Abstract
Målet for fluorometrisk analyse er å tjene som en effektiv, kostnadseffektiv, høy gjennomstrømning metode for å analysere fagocytose og andre cellulære prosesser. Denne teknikken kan brukes på en rekke forskjellige celletyper, både adherente og ikke-adherente, for å undersøke en rekke cellulære egenskaper. Når man studerer fagocytose, benytter fluorometrisk teknikk fagocyttiske celletyper slik som makrofager, og fluorescensmerkede opsonisert partikler hvis fluorescens kan slukkes i nærvær av trypan blå. Etter plating av adherente makrofager i 96-brønners plater, fluorescerende partikler (grønn eller rød) administreres og cellene tillatt å fagocyttere for varierte mengder av gangen. Etter internalisering av fluorescerende partikler vaskes cellene med trypan blå, noe som letter utryddelse av fluorescenssignalet fra bakterier som ikke er internalisert, eller er bare fester seg til celleoverflaten. Etter trypan vask ble cellene vasket med PBS, fiksert, ennd farget med DAPI (atom blå fluorescerende etikett), som tjener til å merke kjerner av celler. Ved en enkel fluorometrisk kvantifisering gjennom plate lesing av kjernefysiske (blå) eller partikkel (rød / grønn) fluorescens vi kan undersøke forholdet mellom relative fluorescensenheter av grønt: blå og bestemme en phagocytic indeksen indikerer mengden av fluorescerende bakterier internalisert per celle. Varigheten av analyse ved bruk av en 96-brønners metode og flerkanals pipetter for vasking, fra enden av fagocytose til slutten av datainnsamlingen, er mindre enn 45 min. Strømningscytometri kunne brukes på en lignende måte, men fordelen med fluorometri er høy gjennomstrømning, rask fremgangsmåte for evaluering med minimal manipulering av prøver og rask kvantifisering av fluorescerende intensitet pr celle. Lignende strategier kan anvendes på ikke-adherente celler, levende merkede bakterier, aktin polymerisering, og i det vesentlige en hvilken som helst fremgangsmåte som benytter fluorescens. Derfor er fluorometri en lovende metode for sin lave kostnader, høy throughpUT evner i studiet av cellulære prosesser.
Introduction
Kvantifisering av fluorescerende signal har vært mye brukt i et mangfold av vitenskapelige metoder som spenner fra PCR, flowcytometri, konfokal mikroskopi, og FRET analyse for å multiplekse ELISA. Fluorescens bildebehandling og kvantifisering har et bredt program, og kan være et flott verktøy for kvantitativ analyse av ulike cellulære prosesser. Bruk av fluorescerende markører og deres signal har blitt revolusjonert de siste ti årene, og fremveksten av fluorescerende plate lesere har muliggjort høy gjennomstrømning kvantifisering av fluorescens avgitt under cellulære prosesser.
Fluorometrisk analyse kan tjene som et flott verktøy i kvantifisering av fagocytose. Fagocytose er blitt undersøkt siden oppdagelsen av fagocytter av Metchnikoff i 1800 1. I løpet av årene er en rekke metoder blitt benyttet for å undersøke denne prosessen viktig forutsetning for medfødte immunforsvar mot invaderende bakterier, virus, sopp og parasittiske patogener 2-5. Tidligere fremgangsmåter for kvantifisering utnyttes mikroskopi og stereological teknikker for å visualisere celler som er phagocytosing, som så ble kvantifisert ved telling av internaliserte partikler (manuelt eller ved bruk av programvare) 6-8. Noen ulemper med å bruke mikros alene for kvantitativ analyse er at manuell telling av bakterier er arbeidskrevende og mer utsatt for observatør bias. En annen metode som brukes i kvantifisering av fagocytose er den mikrobiologiske teknikk for plettering av bakterier fra cellelysatene (etter fagocytose) på bakteriekulturplater, men denne metoden kan unnlate å ta hensyn til bakteriedrepende mekanismer og nærvær av delvis internalisert bakterier. Denne fremgangsmåte er enda mer arbeidskrevende i forhold til mikroskopi og tar flere dager å analysere. Strømningscytometri synes å være den raskeste og mest effektive måte å kvantifisere fagocytose og har blitt benyttet av mange grupper 9-11, men de høye kostnadene som vanligvis er forbundet med iinstrument nødvendig for analysen gjør den til den dyreste metoden i forhold til de tidligere nevnte analyser.
