Summary
このビデオでは、我々は生きたマウスの背側脊髄の上に慢性光学イメージング室を移植するための手順を説明します。室、外科的手順、および慢性のイメージングを見直し、実証されている。
Introduction
無傷の生物の生体内顕微鏡でタイムラプスは、免疫組織化学などの従来の単一の時点分析にアクセスできない複雑な生物学的プロセス、の直接可視化を可能にします。具体的には、多光子顕微鏡法（MPM）1は、2,3-まで4 1mmの過剰の撮像が達成されたげっ歯類の新皮質のような組織散乱における撮像を可能にする。シングル手順は数週間から数ヶ月のために、脳への光アクセスを許可する5-7れる外科の準備と組み合わせることで、これらの顕微鏡のアプローチは、健康と病気の状態8-11に、脳内の動的なプロセスを研究するために使用されている。また、プロトコルは行動アッセイ中の細胞の解像度機能イメージングを可能にし、目を覚まし（ すなわち、非麻酔下の）動物でのin vivoイメージングのために提供する12,13開発されてきた。これらのプロトコルはcomparisために使用されている相関神経活動14のアドオンは、麻酔し、目を覚ました動物で15シグナリングアストロサイトのカルシウムは、タスク固有のニューロンのクラスタ16の同定、および神経細胞の能力は、ウィスカの刺激17上に物体の位置を判別する。
in vivoイメージング健康および病理学的機構を解明するために、このアプローチの潜在的な、経時所与の疾患機構18のような急性の軸索変性症（AAD）の同定を可能にする、マウス脊髄（SC）に適用した。その後の研究は、後根神経節（DRG）軸索再生19、軸索再生20における血管の役割は、傷害21に応答してグリア走化性、実験的自己免疫性脳脊髄炎におけるT細胞の遊走（EAE）22、活性に対する末梢病変の影響を調査しミクログリア23,24とamyotrophに応答したアストロサイト25のIC側索硬化症（ALS）、SC損傷（SCI）26後の軸索発芽におけるSTAT-3の役割、およびEAE 27における軸索喪失と回復のメカニズム。これらのアプローチの成功にもかかわらず、すべてのこれらの研究は、アクセス可能な時点の数を制限することにより、すべての撮影時点における短期のダイナミクスの研究、あるいは動物の必要な繰り返しの外科的開口部を制限する、単一イメージングセッションに限られていたと交絡実験的な成果物の可能性を増加させる。これらの手術のためのプロトコルは、以前28,29公開されている。
最近、我々は繰り返し手術を必要とせずに、複数の週の上にマウスSCにタイムラプスMPMイメージングを有効に慢性脊髄室の移植のための技法30を発表した。簡単に言えば、この外科的準備が低く胸椎における椎弓切除と4部構成室の注入を行う含まれています。チャンバーは含ま椎弓切除を取り囲む椎骨、及びカバーガラスSC上に配置され、シリコーンエラストマーで固定クランプ3つのカスタム加工されたステンレス鋼製部品。この技法は、繰り返し手術を必要とせずに健康で負傷した状態での術後以上の5週間に出ルーチンイメージングを可能にした。撮像時間点の数は、動物が麻酔導入を許容できる周波数によって制限された。イメージング寿命は、SCの表面上に密集し、線維組織の成長によって制限されていた。さらに、我々は、外科用インプラントは、運動機能には長期的な影響を及ぼさなかったことを確認した。
我々の最初の出版以来、またSCの長期イメージングを可能にする別のアプローチは、他の場所31-33に記載されている。このプロトコルは、当社が開発した脊髄室を移植するための私たちの手順を示しています。
Protocol
注：この論文でのケアとすべてのマウスの実験的操作は、コーネル大学施設内動物管理使用委員会によって承認された。
1.手術のためのセットアップ
- オートクレーブまたは承認された滅菌手順を使用して、必要なすべてのツールを滅菌する。最低でも、外科用メス、はさみ、ヴァンナはさみ、ピンセット、宝石商のスクリュードライバー、綿棒、リトラクターのセット、インプラント（ 図1A）とその送達システム（ 図1D、E）を含む。
- 70％エタノールおよび/または適切な消毒薬で、あらゆるステレオスコープ·ノブを含め、すべての表面を拭う。
