقت. وبعد استيعاب جزيئات الفلورسنت، ويتم غسلها الخلايا مع الأزرق التريبان، مما يسهل انقراض إشارة الفلورسنت من البكتيريا التي لا المنضوية، أو مجرد التمسك سطح الخلية. بعد غسل التريبان، يتم غسلها الخلايا مع PBS، ثابتة، وهيالثانية ملطخة دابي (التسمية الفلورسنت الزرقاء النووية)، والذي يعمل على تسمية نوى الخلايا. من جانب الكمي فلوروميتريك بسيط من خلال لوحة قراءة النووي (الأزرق) أو الجسيمات (أحمر / أخضر) مضان يمكننا فحص نسبة الوحدات مضان النسبية للأخضر: أزرق وتحديد مؤشر أكلة يدل على كمية من البكتيريا الفلورية المنضوية لكل خلية. مدة الفحص باستخدام طريقة والأقنية 96-جيدا الماصات لغسل، من نهاية البلعمة لوضع حد من الحصول على البيانات، هو أقل من 45 دقيقة. التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم بطريقة مماثلة ولكن الاستفادة من التألق هو الإنتاجية العالية، طريقة سريعة للتقييم مع التلاعب الحد الأدنى من العينات وتقدير سريع للكثافة الفلورسنت لكل خلية. استراتيجيات مماثلة يمكن تطبيقها على الخلايا غير ملتصقة والبكتيريا وصفت العيش، الأكتين البلمرة، وأساسا لأي عملية الاستفادة من مضان. ولذلك، التألق هي طريقة واعدة لتكلفة منخفضة، throughp أعلى مستوياتهقدرات UT في دراسة العمليات الخلوية.
Introduction
الكمي للإشارة الفلورسنت وقد استخدم على نطاق واسع في العديد من الأساليب العلمية التي تتراوح بين PCR، التدفق الخلوي، الفحص المجهري متحد البؤر، والحنق التحليل لمعدد ELISA. التصوير مضان وتقدير له تطبيق واسع النطاق ويمكن أن يكون أداة عظيمة للتحليل الكمي من العمليات الخلوية المختلفة. وقد أحدثت ثورة استخدام علامات الفلورسنت وإشارة في العقد الماضي، وظهور القراء لوحة الفلورسنت يسر الكمي إنتاجية عالية من مضان المنبعثة خلال العمليات الخلوية.
تحليل فلوروميتريك يمكن أن تكون بمثابة أداة عظيمة في تقدير حجم البلعمة. وقد تمت دراسة البلعمة منذ اكتشاف البالعات التي كتبها ميتشنيكوف في عام 1800 1. وعلى مر السنين، وقد تم استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب لدراسة هذه العملية الهامة ضرورية للدفاع ضد غزو المناعة الفطرية البكتيرية، الفيروسية، الفطرية والطفيلية الممرضة 2-5. الأساليب السابقة من تقدير تستخدم المجهري وتقنيات stereological من أجل تصور الخلايا التي يتم phagocytosing، ثم جرى كميا عن طريق عد من الجسيمات المنضوية (يدويا أو باستخدام البرمجيات) 6-8. بعض العيوب باستخدام المجهر وحده للتحليل الكمي هي أن العد والفرز اليدوي من البكتيريا هو عمالة كثيفة وأكثر عرضة للانحياز مراقب. طريقة أخرى تستخدم في القياس الكمي للالبلعمة هي التقنية الميكروبيولوجية من الطلاء من البكتيريا من الخلية لست] (بعد البلعمة) على لوحات ثقافة البكتيرية، ولكن هذا الأسلوب يمكن أن تفشل لحساب آليات للجراثيم وجود البكتيريا المنضوية جزئيا. هذا الأسلوب هو المزيد من العمل المكثف مقارنة المجهري ويأخذ عدة أيام لتحليلها. التدفق الخلوي يبدو أن يكون أسرع وأنجع وسيلة لقياس البلعمة وتم استخدامها من قبل العديد من الجماعات 9-11، ولكن التكلفة العالية المرتبطة عادة مع فيstrument اللازمة لتحليل يجعل من الأسلوب الأكثر مكلفة بالمقارنة مع المقايسات التي سبق ذكرها.