Den fluorometrisk metoden er et godt alternativ til flowcytometri for analyse av partikkelintern siden det gir objektiv kvantifisering av fluorescens bruke utstyr som ikke er så kostnads uoverkommelige. Andre fordeler av fluorometri er høy effektivitet og høy gjennomstrømming evner for kvantifisering av fluorescens slippes ut av de merkede internalisert partikler.
Fordeler med fluorometri kan ekstrapoleres til kvantifisering av andre enn fagocytose prosesser. For eksempel kan påføres fluorometrisk analyse for å undersøke hvilken som helst prosess som fører til endringer i ekspresjon av intracellulær eller membranbundne reseptorer, endringer i celle permeabilitet / levedyktighet, transfeksjon effekt, og modulering i aktin-polymerisasjon. En ulempe med fluorometrisk teknikk er at, avhengig av etikettene som brukes, kan det være en høyeksperiment for å eksperimentere variabilitet som kan vanligvis løses ved å demonstrere data gjennom relativ kvantifisering, slik som fold endring eller prosent økning fra kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen kan brukes til flere applikasjoner som kvantifisering av fagocytose og aktin polymerisasjon som brukes i vår tidligere publisert arbeid 12. Protokollen gir seg til en rekke forskjellige modifikasjoner, og tabell 1 viser celletyper og partikler med hell utnyttes i tidligere studier. Standard bruk av denne protokollen for kvantifisering av fagocytose eller aktin polymerisasjon er illustrert i diagram 1.
Diagram 1:. Diagram for fluorometrisk analyse for kvantifisering av fagocytose og aktin polymerisasjon Etter at cellene blir sådd ut, behandlet, og tillates å overholde, partikler merket med grønn fluorescens (FITC) blir tilsatt til cellene for fagocytose. Reaksjonen stoppes ved trypan eller antibiotisk vaske (for å eliminere ikke-internalisert partikler) og fiksering er utført med 4% paraformaldehyd. Cellene blir deretter farget med rødt fluorescerende aktin etikett (rodamin phalloidin) og blå fluorescerende etikett (DAPI). Indeksene av fagocytose og aktin polymerisasjon kvantifiseres som forholdet mellom relative fluorescensenheter av grønn / blå (FITC / DAPI), eller rødt / blått (rhodamin / DAPI) fluorescens.
1. plating og Behandling Cells
MERK: Før du begynner, bør du vurdere å kjøre behandlinger med minst fire tekniske replikater, og inkluderer følgende kontroller i plateoppsettet: celler (unstained, med DAPI alene eller rodamin alene) og partikkel bare.
- Gjennomføre all tilsetning av reagenser i trinn 1-4 i en steril cellekultur hette for å beskytte prøven mot forurensning.
- Tallerkenmakrofager (murin cellelinje J774) i en 96-brønns plate ved 1-5 x 10 4 celler i 50 ul (per brønn) av supplert forvarmet medier. Ideelle plater for denne metoden er svarte 96-brønners plater med klare eller svart bunn, avhengig av leserens evner.
- For supplert media, bruker 10% varmeinaktivert FBS for å unngå forstyrrelser av komplement kaskade, og 1% penicillin / streptomycin (hvis du ikke bruker levende bakterier for fagocytose). Ved bruk av adherente celler tillater 1-2 timer for adhesjon, og de ikke-adherente celler, spinne ned plate med cellene i 10 minutter ved 500 x g.
- Legg ønskede agonister / antagonister eller bærerkontroll på 2x konsentrasjon (resuspendert i PBS eller mer foretrukket, i supplert medium) i 50 ul i et sluttvolum på 100 ul (1x) og inkuberes i en ønsket tidsperiode. Multikanalspipette og reagenvolumer reservoarer vil lette raskeste behandling.
