Abstract
fluorometric विश्लेषण के लक्ष्य phagocytosis और अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल, लागत प्रभावी, उच्च throughput विधि के रूप में सेवा करने के लिए है। इस तकनीक सेलुलर संपत्तियों की एक किस्म की जांच करने के लिए, पक्षपाती और गैर पक्षपाती दोनों प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म पर इस्तेमाल किया जा सकता है। Phagocytosis का अध्ययन करते हैं, fluorometric तकनीक ऐसी मैक्रोफेज, और जिसका प्रतिदीप्ति trypan नीले रंग की उपस्थिति में बुझा किया जा सकता है fluorescently लेबल opsonized कणों के रूप में phagocytic सेल प्रकार का इस्तेमाल करता है। 96 अच्छी तरह प्लेटें, फ्लोरोसेंट कणों (हरे या लाल) में पक्षपाती मैक्रोफेज की चढ़ाना के बाद प्रशासित रहे हैं और कोशिकाओं समय के विभिन्न मात्रा के लिए phagocytose करने के लिए अनुमति दी जाती है। फ्लोरोसेंट कणों के internalization के बाद, कोशिकाओं भली भाँति नहीं कर रहे हैं, या केवल कोशिका की सतह का पालन कर रहे हैं, जो बैक्टीरिया से फ्लोरोसेंट संकेत के विलुप्त होने की सुविधा है, जो trypan नीले, साथ धो रहे हैं। Trypan धोने के बाद, कोशिकाओं तय, पीबीएस के साथ धो रहे हैं, एकएन डी कोशिकाओं के नाभिक लेबल करने के लिए कार्य करता है जो DAPI (परमाणु नीले फ्लोरोसेंट लेबल), के साथ दाग। थाली परमाणु (नीला) के पढ़ने या कण के माध्यम से एक सरल fluorometric मात्रा का ठहराव तक (लाल / ग्रीन) प्रतिदीप्ति हम हरे रंग के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों के अनुपात की जांच कर सकते हैं: नीले और सेल प्रति भाँति फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की मात्रा का संकेत एक phagocytic सूचकांक का निर्धारण। धोने के लिए एक 96 अच्छी तरह से विधि और मल्टीचैनल pipettes का उपयोग परख की अवधि, डाटा अधिग्रहण के अंत phagocytosis के अंत से 45 मिनट से भी कम है। प्रवाह cytometry एक समान तरीके से इस्तेमाल किया, लेकिन fluorometry का लाभ अपने उच्च throughput, नमूनों की न्यूनतम हेरफेर और सेल प्रति फ्लोरोसेंट तीव्रता के त्वरित मात्रा का ठहराव के साथ मूल्यांकन के तेजी से विधि है हो सकता है। इसी प्रकार रणनीतियों अनिवार्य रूप से गैर पक्षपाती कोशिकाओं, लाइव लेबल वाले बैक्टीरिया, actin के polymerization के लिए, और प्रतिदीप्ति का उपयोग किसी भी प्रक्रिया लागू किया जा सकता है। इसलिए, fluorometry अपनी कम लागत, उच्च throughp के लिए एक आशाजनक तरीका हैसेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन में केन्द्र शासित प्रदेशों क्षमताओं।
Introduction
फ्लोरोसेंट संकेत की मात्रा को व्यापक रूप से प्रवाह cytometry confocal माइक्रोस्कोपी, और एलिसा मल्टीप्लेक्स विश्लेषण झल्लाहट, पीसीआर से लेकर वैज्ञानिक तरीकों की एक भीड़ में इस्तेमाल किया गया है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग और मात्रा का ठहराव एक व्यापक आवेदन किया है और विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक महान उपकरण हो सकता है। फ्लोरोसेंट मार्करों और उनके संकेत का प्रयोग पिछले दशक में क्रांति ला दी गई है, और फ्लोरोसेंट प्लेट पाठकों के उद्भव सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के उच्च throughput मात्रा का ठहराव में मदद की है।