طريقة فلوروميتريك هو بديل جيد لالتدفق الخلوي لتحليل الجسيمات الداخلي لأنه يقدم الكمي غير منحازة من مضان باستخدام المعدات التي ليس كما باهظة التكلفة. فوائد إضافية أخرى من التألق وكفاءة عالية، وقدرات إنتاجية عالية لقياس مضان المنبعثة من جزيئات المنضوية المسمى.
فوائد التألق يمكن استقراء لتقدير حجم العمليات الأخرى من البلعمة. على سبيل المثال، تحليل فلوروميتريك يمكن تطبيقها لدراسة أي عملية تؤدي إلى تغييرات في التعبير عن داخل الخلايا أو مستقبلات غشاء محدد، والتغيرات في نفاذية الخلية / الجدوى والفعالية ترنسفكأيشن، وتعديل في الأكتين البلمرة. واحد السلبي لتقنية فلوروميتريك هو أنه، اعتمادا على التسميات المستخدمة، قد يكون هناك ارتفاعتجربة لتجربة تقلب التي يمكن عادة أن تحل من خلال إظهار البيانات من خلال الكمي النسبي، مثل تغير أضعاف أو الزيادة في المئة من السيطرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتطبيقات متعددة مثل الكمي للالبلعمة والأكتين البلمرة كما هو مستخدم في عملنا نشرت سابقا 12. بروتوكول يفسح المجال لمجموعة متنوعة من التعديل، وأنواع الجدول 1 قوائم الخلية والجزيئات استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة. ويتضح استخدام معيار هذا البروتوكول لتقدير حجم البلعمة أو الأكتين البلمرة في الشكل 1.
الرسم البياني 1: رسم تخطيطي لفحص فلوروميتريك الكمي لالبلعمة والأكتين البلمرة بعد ومطلي الخلايا، والمعالجة، ويسمح لهم الالتزام بها وتضاف جسيمات المسمى مع مضان الأخضر (FITC) إلى خلايا البلعمة ل. تم إيقاف رد فعل من جانب التريبان أو عنتيبييتم تنفيذ يغسل أذني (للقضاء على جزيئات غير المنضوية) والتثبيت مع بارافورمالدهيد 4٪. هي ملطخة الخلايا في وقت لاحق مع الحمراء التسمية الفلورسنت الأكتين (رودامين phalloidin) والتسمية الفلورسنت الزرقاء (دابي). وكميا مؤشرات البلعمة والأكتين البلمرة كنسبة من وحدات مضان النسبية للأخضر / أزرق (FITC / دابي)، أو أحمر / أزرق (رودامين / دابي) مضان.
1. الطلاء وخلايا علاج
ملاحظة: قبل بداية، والنظر في تشغيل العلاجات مع لا يقل عن 4 مكررات الفنية، وتشمل الضوابط التالية في تخطيط لوحة: خلايا فقط (غير ملوثين، مع دابي وحدها أو رودامين وحدها) والجسيمات فقط.
- إجراء كافة إضافة الكواشف في الخطوات 1-4 في الثقافة العقيمة خلية غطاء محرك السيارة من أجل حماية العينات من التلوث.
- الضامة لوحة (الفئران خط الخلية J774) في لوحة 96-جيدا في 1-5 × 10 4 خلايا في 50 ميكرولتر (لكل بئر) من تستكمل وسائل الاعلام مسخن. لوحات مثالية لهذا الأسلوب هم من السود لوحات 96-جيدا مع قيعان واضحة أو سوداء، وهذا يتوقف على قدرات القارئ.
- لوسائل الإعلام تستكمل، استخدم 10٪ الحرارة المعطل FBS لتفادي أي تشويش من تكملة سلسلة، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (إذا لم تكن تستخدم البكتيريا الحية لالبلعمة). إذا باستخدام الخلايا الملتصقة تسمح 1-2 ساعة لالتصاق، وللخلايا غير ملتصقة، وتدور أسفل لوحة مع الخلايا لمدة 10 دقيقة في 500 ز س.