2. opsonization av Fluorescent Partikler
ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tabell 1: Testet celletyper og fluoriserende partikler i fluorometrisk analyse av fagocytose og aktin polymerisasjon Tabell 1 viser kombinasjoner av celletyper (cellelinjer, og primærceller) at vår gruppe har brukt via fluorometrisk metoden.. Annet enn å se på fagocytose og aktin polymerisasjon av villtype-celler, har vi også benyttet noen av disse partikler for undersøkelse av fagocytose av transfekterte celler som uttrykker et GFP (grønt fluorescerende protein). Fluorescens av celler transfektert med plasmider som inneholder fluorescerende reportere kan også brukes som et cellulært markør i tillegg til DAPI Tabell legende:. A - aktin polymerisasjon; P - fagocytose; PT - fagocytose av GFP merket transfekterte celler; OPDex - opsonisert dekstran perle; HKOP - varme drept opsonisert.
- Sørg for at fluorescerende partikler og etiketter er beskyttet mot lys til alle tider, during behandling, vasking, så vel som under inkuberingen for å hindre fotobleking
- For tørre partikler, veie ut fluorescerende varme drept opsoniserte (HKOP) bakterier (E2861: E. coli K-12 stamme), ved hjelp av produsentens spesifikasjoner. Vær nøye med å sørge for at masse kontoer for 10: 1 - 20: 1 bakterier: celle ratio (eller i det minste en 10: 1 ratio - som vanligvis brukes i kvantifisering av fagocytose) 13,14. Antall partikler kan gis av produsenten eller bestemmes via couting seriefortynninger av 1 mg / ml stamløsning.
- Resuspender i 50 mL PBS og virvle i 1 minutt på høyeste innstilling. Sikre riktig virvling (her og i hele protokoll) som partiklene har en tendens til å aggregere som kan påvirke effektiviteten av opsonisering.
- For partikler i suspensjon slik som fluorescensmerkede dekstran-kuler (DEX perler), vortex stamløsningen i 1 min, ta 50 ul av suspensjon eller avhengig av vulsten konsentrasjonen i volum determine mount av perler å lette 10: 1 perle: celle ratio.
- Legg et like stort volum av opsonizing reagens til partiklene og vortex kraftig i et minutt.
- Inkuber partikler med opsonizing reagens ved 37 ° C i 1 time.
- Etter inkubering sentrifuger partiklene i 5 min ved 500 x g, og fjern supernatanten inneholdende overskudd opsonizing reagens. Vask partiklene ved å tilsette 100 ul PBS, for å virvle resuspender pelleten, og sentrifugatet i 5 min ved 500 x g.
- Gjenta disse trinnene to ganger for å sikre riktig opsonization og fjerning av ubundet antistoff.
- Forberede arbeids løsning av opsoniserte partikler ved resuspending dem i 5 ml av media (tilstrekkelig for en 96-brønns plate) og lagre bort fra lys til tillegg til cellene.
3. Fagocytose
- Plasser arbeidsløsning av partikler i et sterilt reagens reservoaret. Herfra, legger 5056; l av opsoniserte partikler til celler fremstilt i trinn 1 (for en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml) og tillate fagocytose å oppstå ved standard cellekulturbetingelser. Illustrert nedenfor er to metoder for fagocytose som kan vurderes ved hjelp av denne metoden (figur 2).
Diagram 2:. Sammenligning av kontinuerlig versus synkron fagocytose Kontinuerlig fagocytose indikerer kontinuerlig internalisering av partikler over tid ettersom de langsomt nå de celler på bunnen av brønnen. Et kontrastsynkroniseringstrinn (sentrifugering) tvinger partiklene til å synke til bunnen, forbedrer partikkel kontakt med cellen, og som fører til internalisering umiddelbar av cellene. Synkronisert fagocytose er en raskere prosess som raskere internalizes delicles på grunn av øket celle: kontakt partikkel.
- For den kontinuerlige fagocytose metode (figur 2) som tillater cellene å kontinuerlig fagocyttere opsoniserte bakterier som de langsomt synker til bunnen og kommer i kontakt med celler, utnytter lengre tidsrammer for å tillate bakterier for å nå bunnen av brønnen og får i berøring med cellene. Ved å gjennomføre en tidsforløpet eksperiment, tilsett bakterier ved forskjellige tidsintervaller og stoppe hele platen av reaksjoner på samme tid for å øke hastigheten på behandlingen.
- For den synkroniserte fagocytose metode (figur 2) som forbedrer partikkel: celle-kontakt via sentrifugering, spinne ned hele platen inneholdende celler og partikler (5 min ved 500 x g) så snart som partiklene blir tilsatt, for å forenkle synkroniseringen av alle tidspunkter, og å fremskynde partikkel: celleinteraksjon.