Fluorometric विश्लेषण phagocytosis की मात्रा का ठहराव में एक महान उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं। Phagocytosis 1800 1 में Metchnikoff द्वारा फ़ैगोसाइट की खोज के बाद से अध्ययन किया गया है। इन वर्षों में, तरीकों की एक किस्म बैक्टीरियल, वायरल, फंगल और परजीवी रोगज़नक़ों 2-5 पर हमले के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा रक्षा के लिए आवश्यक इस महत्वपूर्ण प्रक्रिया की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। आदेश में मात्रा का ठहराव का उपयोग किया माइक्रोस्कोपी और stereological तकनीक का पिछला विधियों तो भली भाँति कणों (स्वयं या सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ) 6-8 की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है, जो phagocytosing रहे हैं कि कोशिकाओं, कल्पना करने के लिए। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अकेले माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए कुछ नुकसान बैक्टीरिया के मैनुअल गिनती श्रम गहन और प्रेक्षक पूर्वाग्रह से ग्रस्त है कि कर रहे हैं। Phagocytosis की मात्रा का ठहराव में इस्तेमाल एक अन्य विधि जीवाणु संस्कृति प्लेटों पर (phagocytosis के बाद) सेल lysates से बैक्टीरिया का चढ़ाना के सूक्ष्मजीवविज्ञानी तकनीक है, लेकिन इस विधि जीवाणुनाशक तंत्र और आंशिक रूप से भली भाँति बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए खाते में असफल हो सकता है। इस विधि माइक्रोस्कोपी की तुलना में और भी अधिक श्रम गहन है और विश्लेषण करने के लिए कई दिन लगते हैं। फ्लो phagocytosis यों का सबसे तेज, सबसे प्रभावी तरीका हो रहा है और कई समूहों 9-11 द्वारा उपयोग किया गया है, लेकिन उच्च लागत सामान्यतः में साथ जुड़ेजैसा कि पहले उल्लेख assays के लिए की तुलना में जब विश्लेषण के लिए आवश्यक strument यह सबसे महंगी विधि बनाता है।
fluorometric विधि यह अत्यधिक लागत के रूप में नहीं है कि प्रतिदीप्ति का उपयोग उपकरणों की निष्पक्ष मात्रा का ठहराव प्रदान करता है के बाद से कण internalization के विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry के लिए एक अच्छा विकल्प है। Fluorometry के अन्य अतिरिक्त लाभ उच्च दक्षता, और लेबल भाँति कणों द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति बढ़ाता के लिए उच्च throughput क्षमताओं कर रहे हैं।
Fluorometry के लाभ phagocytosis के अलावा अन्य प्रक्रियाओं की मात्रा का ठहराव के लिए extrapolated किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, fluorometric विश्लेषण actin के polymerization में इंट्रासेल्युलर या झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स, सेल पारगम्यता / व्यवहार्यता, अभिकर्मक प्रभावकारिता में परिवर्तन, और मॉडुलन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए अग्रणी किसी भी प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। Fluorometric तकनीक का एक नकारात्मक पक्ष का इस्तेमाल किया लेबल पर निर्भर करता है, एक उच्च हो सकता है, वह यह है किप्रयोग आम तौर पर इस तरह के गुना परिवर्तन या नियंत्रण से प्रतिशत वृद्धि के रूप में रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के माध्यम से डाटा, प्रदर्शन करके हल किया जा सकता है, जो परिवर्तनशीलता प्रयोग करने के लिए।
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Protocol
नोट: हमारी पहले प्रकाशित काम 12 में उपयोग के रूप में इस प्रोटोकॉल ऐसे phagocytosis और actin polymerization के मात्रा का ठहराव के रूप में कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल संशोधन की एक किस्म को उधार देता है, और 1 टेबल सूचियों प्रकार की कोशिकाओं और कणों सफलतापूर्वक पिछले अध्ययनों में उपयोग किया। Phagocytosis या actin के polymerization के मात्रा का ठहराव के लिए इस प्रोटोकॉल के मानक का उपयोग चित्र 1 में सचित्र है।
