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Immunology and Infection

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52195

Abstract

Das Ziel der fluorometrischen Analyse ist es, als eine effiziente, kosteneffektive und qualitativ Durchsatzverfahren zur Analyse von Phagozytose und andere zelluläre Prozesse dienen. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen, sowohl adhärenten und nicht-adhärenten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Eigenschaften zu untersuchen. Bei der Untersuchung von Phagozytose, fluorometrische Technik nutzt phagozytischen Zelltypen, wie Makrophagen und fluoreszenzmarkierten opsonierten Partikel, deren Fluoreszenz in Gegenwart von Trypanblau ausgelöscht werden. Nach Plattierung der adhärenten Makrophagen in 96-Well-Platten, fluoreszierenden Partikeln (grün oder rot) verwaltet und Zellen werden für unterschiedliche Zeitdauern zu phagozytieren. Nach Internalisierung von fluoreszierenden Teilchen, werden die Zellen mit Trypan-Blau, das Erlöschen des Fluoreszenzsignals von den Bakterien, die nicht internalisiert werden, oder lediglich an der Zelloberfläche anhaften erleichtert gewaschen. Nach dem Trypan Waschen werden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert, einnd mit DAPI (blau Atomfluoreszenzmarkierung), die Kerne von Zellen zu markieren dient gefärbt. Durch eine einfache fluorometrische Quantifizierung durch die Platte Lesen von Kern (blau) oder Partikel (rot / grün) Fluoreszenz können wir das Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grünen untersuchen: blau und bestimmen einen phagozytischen Index, der Menge an Fluoreszenz Bakterien verinnerlicht pro Zelle. Die Dauer des Assays unter Verwendung einer 96-Well-Verfahren und ein Mehrkanal-Pipetten zum Waschen, vom Ende der Phagozytose zu Ende der Datenerfassung, weniger als 45 min. Durchflußzytometrie könnte in ähnlicher Weise verwendet werden, aber der Vorteil der Fluorometrie ist seine hohe Durchsatz, schnelles Verfahren zur Beurteilung mit minimaler Manipulation von Proben und schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Ähnliche Strategien können zu nicht anhaftenden Zellen, Live-markierten Bakterien, Aktin-Polymerisation, und praktisch jedes Verfahren, bei dem Fluoreszenz angewendet werden. Daher ist Fluorometrie eine vielversprechende Methode wegen seiner geringen Kosten, hoher throughput-Fähigkeiten bei der Untersuchung von zellulären Prozessen.

Introduction

Quantifizierung der Fluoreszenzsignal wurde in großem Umfang in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Methoden, die von PCR verwendet, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse ELISA multiplexen. Fluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung hat eine breite Anwendung und kann ein großes Werkzeug für die quantitative Analyse von verschiedenen zellulären Prozessen sein. Verwendung von fluoreszierenden Markierungen mit Signal in den letzten zehn Jahren revolutioniert worden, und das Auftreten von Fluoreszenzplattenleser hat den hohen Durchsatz Quantifizierung der Fluoreszenz während zellulären Prozessen emittierten erleichtert.

Fluorometrische Analyse kann als großartiges Werkzeug in die Quantifizierung der Phagozytose zu dienen. Phagozytose wurde seit der Entdeckung durch Phagozyten Metchnikoff 1800 1 untersucht. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von Verfahren verwendet worden, um diese wichtige Prozess prüfen wesentlich für angeborene Immunabwehr gegen eindringende bakteriellen, viralen, Pilz- und parasitären Erregern 2-5. Bisherige Verfahren zur Quantifizierung genutzt Mikroskopie und stereoTechniken, um Zellen, die phagozytierenden werden, die dann durch Zählen von internalisierten Partikeln (manuell oder unter Verwendung von Software) 6-8 quantifiziert wurden visualisieren. Einige Nachteile der Verwendung Mikroskopie allein zur quantitativen Analyse sind, dass eine manuelle Auszählung der Bakterien ist arbeitsintensiv und anfällig für ein Vorurteil des Beobachters. Ein weiteres bei der Quantifizierung der Phagozytose verwendete Methode ist die mikrobiologische Verfahren der Plattierung von Bakterien aus Zelllysaten (folgenden Phagozytose) auf Bakterienkulturplatten, aber dieses Verfahren kann nicht für bakterizide Mechanismen und Gegenwart von partiell internalisierte Bakterien stellen. Diese Methode ist noch arbeitsintensiv im Vergleich zu Mikroskopie und dauert mehrere Tage, um zu analysieren. Durchfluss-Zytometrie scheint, um die schnellste und effektivste Weg, um Phagozytose zu quantifizieren und wurde von vielen Gruppen 9-11 verwendet worden, aber die hohen Kosten allgemein mit der im zugehörigenInstrument für die Analyse erforderlich macht es die teuerste Methode im Vergleich zu den zuvor genannten Assays.