- カスタムstereotax（ 図1D）をオーバーレイし、滅菌ドレープでベンチを囲むことにより、滅菌フィールドを作成します。加熱パッド（好ましくはフィードバック制御）がstereotaxの上にし、滅菌ドレープの下に配置する必要があります。
2.準備手術のためのマウス
- 呼吸速度が約1呼吸/秒に減速するまで、誘導室中で5％イソフルラン/酸素下でマウスを麻酔。
- イソフルラン暴露を継続するためにノーズコーンを使用して、無菌のフィールドから離れてステージング領域にマウスを転送します。 2％イソフルランを減らします。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
- 肢当たりの注入量の約50％を実現し、30 G針と3/10 1ccシリンジ - 筋肉29を使用して、後肢には0.05mg / 100gのマウスにグリコピロレート（抗コリン薬）を投与する。
NOTE：グリコピロレートは、マウスが麻酔下にある間に、肺内の流体の蓄積を防ぐのに役立つ。 - 電気バリカンを使用して、幅2cmおよび胸部アーチを中心に、マウスの背側面、約3cmの長さの部分を剃る。十分に離れて剃ったエリアからのトリミング髪をきれいにしてください。
- 皮下に、次の注射を管理し、坊主頭の遠位に1ミリリットル/（水分補給用）、生理食塩水で100グラムのマウス5％グルコース、5 mg / kgをマウスのケトプロフェン（鎮痛のためのNSAID）、0.2 mg / kgをマウスデキサメタゾン（：30 G針と3/10 ccのシリンジ - 29を使用したパッチ炎症を減少させる抗炎症性ステロイド）。
- 綿棒を使用して、3つのヨウ素の交互洗浄し、70％エタノールを行い、洗浄の間に1分間の待機。
- 切開部位の痛みを軽減するために剃ったパッチの中心に30 G針と3/10 1ccシリンジ - 皮下に29を使用して、0.125％ブピバカイン（末梢神経ブロック）の100μlのを管理します。
- カスタムstereotax（ 図1D）に転送するマウスは、直腸温度計を挿入し、ブピバカインを有効にするために約10分を待ちます。
3. 3隣接する胸椎の背薄層を露出し、清掃してください
- 手術用メスの刃を使用して、関心のある椎骨（ 図2A）の上にある小さな（5mm以下）切開を作る。
- メスまたは外科用ハサミを使用して、優しく肌とその下の筋肉との間の結合筋膜を解離。
- できるだけ大きな作業領域（ 図2B）を可能にする、肌をバック保持するために開創を使用してください。胸の負荷を増加させ、それによって呼吸を妨げないように注意してください。
- その上の筋肉を介して公開されます吻側 - ほとんどの椎骨は、ピンセットを使用してグリップ。メスを用いて、すべての3つの椎骨（ 図2c）から背側プロセスのいずれかの側に離れて組織を切断する。
- 手術用メスの刃、綿棒、および/ または骨スクレーパの任意の組み合わせを使用して、背側の薄層（ 図2D）からのすべての上にある組織を除去する。
- 外科用ハサミを使用して、慎重にLateraの両方の上の椎骨に取り付けられた腱を切り取る脊柱（ 図2E）のLエッジ。
- メスを用いて、穏やかに清浄なクランプ面を提供するために、できるだけ脊柱の横方向縁部からできるだけ多くの組織を除去する。
- ゆっくりと骨のスクレーパーおよび/または綿棒を使用して、任意の残りの軟組織の椎骨を創面切除。他の場所で外科用ハサミ（ 図2F）を使用して、任意のちぐはぐな組織を離れてトリミング。
注：これは、クランプと脊椎がきれいにさらされていることを背側椎弓切除を行う両方のために不可欠である。焼灼器は、後続の出血を制御するのに有用であり得る。 - 皮膚（ 図2F）に加えて、脊柱の周囲の組織をバック保持するために開創シフト。
- 配達ポストに突起にインプラントサイドバーを取り付けます（ 図1Eのように）ポストホルダーにこれらをロードする。
- securelを保持するだけの十分な圧力を加えて、サイドバーを使用して3椎骨をクランプY（ 図2G、H）。 3椎骨のレベルクランプを確保するために鉗子を使用してください。いくつかの試みが必要であることに注意してください。サイドバーはレベル前椎弓切除を行うと平行の両方であることを確認してください。
- 慎重に清潔で綿棒を使用してクランプされた椎骨の背側表面を乾燥させる。