चित्र 1:। कोशिकाओं, चढ़ाया इलाज किया, और पालन करने के लिए अनुमति दी जाती है के बाद आरेख phagocytosis और actin polymerization के मात्रा का ठहराव के लिए fluorometric परख की हरी प्रतिदीप्ति (FITC) के साथ लेबल कणों phagocytosis के लिए कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं। रिएक्शन trypan या antibi द्वारा बंद कर दिया गया हैकान धोने (गैर-भाँति कणों को खत्म करने के लिए) और निर्धारण 4% paraformaldehyde के साथ किया जाता है। कोशिकाओं बाद लाल फ्लोरोसेंट actin के लेबल (rhodamine phalloidin) और नीले फ्लोरोसेंट लेबल (DAPI) के साथ दाग रहे हैं। Phagocytosis और actin polymerization के अनुक्रमित हरी / नीले (FITC / DAPI), या लाल / ब्लू (rhodamine / DAPI) प्रतिदीप्ति के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के अनुपात के रूप में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं।
1. चढ़ाना और इलाज प्रकोष्ठों
नोट: शुरुआत से पहले, थाली लेआउट में निम्न नियंत्रण कम से कम 4 तकनीकी प्रतिकृति के साथ उपचार चल रहा है पर विचार, और शामिल हैं: केवल और कण कोशिकाओं केवल (अकेले DAPI या rhodamine अकेले के साथ, बेदाग)।
- संदूषण से नमूनों की रक्षा के लिए एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में 1-4 चरणों में अभिकर्मकों के सभी अलावा आचरण।
- (प्रति अच्छी तरह से) 50 μl में 1-5 एक्स 10 4 कोशिकाओं में एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्लेट मैक्रोफेज (murine J774 सेल लाइन) के preheated के मीडिया पूरक। इस विधि के लिए आदर्श प्लेटें पाठक क्षमताओं पर निर्भर करता है, स्पष्ट या काले पैंदा के साथ काले रंग 96 अच्छी तरह प्लेटें हैं।
- (Phagocytosis के लिए जीवित बैक्टीरिया का उपयोग नहीं हो) पूरक मीडिया के लिए, पूरक झरना के हस्तक्षेप से बचने के लिए FBS के निष्क्रिय 10% गर्मी, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करें। का उपयोग कर पक्षपाती कोशिकाओं 1-2 आसंजन के लिए मानव संसाधन, और गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए अनुमति देते हैं, 500 x जी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ प्लेट नीचे स्पिन।
- 100 μl (1x) के अंतिम मात्रा के लिए 50 μl में 2x एकाग्रता (पूरक मीडिया में, अधिक अधिमानतः पीबीएस में resuspended या) में वांछित एगोनिस्ट / विरोधी या वाहन नियंत्रित करें और समय की एक वांछित राशि के लिए सेते हैं। Multichannel विंदुक और अभिकर्मक जलाशयों सबसे तेजी से प्रसंस्करण की सुविधा होगी।
फ्लोरोसेंट कणों की 2. Opsonization
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तालिका 1: परीक्षण प्रकार की कोशिकाओं और के fluorometric विश्लेषण में फ्लोरोसेंट कणों phagocytosis और actin polymerization की तालिका 1 सेल प्रकार के संयोजन (सेल लाइनों, और प्राथमिक कोशिकाओं) दिखाता है कि हमारे समूह fluorometric विधि के माध्यम से इस्तेमाल किया गया है।। जंगली प्रकार की कोशिकाओं द्वारा phagocytosis और actin polymerization पर देख रहे हैं के अलावा, हम भी एक GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) व्यक्त ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं द्वारा phagocytosis की परीक्षा के लिए इन कणों में से कुछ का उपयोग किया है। । फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से युक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति भी DAPI के टेबल कथा के अलावा एक सेलुलर मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: एक - actin के polymerization के; पी - phagocytosis; पीटी - GFP के द्वारा phagocytosis ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में लेबल; OPDex - dextran मनका opsonized; HKOP - गर्मी opsonized को मार डाला।
- फ्लोरोसेंट कणों और लेबल पर हर समय प्रकाश से रक्षा कर रहे हैं, Dur सुनिश्चित करेंphotobleaching को रोकने के क्रम में, साथ ही गर्मी के दौरान प्रसंस्करण, वाशिंग आईएनजी