Die fluorometrische Methode ist eine gute Alternative zu Zytometrie zur Analyse von Partikel Internalisierung fließen denn es bietet unvoreingenommene Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe von Geräten, die nicht so kostspielig. Andere zusätzlichen Vorteile der Fluorometrie sind hoher Wirkungsgrad und eine hohe Durchsatzvermögen zu quantifizieren Fluoreszenz von den markierten Partikeln emittierte internalisiert.

Vorteile der Fluorometrie kann Quantifizierung andere als Phagozytose Prozessen extrapoliert werden. Beispielsweise kann fluorometrische Analyse angewendet werden, um jeden Prozess, der auf Veränderungen in der Expression von intrazellulären oder membrangebundene Rezeptoren, Veränderungen in der Zelldurchlässigkeit / Lebensfähigkeit Transfektionseffizienz und Modulation in einer Aktin-Polymerisation zu untersuchen. Ein Nachteil der fluorometrischen Technik ist, dass, abhängig von den verwendeten Etiketten, es kann eine hoch seinExperiment, um die Variabilität in der Regel durch den Nachweis von Daten über relative Quantifizierung, wie fache Veränderung oder Prozent aus Steuer gelöst werden können, zu experimentieren.

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Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll kann für mehrere Anwendungen, wie die Quantifizierung der Phagozytose und Aktin-Polymerisation verwendet werden, wie in unserer früher veröffentlichten Arbeit 12 verwendet. Das Protokoll eignet sich für eine Vielzahl von Modifikationen und Tabelle 1 listet Zelltypen und Teilchen erfolgreich in früheren Studien verwendet. Standard Verwendung dieses Protokolls für die Quantifizierung der Phagozytose oder der Aktin-Polymerisation ist in Abbildung 1 dargestellt.

Diagramm 1

Diagramm. 1: Schema der fluorometrischen Assay zur Quantifizierung der Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Nachdem die Zellen plattiert, behandelt, und man ließ sie haften Teilchen mit grüner Fluoreszenz (FITC) markiert sind, zu den Zellen für die Phagozytose aufgenommen. Die Reaktion wird durch Trypanblau oder antibi gestopptOhrwäsche (auf nicht internalisierten Partikel zu beseitigen) und Fixierung mit 4% Paraformaldehyd durchgeführt. Die Zellen werden anschließend mit rot fluoreszierende Aktin-Etikett (Rhodamin-Phalloidin) und blau fluoreszierende Markierung (DAPI) gefärbt. Indizes der Phagozytose und Aktin-Polymerisation werden als Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grün / blau (FITC / DAPI) oder rot / blau (Rhodamin / DAPI) Fluoreszenz quantifiziert.

1. Auflage und Behandlung von Zellen

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, Erwägung ziehen, die Behandlungen mit mindestens 4 technische Replikate und umfassen die folgenden Steuerelemente in der Platte Layout: Zellen, die nur (ungefärbt, mit DAPI allein oder Rhodamin allein) und Partikel nur.

  1. Führen die gesamten Zugabe der Reagenzien in den Schritten in einem sterilen Zellkulturhaube, um die Proben vor Verunreinigung zu schützen 1-4.
  2. Platte Makrophagen (J774 murine Zelllinie) in einer 96-Well-Platte bei 1-5 × 10 4 Zellen in 50 & mgr; l (pro Vertiefung) der vorgeheizten Medien ergänzt. Ideal Platten für diese Methode sind schwarz 96-well Platten mit klarem oder schwarz Böden in Abhängigkeit von Lesefähigkeiten.
    1. Für ergänzten Medium verwenden 10% hitzeinaktiviertem FBS, um Störungen der Komplementkaskade zu vermeiden, und 1% Penicillin / Streptomycin (wenn nicht mit lebenden Bakterien zur Phagozytose). Bei der Verwendung von adhärenten Zellen ermöglichen 1-2 h für die Haftung und für die nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte mit den Zellen für 10 Minuten bei 500 x g.
  3. Hinzufügen gewünschten Agonisten / Antagonisten oder Fahrzeugsteuerung in 2facher Konzentration (in PBS resuspendiert oder bevorzugter in ergänztem Medium) in 50 & mgr; l für ein Endvolumen von 100 ul (1x) und Inkubation für eine gewünschte Zeitdauer. Mehrkanalpipette und Reagenziengefäßen wird schnellsten Verarbeitung zu erleichtern.