- إضافة المرجوة منبهات / الخصوم أو السيطرة على السيارة في تركيز 2X (معلق في برنامج تلفزيوني أو أكثر ويفضل، في وسائل الإعلام تستكمل) في 50 ميكرولتر عن الحجم النهائي من 100 ميكرولتر (1X)، واحتضان لفترة من الوقت المطلوب. سوف الأقنية ماصة وكاشف الخزانات تسهيل أسرع المعالجة.
2. طهاية من نيون الجسيمات
ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "العرض =" 500 "/>
الجدول 1: اختبار أنواع الخلايا والجزيئات الفلورسنت في التحليل فلوروميتريك البلعمة والبلمرة أكتين يوضح الجدول 1 مجموعات من أنواع الخلايا (خطوط الخلايا، والخلايا الأولية) أن مجموعتنا استخدمت عبر طريقة فلوروميتريك. البعض من النظر في البلعمة والأكتين البلمرة من قبل خلايا نوع البرية، ولقد استخدمت أيضا بعض من هذه الجسيمات لفحص البلعمة من قبل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تعبر عن GFP (ببروتين أخضر). ويمكن أيضا مضان من الخلايا transfected مع البلازميدات تحتوي على صحفيين الفلورسنت استخدامها كعلامة الخلوية بالإضافة إلى دابي أسطورة الجدول: A - البلمرة أكتين. P - البلعمة. PT - البلعمة من قبل GFP المسمى الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. OPDex - opsonized حبة ديكستران. HKOP - قتلت الحرارة opsonized.
- تأكد من أن جزيئات الفلورسنت والعلامات محمية من الضوء في جميع الأوقات، الدرتجهيز والغسيل جي، وكذلك أثناء الحضانة من أجل منع photobleaching من
- للجسيمات الجافة، تزن من الحرارة الفلورسنت قتل opsonized (HKOP) البكتيريا (E2861: E. القولونية K-12 سلالة)، وذلك باستخدام مواصفات الشركة الصانعة. احرص على التأكد من الحسابات الجماعية لمدة 10: 1 - 20: 1 البكتيريا: نسبة خلية (أو على الأقل 10: نسبة 1 - يشيع استخدامها في تقدير حجم البلعمة) 13،14. عدد الجسيمات يمكن توفير من قبل الشركة المصنعة أو تحديد عبر couting التخفيفات المتسلسلة من 1 ملغ / مل محلول المخزون.
- resuspend في 50 ميكرولتر PBS ودوامة لمدة 1 دقيقة عند أعلى الإعداد. ضمان vortexing لالسليم (هنا وفي جميع أنحاء البروتوكول) كما تميل الجزيئات لتجميع والتي قد تؤثر على فعالية طهاية.
- للجسيمات في تعليق مثل هذه الخرز ديكستران كما fluorescently المسمى (الخرز DEX)، دوامة الحل الأسهم لمدة 1 دقيقة، وتأخذ 50 ميكرولتر من تعليق أو اعتمادا على تركيز حبة في حجم دetermine جبل من الخرز لتسهيل 10: 1 حبة: نسبة الخلية.
- إضافة حجم مساو من كاشف opsonizing إلى جزيئات ودوامة بقوة لمدة دقيقة أخرى.
- احتضان الجسيمات مع opsonizing كاشف عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي الجسيمات لمدة 5 دقائق في 500 x ج، وإزالة supernant تحتوي على فائض opsonizing كاشف. يغسل الجسيمات بإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، دوامة ل resuspend بيليه، وينبذ لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- كرر هذه الخطوات مرتين لضمان طهاية السليم وإزالة الأجسام المضادة غير منضم.
- إعداد حل العاملة من الجسيمات opsonized عن طريق إعادة التعليق عليها خلال 5 مل من وسائل الإعلام (كاف لأحد وحة 96-جيدا) وتخزينها بعيدا عن الضوء حتى بالإضافة إلى الخلايا.
3. البلعمة
- وضع الحل تعمل الجسيمات في خزان كاشف العقيمة. من هنا، إضافة 5056؛ ل من الجسيمات opsonized إلى الخلايا التي أعدت في الخطوة 1 (لتركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل)، وتسمح البلعمة لتحدث في الظروف ثقافة الخلية القياسية. يتضح فيما يلي طريقتين من البلعمة التي يمكن تقييمها باستخدام هذه الطريقة (الشكل 2).