4.背椎弓切除を行います
- 内側クランプされた椎骨の硬膜外腔にvannasハサミの先端を挿入し、軽くハンドルを絞る。骨が乾燥している場合には、背側椎弓の長さに沿って割れなければならない。ラミナを解放するために、反対側には、この手順を繰り返します。
- ゆっくりと慎重にラミナの吻側および尾側端にすべての結合組織を離れてカットし、それを離れて持ち上げ、ピンセットで背側プロセスによる緩いラミナを把持する。
- 0.9％生理食塩水および/または人工脳脊髄液（ACSF）を使用して、徹底的にすべての血液overlyiを洗い流す脊髄をngの。余分な水分を吸収するために綿棒を使用してください。
- vannasはさみを使って、慎重に戻ってインプラントのサイドバーに骨の側縁をトリミング。ここでも、洗い流すと綿棒と生理食塩水/ ACSFを使用して出血を制御します。
- 30 G針 - 骨膜の一部が剥離し、脊髄の上に重なるたことをイベントでは、軽く綿棒および/または29を使用して、この組織を除去する。手順のこの部分で脊髄を傷つけないように注意してください。しっかりと包まれた硬膜とゆるい骨膜を混同しないでください。
- 慎重に、1または歯科アクリルおよびシアノアクリレート（ 図2I）の両方で骨の残りの露出した縁部をシール。接着剤が露出脊髄上に流れるようにしない特別な注意してください。
5.シール商工
- 4スロットはサイドバー上の4穴と並ぶと開口部が露出スピンの上に重なるように、慎重に、天板を置きアルコード（ 図1Bおよび2J）。
- 宝石商のドライバーを使用して、慎重に鉗子の別のペアでねじ回しのシャフトを安定させる、最初のネジを起動します。この段階でネジを締めますが、最初の数のスレッドが従事しているように、それを挿入しないでください。他の3本のネジのためにこのプロセスを繰り返します。
注：この段階での位置にネジを助けるために、チタン又は他の非磁化可能な鉗子を使用することが有用である。 - 場所内のすべての4本のネジで、ネジはしっかりと（ 図2K）確保されるまで、各少しずつ同量だけ交互にネジ締めます。トッププレートは、このプロセス中に屈曲することは珍しいことではないことに注意してください。ねじの頭が破ることができると、過剰な下向きの圧力がクランプを取り除く及び/または脊髄損傷になりますように、あまりにも多くのネジを締めないように注意してください。
- 脊髄およびガラス窓との間の空間を充填するシリコーンエラストマーを使用する。それはDOEので、硬化中に酢酸を生成しないS、KwikSilブランドのエラストマーとの混合のヒントを使用しています。暴露脊髄へのシリコーンのリベラルな部分を適用します。混合先端部からの事前の脊髄への適用に気泡を含む任意のシリコーンを取り除くために注意してください。
- トッププレートの挿入図に5ミリメートル＃0カバースリップを押す優しく、迅速に作業する。徐々に脊髄を取り囲むように液体エラストマーを絞るが、脊髄圧迫（ 図2L）を生じないための十分な圧力を適用します。エラストマーのための時間を設定すると、約90秒であるため、カバーガラスが急速に適用されていることを確認します。
- 5.5 - 失敗したシールのイベントでは、エラストマーが設定されるまで、静かにピンセットでインプラントからそれを削除し、5.4を繰り返して待つ。
- 歯科用アクリル/シアノアクリレートと滲出性エラストマーの縁部をカバーし、脊髄の表面に移動するのエラストマーを防ぐために、できるだけ周囲の骨に付着する。
- リトラクターを取り外し、インプラントの縁の周りの皮膚を引き上げ。シアノアクリレートを使用して、インプラント（ 図2M、N）の縁に皮膚に接着する。
- 1/4 "トッププレート（ 図1Cと2 O）の翼にネジを設定する- ＃0-80を挿入します。
- 歯科アクリルを使用して、トッププレート（ 図2P）のネジ穴に隙間をシール。
6.術後ケア
- 広々とした清潔なケージに麻酔と場所から動物を削除します。ケージはチャンバーはケージ全体に通常の歩行運動の過程で（例えば、水ボトル及び/または食品用のV字型のディップなど）何にも引っかかるしないことを十分に大きいことを確認してください。