2. Opsonisierung von fluoreszierenden Partikeln

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Tabelle 1: Getestete Zelltypen und Leuchtstoffpartikeln in fluorometrischen Analyse Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Tabelle 1 zeigt Kombinationen von Zelltypen (Zelllinien und Primärzellen), hat unsere Gruppe über das fluorometrische Verfahren verwendet.. Andere als Blick auf die Phagozytose und Aktin-Polymerisation von Wildtyp-Zellen, haben wir auch einige dieser Partikel verwendet zur Untersuchung der Phagozytose von transfizierten Zellen ein GFP (green fluorescent protein) abzugeben. . Fluoreszenz der Zellen mit Plasmiden, die fluoreszierende Reporter transfiziert kann auch als zellulärer Marker neben DAPI Tabelle Beschriftung verwendet: A - Aktin-Polymerisation; P - Phagozytose; PT - Phagozytose von GFP-markierten transfizierten Zellen; OPDex - opsonisierten Dextran Wulst; HKOP - Wärme getötet opsonisierten.

  1. Stellen Sie sicher, dass die Leuchtstoffpartikel und Etiketten sind aus Licht zu jeder Zeit geschützt, during Verarbeitung, Waschen, als auch während der Inkubation, um die Photobleichung zu verhindern
    1. Für trockene Partikel, abwiegen fluoreszierende Hitze getötet opsonisierten (HKOP) Bakterien (E2861: E. coli K-12-Stamm), mit Herstellerangaben. Achten Sie darauf, dass die Masse macht 10 zu machen: 1 - 20: 1-Bakterien: Zellverhältnis (oder zumindest eine 10: 1-Verhältnis - häufig in Quantifizierung der Phagozytose genutzt) 13,14. Zahl der Partikel kann durch den Hersteller oder vorgesehen, über couting seriellen Verdünnungen von 1 mg / ml Stammlösung bestimmt werden.
    2. Resuspendieren in 50 ul PBS und Vortex für 1 Minute bei höchster Stufe. Sorgen Sie für sorgfältige Vortex (hier und in der Protocol), wie die Partikel zur Aggregation neigen, die Wirksamkeit von Opsonisierung auswirken können.
    3. Für Partikel in Suspension, wie fluoreszenzmarkierte Dextranperlen (DEX Kügelchen), Wirbel die Vorratslösung für 1 min, zu 50 ul der Suspension oder in Abhängigkeit von der Perlenkonzentration im Volumen determine Berg der Perlen zu erleichtern 10: 1 Perle: Zellverhältnis.
  2. Gleiches Volumen des opsonierende Reagenz auf die Partikel und kräftig vortexen für eine weitere Minute.
  3. Die Teilchen Inkubieren mit Opsonisieren Reagenz bei 37 ° C für 1 Stunde.
  4. Nach der Inkubation zentrifugiert werden die Partikel für 5 Minuten bei 500 · g, und entfernen Sie den Überstand mit überschüssigem opsonierende Reagenz. Waschen der Teilchen durch Zugabe von 100 ul PBS, um Wirbel des Pellets und Zentrifugat für 5 min bei 500 x g zu resuspendieren.
    1. Wiederholen Sie diese Schritte zweimal, um die ordnungsgemäße Opsonisierung und Entfernung der nicht gebundenen Antikörper zu gewährleisten.
  5. Herstellung der Arbeitslösung von opsonisierten Partikeln durch Resuspendieren in 5 ml Medium (ausreichend für eine Platte mit 96 Vertiefungen) und weg von Licht zu speichern, bis hinaus zu den Zellen.

3. Phagozytose

  1. Legen Sie die Arbeitslösung von Partikeln in einem sterilen Reagenzreservoir. Von hier aus werden 5056; l opsonisierten Partikeln zu den Zellen aus Schritt 1 (bei ​​einer Endkonzentration von 50 ng / ml) hergestellt und ermöglichen es die Phagozytose an Standard-Zellkulturbedingungen auftreten. Die nachstehende Abbildung zeigt zwei Methoden der Phagozytose, die mit dieser Methode (Bild 2) bewertet werden können.