- निर्माता विनिर्देशों का उपयोग करते हुए: (ई कोलाई 12-कश्मीर तनाव E2861) सूखे कणों के लिए, फ्लोरोसेंट गर्मी मार डाला opsonized (HKOP) बैक्टीरिया बाहर तौलना। 10 के लिए यकीन है कि बड़े पैमाने पर खातों बनाने के लिए ध्यान रखना: 1 - 20: 1 बैक्टीरिया: सेल अनुपात (या कम से कम एक 10: 1 के अनुपात - सामान्यतः phagocytosis की मात्रा का ठहराव में प्रयुक्त) 13,14। कणों की संख्या निर्माता द्वारा प्रदान की गई या 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के धारावाहिक dilutions couting के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है।
- 50 μl पीबीएस में Resuspend और उच्चतम सेटिंग में 1 मिनट के लिए भंवर। उचित vortexing (यहाँ और प्रोटोकॉल भर में) कणों opsonization की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है, जो कुल के रूप में करते हैं सुनिश्चित करें।
- निलंबन में कणों जैसे fluorescently लेबल dextran के मोती (DEX मोती) के लिए, भंवर 1 मिनट के लिए शेयर समाधान, मात्रा डी में मनका एकाग्रता पर निलंबन या आधार के 50 μl लेएक मनका: मोतियों की etermine माउंट 10 की सुविधा के लिए सेल अनुपात।
- कणों के लिए opsonizing अभिकर्मक के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और सख्ती से एक मिनट के लिए भंवर।
- 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक opsonizing साथ कणों को सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, 500 XG पर 5 मिनट के लिए कणों अपकेंद्रित्र, और अतिरिक्त opsonizing अभिकर्मक युक्त supernant हटा दें। पीबीएस के 100 μl जोड़कर कणों धो, भंवर 500 x जी पर 5 मिनट के लिए गोली, और centrifugate resuspend।
- उचित opsonization और अनबाउंड एंटीबॉडी के हटाने को आश्वस्त करने के लिए इन चरणों का दो बार दोहराएँ।
- (एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त) मीडिया के 5 मिलीलीटर में उन्हें resuspending द्वारा opsonized कणों का काम समाधान तैयार है और कोशिकाओं के अलावा जब तक प्रकाश से दूर की दुकान।
3. Phagocytosis
- एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में कणों का काम कर समाधान रखें। यहाँ से, 50 को जोड़ने56, (50 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए) चरण 1 में तैयार कोशिकाओं को opsonized कणों के एल और phagocytosis मानक सेल संस्कृति शर्तों पर घटित करने के लिए अनुमति देते हैं। इस विधि (चित्र 2) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, जो phagocytosis की दो तरीकों से नीचे हैं सचित्र।
चित्र 2:। वे धीरे-धीरे अच्छी तरह से नीचे पर कोशिकाओं तक पहुँचने के रूप में निरंतर बनाम सिंक्रनाइज़ phagocytosis की तुलना सतत phagocytosis समय के साथ कणों की निरंतर internalization के इंगित करता है। एक विषम तुल्यकालन कदम (centrifugation) सेल के साथ कण संपर्क बढ़ाने, और कोशिकाओं द्वारा तत्काल internalization के लिए अग्रणी नीचे सिंक करने के कणों मजबूर करता है। सिंक्रनाइज़ phagocytosis अधिक तेजी से भाग internalizes जो एक तेज प्रक्रिया हैकण संपर्क: वृद्धि की सेल की वजह से icles।
- बैक्टीरिया अच्छी तरह से नीचे तक पहुँचने और में प्राप्त करने के लिए वे धीरे धीरे नीचे सिंक और कोशिकाओं के साथ संपर्क में आते हैं, अनुमति देने के लिए लंबे समय के फ्रेम का उपयोग के रूप में कोशिकाओं लगातार opsonized बैक्टीरिया phagocytose करने की अनुमति है कि निरंतर phagocytosis विधि (चित्र 2) कोशिकाओं के साथ स्पर्श करें। एक timecourse प्रयोग का आयोजन करते हैं, अलग-अलग समय अंतराल पर बैक्टीरिया जोड़ने और प्रसंस्करण की गति को बढ़ाने के लिए एक ही समय में प्रतिक्रियाओं की पूरी थाली बंद करो।