- Måle tidsforløpet starter umiddelbart etter avslutningen av centrisentrifugering trinn. Ved å gjennomføre en tidsforløp eksperiment, stoppe hvert tidspunkt uavhengig av hverandre ved forskjellige tidsintervaller slik det er beskrevet nedenfor.
MERK: Den synkroniserte fagocytose metoden er noe mer arbeidskrevende enn den forrige, men gir høyere phagocytic indeksen i en kortere tid.
4. Stoppe Fagocytose
- For adherente celler, fjern supernatanten og tilsett 50 ul fortynnet trypanblått med PBS (1: 2 fortynning), for å slukke fluorescensen av ikke-internalisert bakterier.
- For ikke-adherente celler, spinne ned platen og fjern supernatanten. Tilsett 50 ul fortynnet trypanblått. Sørge for å sentrifugere platen ved (5-10 minutter ved 500 x g) mellom hver vask for å redusere celletap og muliggjøre tilfredsstillende vasking.
- Etter trypan inkubasjon vaskes cellene to ganger med PBS for å fjerne eventuelt gjenværende trypan (inntil PBS fjernes fra brønnen blir klart). Trypan har vist seg å slukke fluorescensen 15,16 av ikke-internalisert fluorescensmerket, varme drept, bakterielle partikler, men ikke for levende bakterier eller OPDex perler. For levende bakterier, inkluderer en vask med antibiotika slik som penicillin, streptomycin, gentamicin eller i stedet for den trypan vask for å unngå kompliserende effekter av fluorescens fra ikke-internalisert partikler.
- Fiks celler med 100 ul av 4% paraformaldehyd, og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur, deretter vask med PBS (100 ul pr brønn for hver vask). På dette trinnet, lagre cellene ved 4 ° C i opptil en uke, eller gå direkte til farging og kvantifisering.
MERK: Alle de etterfølgende trinnene danner dette punktet forord kan gjøres utenfor panseret cellekultur. - Fjerne all væske og tilsett 50 pl av DAPI på 5 ng / ml rekonstituert i PBS. Tillate 5 min for flekker, og vask deretter to ganger med PBS. Etter vasketrinnet, tilsett 50 ul PBS til hver brønn og plate fagocytose.
5. Actin Farging
NB: I tillegg til fagocytose, vil fluorometrisk metode muliggjøre kvantifisering av aktin polymerisasjon ved å måle intensiteten av aktin, som reduseres under inhibering av lamellipodia, pseudopodiae, og membranen rusket som et resultat av behandling med en inhibitor (figur 1A). Dette trinnet er valgfritt hvis interessert i kvantifisering av aktin polymerisasjon i tillegg til fagocytose. Hvis aktin polymerisasjon er det endelige mål, ved hjelp av fluorescerende partikler for fagocytose er valgfritt.
- Etter fiksering paraformaldehyd (trinn 4.3), platen vaskes to ganger med PBS med 100 ul per brønn for hver vask. Tilsett 50 ul av 0,1% Triton X-100 i PBS i permeabilization og inkuberes i -5 min ved RT.
- Vask 0,1% Triton X-100 to ganger med PBS (som ovenfor), og blokk med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 20 min for å unngå ikke-spesifikk binding av label.
- Etter blokkering, fjerne BSA løsning og umiddelbart legge rhodamin phalloidin. For å forberede arbeidsløsning av rodamin flekken, bruke 100 mL av metan- løsning (levert av produsenten) i 5 ml PBS (nok for én plate). Fra arbeidsoppløsningen tilsett 50 ul per brønn og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
MERK: Etter vasketrinnene og DAPI flekker som i trinn 4,4 cellene vil være klar for kvantifisering.
6. Kvantifisering
- Å kvantifisere fagocytose bruker en fluorescerende plateleser, rekord grønn fluorescens hjelp eksitasjonsfilteret på λ = 488 nm og utslipp filter ved λ = 518 nm, og blå fluorescens hjelp eksitasjonsfilteret på λ = 355 nm og utslipp filter på λ = 460 nm.
- For å kvantifisere aktin polymerisering ved anvendelse av en fluoriserende plateleser, registrere blå fluorescens via λ = 355 nm og λ = 460 nm (som ovenfor), og røde influensaorescence via eksitasjonsfilteret på λ = 584 nm og utslipp filter λ = 620 nm.