Diagramm 2
Diagramm. 2: Vergleich der kontinuierlichen Vergleich synchronisieren Phagozytose Continuous Phagozytose zeigt permanenten Internalisierung von Teilchen mit der Zeit, da sie bei sich langsam die Zellen auf dem Boden der Vertiefung. Ein kontrasSynchronisationsSchritt (Zentrifugation) zwingt die Teilchen auf den Boden sinken, die Verbesserung der Partikel Kontakt mit der Zelle und führt zu sofortiger Internalisierung durch die Zellen. Synchronisierte Phagozytose ist ein schneller Prozess, der schneller verinnerlicht Teilicles aufgrund der erhöhten Zell: Partikelkontakt.

    1. Für die kontinuierliche Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Zellen kontinuierlich zu phagozytieren opsonisierten Bakterien, wie sie langsam zu Boden sinken und in Kontakt mit Zellen, nutzen mehr Zeitrahmen, damit für die Bakterien, um die Unterseite des Brunnens zu erreichen und in erlauben Berühren Sie mit den Zellen. Wenn die Durchführung einer Zeitverlaufsexperiment, fügen Bakterien in unterschiedlichen Zeitintervallen und stoppen die gesamte Platte aus Reaktionen bei der gleichen Zeit, um die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu erhöhen.
    2. Für die synchronisierte Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Partikel verbessert: Zell-Kontakt durch Zentrifugation, drehen Sie die gesamte Platte, die Zellen und Partikel (5 min bei 500 xg), sobald die Partikel aufgenommen, um die Synchronisation von allen Zeitpunkten zu erleichtern und Zell-Interaktion: das Teilchen zu beschleunigen.
      1. Messung des zeitlichen Verlaufs beginnend unmittelbar nach Beendigung der centrifugation Schritt. Wenn die Durchführung einer Zeitverlauf Experiment zu stoppen jeder Stelle unabhängig in unterschiedlichen Zeitabständen, wie unten beschrieben.

HINWEIS: Die synchronisierte Phagozytose Methode ist etwas aufwendiger von dem vorherigen, aber eine höhere phagozytischen Index in einer kürzeren Zeit.

4. Stoppen Phagozytose

  1. Für adhärente Zellen, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 50 ul Trypanblau verdünnt mit PBS (1: 2 Verdünnung), um die Fluoreszenz von nicht internalisierte Bakterien auszulöschen.
  2. Für nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte und entfernen Überstand. In 50 ul verdünnt Trypanblau. Zu gewährleisten, um die Platte um (5-10 min bei 500 xg), die zwischen jedem Waschen, um die Zellenverlust zu minimieren und ermöglichen ein ausreichendes Waschen Zentrifuge.
  3. Nach Trypan Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um restliche Trypan zu entfernen (bis die PBS entfernt vom Bohrloch dreht sich frei). Trypan wurde gezeigt, dass Fluoreszenz 15,16 der nicht internalisierte fluoreszierend markierten, durch Hitze abgetöteten Bakterienpartikel quenchen, aber nicht für lebende Bakterien oder OPDex Perlen. Für lebende Bakterien, zählen ein Waschgang mit Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin oder anstelle des Trypan waschen, um verwirrende Auswirkungen der Fluoreszenz von nicht internalisierte Partikel zu vermeiden.
  4. Fix Zellen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd, und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, dann Waschen mit PBS (100 & mgr; l pro Vertiefung für jeden Waschgang). Bei diesem Schritt speichern Sie die Zellen bei 4 ° C bis zu einer Woche, oder gehen Sie direkt zum Färben und Quantifizierung.
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte bilden diesen Punkt Vorwort außerhalb des Zellkulturhaube durchgeführt werden.
  5. Entfernen Sie alle flüssigen und fügen Sie 50 ul der DAPI bei 5 ng / ml in PBS rekonstituiert. Lassen Sie 5 Minuten für die Färbung und dann zweimal mit PBS waschen. Nach dem Waschschritt werden 50 ul PBS in jede Vertiefung und Aufzeichnungs Phagozytose.