- कण को बढ़ाता है कि सिंक्रनाइज़ phagocytosis विधि (चित्र 2) के लिए: centrifugation के माध्यम से सेल से संपर्क करें, सभी समय बिंदुओं के तुल्यकालन की सुविधा के लिए कोशिकाओं और कणों (500 XG पर 5 मिनट) के रूप में जल्द ही कणों से जोड़ रहे हैं के रूप में, जिसमें पूरे प्लेट नीचे स्पिन और सेल बातचीत: कण में तेजी लाने के लिए।
- सही Centri के पूरा होने के बाद शुरू होने वाले समय के पाठ्यक्रम उपायfugation कदम है। एक समय बेशक प्रयोग का आयोजन तो नीचे वर्णित के रूप में, अलग-अलग समय अंतराल पर स्वतंत्र रूप से हर समय बिंदु बंद करो।
नोट: सिंक्रनाइज़ phagocytosis विधि कुछ अधिक श्रमसाध्य पिछले एक से है, लेकिन एक कम समय में उच्च phagocytic सूचकांक प्रदान करता है।
4. रोकना Phagocytosis
- पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, सतह पर तैरनेवाला हटाने और पीबीएस के साथ पतला trypan नीले रंग के 50 μl जोड़ें: गैर-भाँति जीवाणुओं की प्रतिदीप्ति बुझाने के क्रम में, (1 2 कमजोर पड़ने)।
- गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, प्लेट नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पतला trypan नीले रंग के 50 μl जोड़ें। सेल नुकसान को कम करने और पर्याप्त धोने को सक्षम करने के क्रम में प्रत्येक धोने के बीच में प्लेट (500 XG पर 5-10 मिनट) अपकेंद्रित्र सुनिश्चित करते हैं।
- Trypan ऊष्मायन के बाद, (अच्छी तरह से स्पष्ट बदल जाता है से पीबीएस हटा दिया है जब तक) किसी भी अवशिष्ट trypan दूर करने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो। Trypan नहीं बल्कि जीवित बैक्टीरिया या OPDex मोती के लिए, fluorescently लेबल गैर-भाँति गर्मी को मार डाला, जीवाणु कणों की प्रतिदीप्ति 15,16 बुझाने के लिए दिखाया गया है। जीवित बैक्टीरिया के लिए, ऐसे पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, या जेंटामाइसिन के बजाय गैर-भाँति कणों से प्रतिदीप्ति के confounding प्रभाव से बचने के लिए trypan धोने के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक धोने शामिल हैं।
- पीबीएस के साथ धो तो, 4% paraformaldehyde के 100 μl साथ कोशिकाओं को ठीक करें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते (प्रत्येक धोने के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl पर)। इस चरण में, एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं बचाने के लिए, या धुंधला और मात्रा का ठहराव के लिए सीधे आगे बढ़ना।
नोट: सभी बाद के चरणों में इस बिंदु प्राक्कथन सेल संस्कृति हुड के बाहर किया जा सकता है के रूप में। - सभी तरल निकालें और पीबीएस में पुनर्गठित 5 एनजी / एमएल DAPI की 50 μl जोड़ें। धुंधला के लिए 5 मिनट की अनुमति दें, और उसके बाद पीबीएस के साथ दो बार धो लें। धोने कदम के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से और रिकार्ड phagocytosis पीबीएस के 50 μl जोड़ें।
5. एक्टिन धुंधला
नोट: phagocytosis के अलावा, fluorometric विधि lamellipodia, pseudopodiae के निषेध के दौरान कम हो जाता है, जो एक्टिन, की तीव्रता को मापने, और झिल्ली एक अवरोध करनेवाला (चित्रा 1 ए) के साथ उपचार का एक परिणाम के रूप में ruffling द्वारा actin के polymerization के मात्रा का ठहराव सक्षम हो जाएगा। इस phagocytosis के अलावा actin के polymerization के मात्रा का ठहराव में रुचि रखते हैं एक वैकल्पिक कदम है। Actin के polymerization के phagocytosis के लिए फ्लोरोसेंट कणों का उपयोग, अंतिम लक्ष्य है, तो वैकल्पिक है।
- Paraformaldehyde के निर्धारण (कदम 4.3) के बाद, प्रत्येक धोने के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl में पीबीएस के साथ दो बार प्लेट धोने। Permeabilization के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 के 50 μl जोड़ें और आरटी पर -5 मिनट के लिए सेते हैं।