الرسم البياني 2: مقارنة مستمرة مقابل مزامنة البلعمة البلعمة المستمر يشير استيعاب مستمر من الجسيمات على مر الزمن لأنها تصل ببطء الخلايا في أسفل البئر. خطوة تزامن المتناقضة (الطرد المركزي) القوات الجسيمات لتنزل الى القاع، وتعزيز الاتصال مع الجسيمات الخلية، ويؤدي إلى استيعاب فوري من قبل الخلايا. البلعمة متزامنة هي عملية أسرع التي internalizes بسرعة أكبر جزءicles نتيجة لزيادة الخلايا: اتصال الجسيمات.
- للتعرف على طريقة البلعمة المستمر (الشكل 2) التي تسمح للخلايا في phagocytose باستمرار البكتيريا opsonized لأنها تغرق ببطء إلى أسفل وتأتي في اتصال مع خلايا، واستخدام أطر زمنية أطول للسماح للبكتيريا لتصل إلى قاع البئر والحصول في اتصال مع الخلايا. إذا إجراء التجربة timecourse، إضافة البكتيريا على فترات زمنية مختلفة، ووقف لوحة كاملة من ردود الفعل في الوقت نفسه لتعزيز سرعة المعالجة.
- للأسلوب متزامنة البلعمة (الشكل 2) أن يعزز الجسيمات: الاتصال الخليوي عبر الطرد المركزي، وتدور أسفل لوحة كاملة تحتوي على الخلايا والجزيئات (5 دقائق في 500 x ج) في أقرب وقت يتم إضافة جزيئات، لتسهيل مزامنة كافة النقاط الزمنية و لتعجيل الجسيمات: تفاعل الخلية.
- قياس بالطبع وقت البدء مباشرة بعد الانتهاء من centriخطوة fugation. إذا إجراء التجربة بالطبع الوقت، ووقف كل نقطة زمنية بشكل مستقل على فترات زمنية مختلفة كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: أسلوب البلعمة متزامنة إلى حد ما أكثر شاقة من سابقتها، ولكن يوفر مؤشر أكلة أعلى في وقت أقصر.
4. وقف البلعمة
- لخلايا ملتصقة، وإزالة طاف وإضافة 50 ميكرولتر من المخفف الأزرق التريبان مع PBS (1: 2 التخفيف)، من أجل إخماد مضان من البكتيريا غير المنضوية.
- للخلايا غير ملتصقة، وتدور أسفل لوحة وإزالة طاف. إضافة 50 ميكرولتر من المخفف الأزرق التريبان. ضمان لأجهزة الطرد المركزي لوحة في (5-10 دقيقة في 500 x ج) بين كل غسل من أجل تقليل الخسائر الخلية وتمكين غسل كاف.
- وبعد حضانة التريبان، وغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي التريبان المتبقية (حتى إزالة PBS من البئر يتحول واضح). TRوقد تبين ypan لإرواء مضان 15،16 من غير المنضوية-fluorescently المسمى، قتل الحرارة، والجسيمات البكتيرية، ولكن ليس للبكتيريا حية أو الخرز OPDex. للبكتيريا الحية، وتشمل غسل مع المضادات الحيوية مثل البنسلين، الستربتومايسين، أو جنتاميسين بدلا من غسل التريبان لتجنب آثار الخلط من مضان من جزيئات غير المنضوية.
- إصلاح الخلايا مع 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم تغسل مع PBS (في 100 ميكرولتر لكل بئر لكل غسل). في هذه الخطوة، وحفظ الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع، أو الانتقال مباشرة إلى تلطيخ النوعي والكمي.
ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة شكل يمكن أن يتم هذه النقطة مقدمة خارج الخلية هود الثقافة. - إزالة جميع السائل، وإضافة 50 ميكرولتر من دابي في 5 نانوغرام / مل تشكيلها في برنامج تلفزيوني. سماح 5 دقائق للتلطيخ، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. بعد الخطوة غسل، إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على كل البلعمة جيدا وقياسية.