    5. Aktinfärbung

    HINWEIS: Neben Phagozytose wird fluorometrischen Verfahren die Quantifizierung von Aktin-Polymerisation durch Messung der Intensität von Aktin, die während Hemmung Lamellipodien pseudopodiae verringert wird, und die Membran Kräuseln infolge der Behandlung mit einem Inhibitor (1A) zu ermöglichen. Dies ist ein optionaler Schritt, wenn in Quantifizierung Actinpolymerisation interessiert neben der Phagozytose. Wenn Actinpolymerisation das Endziel ist, unter Verwendung von fluoreszierenden Teilchen zur Phagozytose ist optional.

    1. Nach Para Fixierung (Schritt 4.3), waschen Sie die Platte zweimal mit PBS auf 100 ul pro Vertiefung für jeden Wasch. Dann werden 50 ul 0,1% Triton X-100 in PBS zur Permeabilisierung inkubieren -5 min bei RT.
    2. Mit PBS auswaschen 0,1% Triton X-100 2-mal (wie oben), und der Block mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 20 min nicht-spezifische Bindung von Elbe zu vermeidenl.
    3. Nach der Blockierung entfernen Sie die BSA-Lösung und sofort hinzufügen Rhodamin-Phalloidin. Um die Arbeitslösung von Rhodamin-Färbung vorzubereiten, verwenden Sie 100 ul der Methanlösung (des Herstellers) in 5 ml PBS (ausreichend für eine Platte). Von der Arbeitslösung werden 50 ul pro Vertiefung und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Im Anschluss an die Waschschritte und DAPI-Färbung, wie in Schritt 4.4 Zellen bereit für die Quantifizierung können.

    6. Quantifizierung

    1. Um die Phagozytose unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten grüne Fluoreszenz mit Anregungsfilter bei λ = 488 nm und Emissionsfilter bei λ = 518 nm und blaue Fluoreszenz quantifiziert mit Anregungsfilter bei λ = 355 nm und Emissionsfilter bei λ = 460 nm.
    2. Um die Aktin-Polymerisation unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten blaue Fluoreszenz über λ = 355 nm und λ = 460 nm (wie oben), und rot-Grippe zu quantifizierenFluoreszenz durch Anregungsfilter bei λ = 584 nm und Emissionsfilter λ = 620 nm.
      HINWEIS: Orbital oder Zentralerkennung ist für die Aufnahme akzeptabel. Einige Zelltypen zu sammeln mehr an den Rand des Brunnens als in der Mitte, in welchem ​​Fall Orbital Aufnahme kann von Vorteil sein. Insbesondere könnte durchschnittlich drei Punkten um die Umlaufbahn auch verwendet werden, um genauere Ergebnisse zu erhalten.
    3. Teilen Sie die Gesamt RFU der grünen oder roten Fluoreszenz durch blaue Fluoreszenz Anzeige (von DAPI), abhängig von der Partikel Etikett oder phagozytischen gegen Aktin Quantifizierung (Diagramm 1). Aufgrund der hohen Platte-zu-Platte Varianz verwenden relativen Indizes (wie beispielsweise in Bezug auf t = 0 Steuerung), um zu veranschaulichen am besten beobachteten Trends und zuverlässiger statistischer Analyse zu erleichtern.

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Representative Results

Zwei wichtige Arten von Quantifizieren Phagozytose und die anschließende Aktin-Polymerisation durch die Verwendung dieses Protokolls ist es, kontinuierlich oder synchronisiert Phagozytose beobachten.

Die mikroskopische Analyse (1B) zeigt Fluoreszenzbilder vergleichbar, was das Fluorometer aufnimmt (siehe auch Abbildung 1). In 1B sind rote Fluoreszenz von Aktin, grün 268 Fluoreszenz von FITC-Etiketten HKOP E. coli, Kern DAPI-Färbung, und das zusammengefügte Bild aller drei Fluorophore 269 zusammen. Dieses Bild zeigt effektive Phagozytose, Aktin-Polymerisation, und 270 effektiv Trypan Abschrecken nicht internalisierte Partikel.