注：標準的なラットケージが理想的です。 - 動物が回復しつつ加熱された表面にケージを置きます。それは完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さないでください。
- 動物behaを確認してください痛みや苦痛とインプラントの完全性の兆候が2時間の手術後 - 1内のvior。
注：通常の状態では、動物が動きに控えめな摂動に歩き回ることができるはずです。 - 重量を測定し、行動を監視して、最初の72時間12時間 - 動物ごとに8をチェックし続けます。動物は夜の間にアクティブとモバイルであることを確認してください。水または栄養ゲルと混合地面飼料、飼料ペレット、及び飲料水の形のウェットフードは、グランドレベルで提供されるべきである。皮下またはintraperiotoneal注射による追加の水和は、必要に応じて提供されるべきである。
- 術後、24および48時間の時点で5 mg / kgをマウスケトプロフェンおよび0.2 mg / kgをマウスのデキサメタゾンを皮下投与する。さらに、0.005から0.010ミリグラム/ 100gのマウスを72時間毎に皮下注射により8時間後に投与されるべきである。
7. in vivoイメージング
- 下のマウスを麻酔誘導室中で5％イソフルラン/酸素呼吸速度は約1呼吸/秒まで減速するまで。
- フィードバック制御された加熱パッドでカスタムstereotax（ 図1D）にマウスを移し、直腸温度計を挿入します。 2％イソフルランを減らします。
- 肢あたりの注入量の約50％を実現し、30 G針と3/10 ccのシリンジ - 29を使用して、後肢にグリコピロ0.05ミリグラム/ 100グラムのマウスの筋肉を管理します。
- 一度時間あたりの皮下に生理食塩水に1ミリリットル/（水分補給用）100グラムのマウス5％グルコースを管理します。
- 手術（ 図1F）に使用後の保有者にねじ込ま室ホルダーを挿入します。高さを調整し、トッププレートに止めねじの上にポストをねじる。
- 両方の所有者が添付して、胸が自由にインスピレーションの際に拡張することができるまで、ポストホルダーにホルダーを高める。
注：所有者の事務所の取り付けと胸significanの自由膨張両TLY呼吸によるモーションアーチファクトを低減。 - 必要に応じて撮像を行う。
- イメージングは、チャンバホルダーをオフねじる、下部支柱完了すると、直腸温度計を削除し、回復するために加熱された表面上にマウスを置く。それは完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さないでください。
Representative Results
上記の手順に従って、手術の各段階は、 図2に概説手術の各段階の結果を模倣するべきである。特別な注意は、シリコーンエラストマーを適用する際にガラスの下に気泡を除去するために取らまたは少なくともそれらがあることを確認しなければならない関心領域（ 図2L）の周辺に位置する。経験豊富な外科医のために、手術中または最初の24時間の術後内のいずれかに安楽死を必要とする外科的合併症が事業の約20％に起こる。これらの合併症は、最も頻繁に過剰な軟組織の出血または安全に脊柱にチャンバを取り付けるための障害から生じる。
首尾よく移植さ室では、ウィンドウは通常、複数の週（ 図3）のための光学的に透明のまま。最善の努力にもかかわらず、不透明な、繊維状、新生物増殖は、多くの場合、部分的なobscuriで、その結果、数日以内に形成し、ウィンドウのNG（ 図3C - F、黒の破線）。蛍光の構造は、この線維組織の下2PEF顕微鏡を用いて見ることが困難である。私たちは、術後以上5週間明確な残り成功裏に注入された窓の約50％で、結果の二峰性分布を見つけ、約50％が1以内難読化になるの - 3週間。 2PEFイメージングを妨げない、 -表示ウィンドウの経験や硬膜（F、緑アスタリスク図3D）上記の血管新生の唯一のささやかな親等内の明確な、ほとんどの場所のままWindows用。私たちの以前の研究30は、頭蓋窓の準備5で見られるものと類似の軽度の炎症を示す、窓と隣接する椎骨の下のミクログリアの増加ではなく、アストロサイトの密度を示した。