MERK: Orbital eller sentral påvisning er akseptabelt for opptak. Noen celletyper samle mer til kanten av brønnen enn midten, i hvilket tilfelle orbital opptak kan være av fordel. Spesielt kan gjennomsnittet av tre punkter rundt bane også brukes for å oppnå mer nøyaktige resultater. - Dele den totale RFU av grønn eller rød fluorescens fra blå fluorescens avlesning (fra DAPI), avhengig av partikkel etikett eller fagocytisk vs. aktin kvantifisering (diagram 1). På grunn av stor plate til plate varians, bruker relative indekser (for eksempel i forhold til t = 0 kontroll), til beste illustrere trender observert og legge til rette for mer pålitelig statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To viktige metoder for kvantifisering av fagocytose og den påfølgende aktin polymerisasjon ved bruk av denne protokollen er å observere kontinuerlig eller synkronisert fagocytose.
Mikroskopisk analyse (figur 1B) illustrerer fluorescerende bildene kan sammenlignes med hva fluorometeret tar opp (se også diagram 1). I figur 1B er rød fluorescens av aktin, grønn 268 fluorescens av FITC etiketter HKOP E. coli, kjernekraft DAPI flekken, og det sammenslåtte bildet av alle tre 269 fluoroforene sammen. Dette bildet indikerer effektiv fagocytose, aktin polymerisasjon, og 270 effektive trypan leskende av ikke-internalisert partikler.
Kontinuerlig fagocytose av opsoniserte og unopsonized partikler er ganske sammenlignbare, som vist i figur 2A og C henholdsvis, hvor J774 celler blir internalisert dekstran-kuler. Interessant, aktin polymerisasjon følgende opsonophagocytosis øker, avtar nedover på senere tidspunkter (figur 2B), mens den aktin polymerisasjon etter internalisering av unopsonized partiklene ikke øker (figur 2D). Dette er viktig å ta hensyn til fremtidige studier som undersøker disse prosesser siden opsonofagocytose fører til mye større aktin polymerisasjon enn internalisering av partikler som ikke er opsoniserte. Ingen av de fagocytiske metoder ved hjelp av dekstran partikler føre til endringer i celle levedyktighet som ble bekreftet via MTT analyse (figur 2E).
I motsetning til stadig økende utvikling observert under kontinuerlig fagocytose (figur 2), er synkronisert fagocytose av opsoniserte dekstrankuler en klokkeformet trend (figur 3A), som viser reduksjonen i internalisering etter 30 min. Dette er å forvente å vurdere behandlingstiden og arten av protokollen. Denne trenden bekreftes også av aktin polymerization data (figur 3B) av disse cellene, der det høyeste punkt polymeriseringstid er tidlig i tidsforløpet, mens det på 30 min polymerisasjons- tilbake til grunnlinjen. Selv om mer arbeidskrevende, har denne metoden en verdi på å undersøke fagocytose rett etter synkroniseringen, og derfor undersøke umiddelbare fagocyttiske effekter.
Fig. 1: Konfokalmikroskopi av fagocytose og aktin polymerisasjon Celler ble tillatt å internal FITC konjugert OPDex vulst (grønn) på 20: 1 vulst: celle-forhold i 60 minutter, og deretter ble cellene vasket med trypan og PBS, fiksert med paraforlmaldehyde, med permeabilised aceton og farget for f-aktin ved hjelp rhodamin phalloidin (rødt), og DAPI (blå). Bildene viser confocal mikroskopisk analyse på 60X med ekstra forstørrelse, (A) white bar = 10 mm (B) hvit bar = 50 mikrometer. (A) Illustrerer endringer i aktin polymerisasjon følgende tillegg av inhibitor. Pilspisser indikerer pseudopodia formasjon, og piler indikerer endringer i membran rusket. Figur 1A har blitt forandret fra Ninkovic og Roy 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Fluorometrisk analyse følgende kontinuerlige fagocytose J774 makrofager fra mus ble sådd ut på en 96-brønners plate og utsatt for dekstran-kuler med varierende mengder av gangen, fra og med 90, 60, 45, 30 og 15 min. Kulene ble tilsatt ved forskjellige tidspunkter og de fagocytiske prosesser for alle reaksjonene ble stoppet samtidig. Cellerble vasket med trypan, fiksert, farget og analysert for fagocytose av opsonisert (A) eller unopsonized (C) dekstran-partikler og aktin polymerisasjon forbundet med hverandre (B, D henholdsvis). (E) MTT-analysen ble utført straks etter fagocytose ved forskjellige tidspunkter. Dette tallet har blitt forandret fra Ninkovic og Roy 12.