Kontinuierliche Phagozytose opsonisierten und nicht opsonisiertem Teilchen ziemlich vergleichbar, wie in 2A und C zu sehen ist, wenn J774-Zellen internalisieren Dextranperlen. Interessant ist, dass Aktin-Polymerisation folgenden opsonophagocytosis zunimmt, verlangsamt sich zu späteren Zeitpunkten (2B), die die Aktin-Polymerisation folgenden Internalisierung nicht opsonisiertem Partikel nicht erhöht (Figur 2D). Dies ist wichtig, um für zukünftige Studien zur Untersuchung dieser Prozesse, da Opsonophagozytose führt zu viel größer Actinpolymerisation als Internalisierung von Teilchen, die nicht opsoniert sind zu berücksichtigen. Keines der phagozytischen Methoden mit Dextran-Partikel führen zu Änderungen in der Zelllebensfähigkeit, wie es durch die MTT-Analyse (Figur 2E) bestätigt.

Im Gegensatz zu kontinuierlich steigenden im Dauer Phagozytose (Abbildung 2) beobachteten Trends, synchronisiert Phagozytose von opsonisierten Dextrankügelchen hat eine glockenförmige Trend (3A), welche Reduzierung der Internalisierung nach 30 min. Dies ist zu erwarten Berücksichtigung Verarbeitungszeit und die Art des Protokolls. Dieser Trend wird auch durch den Aktin pol bestätigteymerization Daten (3B) dieser Zellen, wo die höchste Polymerisation Zeitpunkt ist früh im Zeitverlauf, während 30 min Polymerisation kehrt zum Ausgangswert. Obwohl mehr arbeitsintensiv ist, hat diese Methode einen Wert von Phagozytose Prüfung direkt nach der Synchronisation, damit die Prüfung sofort phagozytische Wirkung.

Figur 1
Fig. 1: Konfokale Mikroskopie der Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Zellen durften FITCkonjugierten OPDex Wulst (grün) bei 20 internalisieren: 1 Wulst: Zellen-Verhältnis von 60 min, dann wurden die Zellen mit Trypanblau und PBS gewaschen, mit paraforlmaldehyde fixiert, mit permeabilisierten Aceton, und F-Actin mit Rhodamin-Phalloidin (rot) gefärbt, und DAPI (blau). Bilder illustrieren konfokale mikroskopische Analyse bei 60X mit zusätzlichen digitalen Vergrößerung; (A) White bar = 10 & mgr; m (B) weiße Balken = 50 & mgr; m. (a) zeigt Änderungen der Aktin-Polymerisation nach Zugabe des Inhibitors. Pfeilspitzen zeigen Pseudopodien Bildung und Pfeile zeigen Veränderungen in der Membran Kräuseln. 1A wurde von Ninkovic und Roy 12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Fig. 2: fluorometrische Analyse folgende kontinuierliche Phagozytose J774 murinen Makrophagen wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen plattiert und bis Dextranperlen mit variierenden Mengen an Zeit, beginnend mit 90, 60, 45, 30 und 15 Minuten ausgesetzt. Kügelchen wurden bei verschiedenen Zeiten und die phagozytischen Prozesse für alle Reaktionen wurden gleichzeitig gestoppt zugegeben. Cellswurden mit Trypanblau, fixiert gewaschen, gefärbt und für die Phagozytose von opsonisierten (A) oder nicht opsonisiertem (C) Dextran-Partikel und Aktin-Polymerisation mit jedem (B, D beziehungsweise). (E) MTT-Test wurde durchgeführt, unmittelbar nach der Phagozytose zu verschiedenen verbundenen analysiert Zeitpunkten. Diese Zahl hat sich von Ninkovic und Roy 12 modifiziert.

Figur 3
Fig. 3: fluorometrische Analyse folgenden synchronisierten Phagozytose FITC OPDex Kügelchen wurden J774 murine Makrophagen-Zellen in 96-Well-Platten bei einer Zelldichte von 10 4 Zellen / Vertiefung zugegeben. Nach 30 min Inkubation wird die Platte wurde bei 500 × g für 5 min zentrifugiert. Phagozytose gestoppt wurde ein zu einer Zeit, zu der x-Achse durch Trypan Wäsche, gefolgt von Waschungen mit PBS, Para Befestigungs angegebenen Zeitpunktenauf und Aktinfärbung. Diese Zahl hat sich von Ninkovic und Roy 12 modifiziert.

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Discussion

Hauptbeschränkungen der fluorometrischen Technik sind experimentelle Varianz sowie Zellverlust bei ausgiebigem Waschen und Verwendung von nicht-adhärenten Zellen assoziiert.