- (ऊपर) के रूप में पीबीएस के साथ बाहर 0.1% ट्राइटन X-100 दो बार धोएं, और labe की गैर विशिष्ट बंधन से बचने के लिए 20 मिनट के लिए 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ ब्लॉकएल।
- अवरुद्ध बाद, बीएसए समाधान निकालें और तुरंत rhodamine phalloidin जोड़ें। , Rhodamine दाग का काम कर समाधान तैयार (एक थाली के लिए पर्याप्त) पीबीएस के 5 मिलीलीटर में (निर्माता द्वारा प्रदान की) methanoic समाधान के 100 μl का उपयोग करें। काम समाधान से अच्छी तरह से प्रति 50 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
नोट: कदम के रूप में धोने कदम और DAPI धुंधला के बाद 4.4 कोशिकाओं मात्रा का ठहराव के लिए तैयार हो जाएगा।
6. मात्रा
- Λ = 460 एनएम λ = 355 एनएम और उत्सर्जन फिल्टर में उत्तेजना फिल्टर का उपयोग λ = 518 एनएम, और नीले रंग प्रतिदीप्ति पर λ = 488 एनएम और उत्सर्जन फिल्टर में उत्तेजना फिल्टर का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, रिकॉर्ड हरी प्रतिदीप्ति का उपयोग कर phagocytosis यों।
- Λ = 355 एनएम और λ = 460 एनएम (ऊपर), और लाल फ्लू के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, रिकॉर्ड नीला प्रतिदीप्ति का उपयोग कर actin के polymerization के योंλ = 584 एनएम और उत्सर्जन फिल्टर λ = 620 एनएम पर उत्तेजना फिल्टर के माध्यम से orescence।
नोट: कक्षीय या केंद्रीय रिकॉर्डिंग का पता लगाने के लिए स्वीकार्य है। कुछ प्रकार की कोशिकाओं के मामले कक्षीय रिकॉर्डिंग लाभ की हो सकती है, जिसमें केंद्र की तुलना में अच्छी तरह से, के किनारे करने के लिए और अधिक इकट्ठा होते हैं। विशेष रूप से, कक्षा के आसपास तीन अंक का औसत भी अधिक सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - एक्टिन मात्रा का ठहराव (चित्र 1) बनाम कण लेबल या phagocytic पर निर्भर करता है, (DAPI) से नीले रंग प्रतिदीप्ति readout के द्वारा हरे या लाल प्रतिदीप्ति की कुल RFU फूट डालो। कारण उच्च थाली करने वाली प्लेट विचरण करने के लिए, सबसे अच्छा मनाया प्रवृत्तियों को वर्णन करने के लिए और अधिक विश्वसनीय सांख्यिकीय विश्लेषण की सुविधा, (जैसे = 0 नियंत्रण करने के लिए टी रिश्तेदार के रूप में) रिश्तेदार अनुक्रमित का उपयोग करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से phagocytosis और बाद में actin के polymerization के बढ़ाता की दो प्रमुख तरीके सतत या सिंक्रनाइज़ phagocytosis निरीक्षण करने के लिए है।
सूक्ष्म विश्लेषण (चित्रा 1 बी) fluorometer रिकॉर्डिंग है क्या करने के लिए तुलनीय फ्लोरोसेंट छवियों को दिखाता है (यह भी चित्र 1 देखें)। चित्रा 1 बी में actin के लाल प्रतिदीप्ति, FITC की हरी 268 प्रतिदीप्ति HKOP ई लेबल हैं कोलाई, परमाणु DAPI के दाग, और सभी तीन 269 के मर्ज किए गए छवि एक साथ fluorophores। इस छवि को प्रभावी phagocytosis, actin के polymerization की, और गैर-भाँति कणों की 270 प्रभावी trypan शमन इंगित करता है।
J774 कोशिकाओं dextran के मोती internalizing कर रहे हैं, जहां क्रमश: 2A चित्रा और सी के रूप में देखा opsonized और unopsonized कणों की सतत phagocytosis काफी तुलनीय है। दिलचस्प बात यह है कि actin polymerization के निम्नलिखित opsonophunopsonized कणों की actin के polymerization के निम्नलिखित internalization (चित्रा 2 डी) में वृद्धि नहीं करता है, जबकि agocytosis बढ़ जाती है, बाद में समय अंक (चित्रा 2B) में धीमा। इस opsonophagocytosis opsonized नहीं कर रहे हैं कि कणों के internalization तुलना में बहुत अधिक actin के polymerization के लिए ले जाता है के बाद से इन प्रक्रियाओं की जांच के भविष्य के अध्ययन के लिए विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। MTT विश्लेषण (चित्रा 2 ई) के माध्यम से पुष्टि की गई के रूप में dextran के कणों का उपयोग phagocytic विधियों का न तो सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन में परिणाम।