5. أكتين تلطيخ
ملاحظة: بالإضافة إلى البلعمة، وطريقة فلوروميتريك تمكين الكمي لبلمرة أكتين عن طريق قياس كثافة الأكتين، والتي يتم تقليل خلال تثبيط أقدام صفاحية، pseudopodiae، وغشاء الإزعاج نتيجة في المعاملة مع مثبط (الشكل 1A). وهذه خطوة اختيارية اذا كانت مهتمة في القياس الكمي للبلمرة أكتين بالإضافة إلى البلعمة. إذا البلمرة أكتين هو الهدف النهائي، وذلك باستخدام جزيئات الفلورسنت لالبلعمة هو اختياري.
- بعد تثبيت بارافورمالدهيد (الخطوة 4.3)، وغسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني في 100 ميكرولتر لكل بئر لكل غسل. إضافة 50 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني عن permeabilization واحتضان ل-5 دقيقة في RT.
- تغسل 0.1٪ تريتون X-100 2 مرات مع برنامج تلفزيوني (كما سبق)، ومنع مع 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 20 دقيقة لتجنب غير محددة وملزمة من العلامهل.
- بعد حجب، وإزالة الحل BSA وإضافة رودامين phalloidin على الفور. لتحضير محلول العمل من رودامين صمة عار، واستخدام 100 ميكرولتر من حل methanoic (المقدمة من الشركة المصنعة) في 5 مل من برنامج تلفزيوني (كاف لوحة واحدة). من حل العاملة إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بعد الخطوات غسل وتلوين دابي كما في الخطوة 4.4 خلايا سيكون جاهزا للالكمي.
6. الكمي
- لقياس البلعمة باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت، مخضر قياسي باستخدام فلتر الإثارة في λ = 488 نانومتر، وتصفية الانبعاثات في مضان λ = 518 نانومتر، والأزرق باستخدام فلتر الإثارة في λ = 355 نانومتر، وتصفية الانبعاثات في λ = 460 نانومتر.
- لقياس بلمرة الأكتين باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت، سجل مضان الأزرق عبر λ = 355 نانومتر، وλ = 460 نانومتر (كما سبق)، والأحمر انفلونزاorescence عبر فلتر الإثارة في λ = 584 نانومتر، ومرشح الانبعاثات λ = 620 نانومتر.
ملاحظة: المداري أو الكشف المركزي مقبولة للتسجيل. بعض أنواع الخلايا تتجمع أكثر إلى حافة البئر من المركز، وفي هذه الحالة تسجيل المداري يمكن أن تكون ذات فائدة. على وجه الخصوص، ويمكن أيضا أن تستخدم بمعدل ثلاث نقاط حول المدار للحصول على نتائج أكثر دقة. - تقسيم RFU الكلي للمضان أخضر أو أحمر من قبل قراءات مضان الزرقاء (من دابي)، اعتمادا على الملصق الجسيمات أو أكلة مقابل الكمي الأكتين (الشكل 1). ونظرا لارتفاع التباين لوحة إلى لوحة، واستخدام المؤشرات النسبية (مثل نسبة إلى T = 0 السيطرة)، لتوضيح أفضل الاتجاهات التي لوحظت وتسهيل التحليل الإحصائي أكثر موثوقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بطريقتين رئيسيتين من قياس البلعمة والبلمرة أكتين اللاحقة من خلال استخدام هذا البروتوكول هو لمراقبة مستمرة البلعمة أو متزامنة.
ويوضح التحليل المجهري (الشكل 1B) صور الفلورسنت مماثلة لما التألق وتسجيل (انظر أيضا الشكل 1). في الشكل 1B هي مضان أحمر من الأكتين والأخضر 268 مضان FITC تسميات HKOP E. القولونية، دابي وصمة عار النووية، والصورة المدمجة من كل ثلاثة 269 fluorophores معا. هذه الصورة تشير البلعمة فعالة، البلمرة أكتين، و 270 فعالية التبريد التريبان من جزيئات غير المنضوية.