Varianz ist weitgehend durch die Variation der Fluoreszenzpartikeln als Wäge- und Pipettieren während der Herstellung der Stammlösung beobachtet keine genaue Möglichkeit der Beibehaltung identischer Teilchenzahlen von Experiment zu Experiment. Um das Problem der Abweichungen zwischen Experimenten befassen, können die Daten in relativen Zahlen als% Phagozytose ausgedrückt werden, zum Beispiel oder falten Wechsel von Kontrolle (Steuerung - t = 0; Teilchen hinzugefügt und entfernt sofort). Diese Form der Analyse generiert reproduzierbare Trends und Werte% Phagozytose von Steuer ähnelt von Versuch zu Versuch. Diese Art der Datenanalyse wird die statistische Signifikanz mit 3-6 Experimentwiederholungen zu erleichtern. Fluorometric Technik kann verwendet werden, um effektiv zu untersuchen und zu reproduzieren beobachteten Trends d werdenrotz seiner Variabilität, wenn eine angemessene Verwendung der Datenanalyse. Mit Beherrschung der Technik ist es möglich, dass eine einzige Wissenschaftler, der etwa sechs 96-Well-Platten oder 600 Behandlungen an einem Tag laufen.

Zellverlust wurde weitgehend in Studien bei nicht-adhärenten Zelltypen beobachtet. Adhärenten Zelltypen sind die besten in Methoden wie diese, weil sie von den zahlreichen und umfangreiche Waschschritte aushalten kann.

Wichtige kritische Schritte sollten unternommen werden, um die Leuchtstoffkomponenten vor direktem Licht fernhalten auf ein Foto, Bleich vermeiden. Partikel, Etiketten, und die Platte mit je oder alle Komponenten sollten in dunklen halten (oder einfach in Aluminiumfolie eingewickelt). Eine weitere wesentliche Komponente ist die Bedeutung der technischen Wiederholungen innerhalb einer Platte. Aufgrund der hohen Brunnen zu Brunnen Varianz ist es wichtig, alle Reagenzien sehr gut zu mischen m vor dem Pipettieren und 6-8 technische Wiederholungen pro Behandlung (entspricht einer Zeile) haben, umOst genau zu beobachten Trends in den Daten.

Weitere Überlegungen wichtig für den Einsatz von Plattenformaten wie diesen ist, dass die Plattenvertiefungen enthalten eine relativ kleine Mengen von Reagenzien und sind oft anfällig für Verdunstung. Wenn die Behandlung länger als 24 Stunden, ist es ratsam, die peripheren Vertiefungen der Platte verwenden (Zeilen und Spalten neben dem Rand) mit PBS allein, um als Luftbefeuchter dienen und Verdampfen von Zellkulturmedien und Agonisten reduzieren.

Diese Technik ist relativ einfach zu beherrschen und die Fehlersuche beteiligt ist minimal. Es ist wichtig, den richtigen phagozytischen Methode zur Untersuchung auswählen und vorsichtig sein, während dem Waschen (insbesondere bei Verwendung von nicht-haftenden Zellen), um den Zellenverlust zu vermeiden.

Große Bedeutung des fluorometrischen Verfahrens ist, daß es ein Verfahren mit hohem Durchsatz zum Screening von fluoreszierenden Teilchen Internalisierung oder Aktin-Polymerisation bietet. Die meisten Techniques bisher verwendeten, wie Mikroskopie oder der Mikrobiologie sind arbeitsintensiv und zeitaufwendig im Vergleich. Durchflusszytometrie nutzt sehr ähnliche Prinzipien wie Fluorometrie, aber dauert Stunden zu beziffern Vergleich zu Minuten mit Fluorometrie erforderlich. Daher ist das fluorometrische Verfahren eine gute Alternative zu derzeitigen Methoden der phagozytischen Quantifizierung weitgehend auf seine Hochdurchsatzkapazitäten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; Molecular Probes F8852 combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate Molecular Probes E2861 reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent Molecular Probes E2870
Rhodamine phalloidin Molecular Probes R415
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Trypan blue Gibco 15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media Gibco Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%) Fischer Scientific AA433689M dilute to 4% before use
96-well plates Greiner 655097 clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)

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Immunologie Fluorometrie Phagozytose Hochdurchsatz-Assay Aktin-Polymerisation Immunologie
High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation
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Ninković, J., Roy, S. HighMore

Ninković, J., Roy, S. High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization. J. Vis. Exp. (93), e52195, doi:10.3791/52195 (2014).

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