लगातार निरंतर phagocytosis (चित्रा 2) के दौरान मनाया प्रवृत्तियों में वृद्धि के विपरीत, opsonized dextran के मोतियों की सिंक्रनाइज़ phagocytosis 30 मिनट निम्नलिखित internalization में कमी दिखा रहा है, एक घंटी के आकार की प्रवृत्ति (चित्रा 3 ए) है। इस समय प्रसंस्करण और प्रोटोकॉल की प्रकृति पर विचार होने की उम्मीद है। इस प्रवृत्ति को भी एक्टिन पीओएल द्वारा पुष्टि की हैउच्चतम polymerization के समय बिंदु timecourse में जल्दी पर है जहां इन कोशिकाओं के ymerization डेटा (3B चित्रा), जबकि आधारभूत करने के लिए 30 मिनट के polymerization रिटर्न पर। अधिक श्रम गहन हालांकि, इस विधि इसलिए तत्काल phagocytic प्रभाव की जांच, सही तुल्यकालन के बाद phagocytosis की जांच के लिए एक मूल्य है।
चित्रा 1:। एक मनका: phagocytosis और actin polymerization के confocal माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं 20 पर FITC संयुग्मित OPDex मनका (हरा) internalize की अनुमति दी गई 60 मिनट के लिए सेल अनुपात, तो कोशिकाओं, paraforlmaldehyde के साथ तय, trypan और पीबीएस के साथ धोया साथ permeabilised गया एसीटोन, और rhodamine phalloidin (लाल) का उपयोग एफ actin के लिए दाग, और DAPI (नीला)। छवियाँ अतिरिक्त डिजिटल बढ़ाई साथ 60X पर confocal सूक्ष्म विश्लेषण के उदाहरण देकर स्पष्ट करना, (ए) के कणई बार = 10 माइक्रोन (बी) सफेद पट्टी = 50 माइक्रोन। (ए) अवरोध करनेवाला के अलावा निम्नलिखित actin के polymerization में परिवर्तन दिखाता है। तीर pseudopodia गठन का संकेत मिलता है, और तीर। चित्रा 1 ए निन्कोविक और रॉय 12 से संशोधित किया गया है झिल्ली ruffling में परिवर्तन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
। चित्रा 2: निरंतर phagocytosis J774 murine मैक्रोफेज निम्नलिखित Fluorometric विश्लेषण एक 96 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया और 90, 60, 45, 30, और 15 मिनट के साथ शुरू करने, समय की मात्रा बदलती में dextran के मोतियों से अवगत कराया गया। मोती अलग अलग समय और सभी प्रतिक्रियाओं एक ही समय में बंद कर दिया गया के लिए phagocytic प्रक्रियाओं में जोड़ा गया था। प्रकोष्ठों, तय trypan, साथ धोया दाग, और विभिन्न पर प्रत्येक (बी, डी क्रमशः)। (ई) MTT परख आयोजित किया गया तुरंत बाद phagocytosis के साथ जुड़े opsonized (ए) के phagocytosis या unopsonized (सी) dextran के कणों और actin polymerization के लिए विश्लेषण किया गया समय अंक। यह आंकड़ा निन्कोविक और रॉय 12 से संशोधित किया गया है।
चित्रा 3:। सिंक्रनाइज़ phagocytosis निम्नलिखित Fluorometric विश्लेषण FITC OPDex मोती / अच्छी तरह से 10 4 सेल के एक सेल घनत्व में 96 अच्छी तरह प्लेटों में चढ़ाया J774 murine मैक्रोफेज कोशिकाओं के लिए जोड़ा गया था लेबल। एक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद थाली 5 मिनट के लिए 500 XG पर centrifuged किया गया था। Phagocytosis पीबीएस washes, paraformaldehyde के fixati द्वारा पीछा trypan धोने से एक्स-अक्ष, में कहा गया समय बिंदुओं पर, एक समय में एक बंद कर दिया गया थापर और actin धुंधला। यह आंकड़ा निन्कोविक और रॉय 12 से संशोधित किया गया है।
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Discussion
Fluorometric तकनीक के प्रमुख सीमाओं प्रयोगात्मक विचरण के साथ-साथ व्यापक धोने और गैर पक्षपाती कोशिकाओं के इस्तेमाल से जुड़े सेल नुकसान कर रहे हैं।