البلعمة متواصلة من الجسيمات opsonized وunopsonized هي مماثلة تماما كما رأينا في الشكل 2A وC على التوالي، حيث خلايا J774 بتدخيل الخرز ديكستران. ومن المثير للاهتمام، البلمرة أكتين opsonoph التاليةزيادات agocytosis، يتباطأ في نقاط زمنية لاحقة (الشكل 2B)، في حين أن الأكتين البلمرة استيعاب التالية من الجسيمات unopsonized لا يزيد (الشكل 2D). وهذا أمر مهم للنظر للدراسات المستقبلية دراسة هذه العمليات منذ opsonophagocytosis يؤدي إلى أكبر بكثير بلمرة الأكتين من استيعاب الجسيمات التي لم يتم opsonized. أيا من الأساليب أكلة باستخدام الجزيئات ديكستران يؤدي إلى تغييرات في بقاء الخلية كما أكد من خلال تحليل MTT (الشكل 2E).
وخلافا للزيادة مستمرة الاتجاهات التي لوحظت خلال البلعمة مستمرة (الشكل 2)، البلعمة متزامنة من الخرز ديكستران opsonized لديها على شكل جرس الاتجاه (الشكل 3A)، والتي تبين انخفاض في استيعاب التالية 30 دقيقة. هذا أمر متوقع بالنظر وقت المعالجة وطبيعة البروتوكول. ويؤكد هذا الاتجاه أيضا من قبل بول الأكتينالبيانات ymerization (الشكل 3B) من هذه الخلايا حيث أعلى نقطة زمنية البلمرة هي في وقت مبكر من timecourse، بينما في 30 دقيقة عوائد البلمرة إلى خط الأساس. على الرغم من أن المزيد من العمل المكثف، هذا الأسلوب يحتوي على قيمة دراسة البلعمة مباشرة بعد التزامن، وبالتالي دراسة الآثار أكلة فورية.
الشكل 1: متحد البؤر المجهري البلعمة والأكتين البلمرة سمح خلايا لاستيعاب FITC حبة OPDex مترافق (الأخضر) في 20: 1 حبة: نسبة الخلايا لمدة 60 دقيقة، ثم تم غسلها الخلايا مع التريبان وPBS، الثابتة مع paraforlmaldehyde، permeabilised مع الأسيتون، والملون لF-الأكتين باستخدام phalloidin رودامين (الحمراء)، ودابي (الأزرق). وتوضح الصور التحليل المجهري متحد البؤر في 60X مع التكبير الرقمي إضافي؛ (A) مثقال ذرةشريط ه = 10 ميكرون (B) شريط أبيض = 50 ميكرون. (A) يوضح التغيرات في الأكتين البلمرة التالية إضافة المانع. النصال تشير تشكيل أقدام كاذبة، والسهام تشير إلى تغيرات في الغشاء الإزعاج. تم تعديل الشكل 1A من نينكوفيتش وروي 12. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل فلوروميتريك التالية مستمرة البلعمة الضامة الفئران J774 كانت مطلية على طبق من ذهب 96-جيدا ومعرضة للالخرز ديكستران في كميات متفاوتة من الزمن، بدءا من 90، 60، 45، 30، و 15 دقيقة. أضيفت حبات في أوقات مختلفة وعمليات أكلة لتوقفت جميع ردود الفعل في نفس الوقت. خلاياتم غسلها مع التريبان، الثابتة والملون، وتحليلها لالبلعمة من opsonized (A) أو unopsonized (C) جزيئات ديكستران والأكتين البلمرة المرتبطة مع بعضها (B، D على التوالي). وقد أجريت (E) MTT فحص البلعمة التالية مباشرة في مختلف نقاط الوقت. تم تعديل هذا الرقم من نينكوفيتش وروي 12.
الشكل 3: تحليل فلوروميتريك التالية البلعمة متزامنة وصفت FITC اضيفت حبات OPDex لJ774 خلايا البلاعم الفئران مطلي في لوحات 96-جيدا في مناطق ذات كثافة خلية من 10 4 خلية / جيد. بعد حضانة 30 دقيقة تم طرد لوحة في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تم إيقاف البلعمة في وقت واحد، في نقاط زمنية ورد في محور س من قبل غسل التريبان، تليها PBS يغسل، fixati بارافورمالدهيدعلى والأكتين تلطيخ. تم تعديل هذا الرقم من نينكوفيتش وروي 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القيود الرئيسية للتقنية فلوروميتريك هي التباين التجريبية فضلا عن فقدان الخلايا المرتبطة الغسيل واستخدام الخلايا غير ملتصقة واسعة النطاق.