Fig. 3: Fluorometrisk analyse følgende synkronisert fagocytose FITC-merkede OPDex perler ble tilsatt til J774 murin makrofag-celler sådd ut i 96-brønners plater ved en celletetthet på 10 fire celle / brønn. Etter en 30 min inkubering ble platen sentrifugert ved 500 xg i 5 min. Fagocytose ble stoppet ett om gangen, på tidspunkter som er angitt i x-aksen ved trypan vask, etterfulgt av PBS-vaskinger, paraformaldehyd fixatipå og aktin farging. Dette tallet har blitt forandret fra Ninkovic og Roy 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store begrensninger i fluorometrisk teknikk er eksperimentelle avvik samt celle tap forbundet med grundig vasking og bruk av ikke-adherente celler.
Variansen er observert i stor grad på grunn av variasjon i fluoriserende partikler som veiing og pipettering under forberedelse av stamløsningen er ikke en eksakt måte å opprettholde identiske numre av partikler fra eksperiment for å eksperimentere. Å ta opp problemet med avviket mellom eksperimenter, kan data bli uttrykt i relative termer, for eksempel som% fagocytose eller fold endring fra kontroll (kontroll - t = 0; partikler lagt til og fjernet umiddelbart). Denne formen for analyse genererer reproduserbare trender, og verdier for% fagocytose fra kontrollen er lik fra eksperiment for å eksperimentere. Denne typen dataanalyse vil lette statistisk signifikans med 3-6 eksperimentelle replikater. Fluorometrisk teknikk som kan brukes for effektivt å undersøke og reprodusere observerte trender despite av dets variabilitet hvis utnytte tilstrekkelig dataanalyse. Med maste av teknikken er det mulig for en enkelt forsker for å løpe rundt seks 96-brønners plater, eller 600 behandlinger i en dag.
Celle tap stor grad har vært observert i studier med ikke-heftende celletyper. Adherent celletyper som er best å bruke i metoder som dette fordi de kan tåle av de mange og omfattende vasketrinn.
Store kritiske skritt som bør tas for å holde fluorescerende komponenter vekk fra direkte lys for å unngå fotobleking. Partikler, etiketter og platen inneholder hver eller alle komponenter bør holdes i mørke (eller bare innpakket i aluminiumsfolie). En annen vesentlig bestanddel er betydningen av tekniske replikater i en plate. På grunn av høy brønn til brønn variansen er det viktig å blande alle reagenser meget godt før pipettering og å ha 6-8 tekniske replikater per behandling (tilsvarende én rad), for å mOst nøyaktig observere trender i dataene.
Andre betraktninger er viktige for anvendelse av plateformater som disse, er at de platebrønnene inneholde relativt små mengder av reagenser og er ofte utsatt for fordampning. Hvis behandlinger som er lengre enn 24 timer, er det tilrådelig å bruke de perifere brønner på platen (rader og kolonner ved siden av kanten) inneholdende PBS alene, for å tjene som luftfuktere og for å redusere avdamping av cellekulturmedier og agonister.
Denne teknikken er ganske enkelt å mestre og feilsøking involvert er minimal. Det er viktig å velge den riktige fagocytisk fremgangsmåte for studien og være forsiktig mens vaske (særlig ved bruk av ikke-adherente celler) for å unngå celletap.
Stor betydning for fluorometrisk teknikk er at den gir en høy gjennomstrømning fremgangsmåte for screening av fluorescerende partikler internalisering, eller actin polymerisasjon. Mest techniques brukt til dags dato som mikroskopi eller mikrobiologi er mer arbeidskrevende og mer tidkrevende i sammenligning. Flowcytometri benytter svært lignende prinsipper som fluorometri, men tar timer å kvantifisere forhold til minutter kreves av fluorometri. Derfor er det fluorometrisk metoden et godt alternativ til dagens metoder for phagocytic kvantifisering i stor grad på grunn av sin high-throughput evner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