विचरण के कारण शेयर समाधान की तैयारी के दौरान वजन और pipetting के रूप में फ्लोरोसेंट कणों में परिवर्तन करने के लिए बड़े पैमाने पर मनाया जाता है प्रयोग करने के लिए प्रयोग से कणों की समान संख्या को बनाए रखने का एक सटीक तरीका नहीं है। (-; कणों तुरंत जोड़ा और हटाया = 0 टी नियंत्रण) प्रयोगों के बीच विचरण की समस्या का समाधान करने के लिए, डेटा% phagocytosis के रूप में, उदाहरण के लिए, रिश्तेदार संदर्भ में व्यक्त या नियंत्रण से परिवर्तन गुना किया जा सकता है। विश्लेषण का यह रूप प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के रुझान उत्पन्न करता है, और नियंत्रण से% phagocytosis की मूल्यों प्रयोग करने के लिए प्रयोग से समान है। डेटा विश्लेषण के इस तरह 3-6 प्रयोगात्मक प्रतिकृति के साथ सांख्यिकीय महत्व की सुविधा होगी। Fluorometric तकनीक को प्रभावी ढंग से जांच करने और मनाया प्रवृत्तियों डी पुन: पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपर्याप्त डेटा विश्लेषण का उपयोग अगर अपनी परिवर्तनशीलता के espite। एक भी वैज्ञानिक लगभग छह 96 अच्छी तरह प्लेटें, या एक दिन में 600 से उपचार को चलाने के लिए तकनीक के माहिर के साथ यह संभव है।
सेल नुकसान काफी हद तक गैर-पक्षपाती सेल प्रकार के साथ अध्ययन में देखा गया है। पक्षपाती सेल प्रकार के ऐसे वे कई और व्यापक धोने कदम का सामना कर सकते हैं, क्योंकि इस एक तरीके के रूप में उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं।
मेजर महत्वपूर्ण कदम तस्वीर विरंजन से बचने के लिए प्रत्यक्ष प्रकाश से फ्लोरोसेंट घटकों दूर रखने के लिए लिया जाना चाहिए। कण, लेबल, और प्रत्येक या सभी घटकों से युक्त थाली अंधेरे में रखा (या बस एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा) होना चाहिए। एक अन्य आवश्यक घटक एक थाली के भीतर तकनीकी प्रतिकृति का महत्व है। कारण अच्छी तरह से अच्छी तरह से विचरण करने के लिए उच्च करने के लिए यह मीटर के क्रम में, pipetting से पहले बहुत अच्छी तरह से सभी अभिकर्मकों मिश्रण करने के लिए और (एक पंक्ति के बराबर) के इलाज के प्रति 6-8 तकनीकी प्रतिकृति है अनिवार्य हैसही डेटा में प्रवृत्तियों का निरीक्षण OST।
इन जैसे प्लेट स्वरूपों के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण अतिरिक्त विचार, थाली कुओं अभिकर्मकों की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा में होते हैं और अक्सर वाष्पीकरण होने का खतरा हो जाता है। उपचार अब से 24 घंटा कर रहे हैं, यह humidifiers के रूप में सेवा करने के लिए और सेल संस्कृति मीडिया और एगोनिस्ट के वाष्पीकरण को कम करने के क्रम में, अकेले पीबीएस युक्त (अगले किनारे करने के लिए पंक्तियों और स्तंभों) थाली के परिधीय कुओं का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
इस तकनीक में महारत हासिल करने के लिए काफी सरल है और इसमें शामिल समस्या निवारण कम है। यह अध्ययन के लिए सही phagocytic विधि का चयन करने के लिए और सेल नुकसान से बचने के लिए (गैर पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग करते समय विशेष रूप से) धुलाई करते हुए सावधान रहना महत्वपूर्ण है।
Fluorometric तकनीक का बड़ा महत्व यह फ्लोरोसेंट कण internalization, या actin के polymerization के स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च throughput विधि प्रदान करता है। अधिकांश टीऐसे माइक्रोस्कोपी या सूक्ष्म जीव विज्ञान के रूप में तारीख करने के लिए इस्तेमाल किया echniques अधिक श्रम गहन और अधिक समय की तुलना में खपत कर रहे हैं। फ्लो fluorometry के रूप में बहुत समान सिद्धांतों का इस्तेमाल करता है, लेकिन fluorometry द्वारा आवश्यक मिनट की तुलना में यों घंटे लगते हैं। इसलिए, fluorometric विधि अपने उच्च throughput क्षमताओं के कारण बड़े पैमाने पर phagocytic मात्रा का ठहराव के मौजूदा तरीकों के लिए एक अच्छा विकल्प है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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