ويلاحظ التباين إلى حد كبير بسبب الاختلاف في جزيئات الفلورسنت كما وزنها وpipetting لأثناء إعداد محلول المخزون ليست الطريقة الصحيحة للحفاظ على أعداد مماثلة من جزيئات من تجربة إلى تجربة. لمعالجة مشكلة التباين بين التجارب والبيانات يمكن التعبير من الناحية النسبية، على سبيل المثال كنسبة مئوية البلعمة أو طيها التغيير من التحكم (السيطرة - ر = 0؛ الجسيمات وأضاف وإزالة فورا). هذا النوع من التحليل يولد اتجاهات استنساخه، وقيم٪ البلعمة من سيطرة مشابهة من تجربة إلى تجربة. وهذا النوع من تحليل البيانات تسهيل دلالة إحصائية مع 3-6 مكررات التجريبية. تقنية فلوروميتريك يمكن استخدامها لدراسة فعالية وتتكاثر الاتجاهات الملحوظة دespite من تقلباته إذا باستخدام تحليل البيانات الكافية. مع اتقان هذه التقنية من الممكن لعالم واحد لتشغيل ما يقرب من ستة لوحات 96-جيدا، أو 600 العلاجات في يوم واحد.
وقد لوحظ فقدان الخلية إلى حد كبير في الدراسات مع أنواع الخلايا غير ملتصقة. أنواع الخلايا الملتصقة هي الأفضل لاستخدامها في طرق مثل هذا واحد لأنها يمكن أن تحمل العديد من واسعة خطوات الغسيل.
وينبغي اتخاذ الخطوات الحاسمة الكبرى للحفاظ على مكونات الفلورسنت بعيدا عن الضوء المباشر لتجنب الصورة التبييض. الجسيمات، والعلامات، واللوحة التي تحتوي على كل أو جميع مكونات يجب أن تبقى في الظلام (أو ملفوفة ببساطة في رقائق الألومنيوم). عنصر أساسي آخر هو أهمية مكررات التقنية داخل اللوحة. بسبب ارتفاع جيد لالتباين بشكل جيد لا بد من خلط جميع الكواشف جيدا قبل pipetting لوأن يكون 6-8 مكررات لكل معاملة الفنية (أي ما يعادل صف واحد)، من أجل مOST مراقبة بدقة الاتجاهات في البيانات.
اعتبارات إضافية هامة لاستخدام أشكال لوحة مثل هذه، هو أن الآبار لوحة تحتوي على كميات صغيرة نسبيا من الكواشف وغالبا ما تكون عرضة للتبخر. إذا كانت العلاجات هي أطول من 24 ساعة، فمن المستحسن استخدام الآبار المحيطية من لوحة (الصفوف والأعمدة بجوار حافة) تحتوي على برنامج تلفزيوني وحدها، وذلك لتكون بمثابة الرطوبة والحد من تبخر سائل الإعلام ثقافة الخلية ومنبهات.
هذه التقنية بسيطة إلى حد ما لإتقان واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المعنية هو الحد الأدنى. من المهم اختيار طريقة أكلة المناسب للدراسة وأن نكون حذرين في حين غسل (وخاصة عند استخدام الخلايا غير ملتصقة) وذلك لتجنب فقدان الخلية.
أهمية كبرى للتقنية فلوروميتريك هو أنه يوفر طريقة الإنتاجية العالية لفحص الفلورسنت استيعاب الجسيمات، أو البلمرة أكتين. معظم رechniques تستخدم حتى الآن مثل المجهري أو علم الأحياء المجهرية هي أكثر كثافة عمالية وأكثر استهلاكا للوقت في المقارنة. تدفق يستخدم الخلوي مبادئ مماثلة جدا لقياس التألق، ولكن يأخذ ساعات لقياس مقارنة دقيقة المطلوبة من التألق. ولذلك، فإن الطريقة فلوروميتريك هو بديل جيد للطرق الحالية من أكلة الكمي يرجع إلى حد كبير إلى القدرات الإنتاجية العالية لها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