後根ganglのサブセットにおいて黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するトランスジェニックマウスにおけるとりわけ、（DRG）ニューロン（YFPH線と、ジャクソン研究所）、軸索が手術後数週間明確に区別であった（ 図4（a）およびb）と一つの動物である限り最大4ヶ月（データは示さず）。血管（ 図4AおよびB）は、血漿中に標識デキストラン眼窩注入蛍光テキサスレッドによって可視化した。ミクログリアもCX3CR1ノックインマウスでGFPを発現するマウスで可視化した（CX3CR1-GFP、ジャクソンLabsは）YFPHライン（ 図4C）に渡った。コントラストと解像度が原因以前に30に説明繊維状の異常増殖の形成に時間（ 図4C）を介して緩やかに悪化した。私たちは日常的に12時間ごとにできるだけ頻繁に死亡することなく、単一のセッションで3時間画像化と。セッション継続時間と周波数が麻酔導入、実験動物に苦痛を伴う倫理的配慮との併用のために動物の許容誤差によって制限されます。
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図1.。カスタム外科手術スイートは、注入中にチャンバの配信を容易にし、その後のイメージングセッション中にチャンバを安定化させる。二サイドバーやトッププレート（A）は、脊髄室（C）に小さなネジを使用して、（B）組み立てられている。拡張可能なポスト（D）との手術台は、保持ピン（E）を使用して、脊椎へのサイドバーの配信とクランプすることができます。その後のイメージングセッションが代わりにインプラント（F）の翼に乗ってセットネジを介してチャンバに取り付けられるように雌ねじポストを使用しています。この図のパネルBネイチャー·パブリッシング·グループの許可を得てファーラーら、Nature方法 、2012年30から変更されている。96 / 52196fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2は、背側椎弓切除術を行い、慢性撮像チャンバは、脊髄への光アクセスを提供するために注入される。手順は、モンタージュに記載されている。まず、皮膚（パネルA、B、プロトコルセクション3.1から3.4）および筋（C; 3.5）は、3つの下にある椎骨を露出させるために引っ込められる。これら三つの脊椎骨を覆う組織（D、E、F; 3.6から3.10）が除去され、それらは、両側（G、H; 3.12）にクランプされる前に、横方向のプロセスは、クリーンな掻き取り。慎重に、中央の椎骨の背側椎弓板が除去された骨の端部をシール（I L）でチャンバを密閉する 前に、チャンバを固定するために、位置（5.3 K）に固定され、ねじ、天板（5.1 J）が印加される。配信ピン（M; 5.8）を除去した後、皮膚をチャンバーの側面に接着される（M、N; 5.8）及び止めねじが翼（O; 5.9）に挿入される。最後に、ネジスロットは、歯科アクリル（P; 5.10）で封止されているとマウスが回復する清潔なケージに入れている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.慢性脊髄室は、光学的に透明OVのまま複数の週えー。数分（A）から、手術後三週間（F）の範囲の脊髄の白色光画像。血管のランドマークは、すべての時点（黄色の矢印）で識別可能である。ほとんど変化が一日の術後（B）で見られる。密な線維性成長（C -右下の破線で囲まれたFは ）早けれ撮像領域の部分的な難読化で三日間、結果として存在する。軽度の新生血管形成（D、E、F、緑アスタリスク）も存在するが、白色光または2PEF撮像においてオリジナルの血管系を不明瞭にしない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここで実証した技術は繰り返し、タイムラプスを可能にし、多くの週まで出背マウスSCのin vivoイメージングは、その後の外科的処置を必要とせずに動作可能に投稿してください。この手順は、繰り返し手術イメージング研究の上や携帯ダイナミクスに関する情報が失われportmortem組織学的アプローチ、オーバー実質的な改善を表している。我々は以前30が インビボで SCIの病態を研究するためのこの技術の価値を実証しています。
イメージングの最大長手方向の広がりは、SCの背側表面上に密な線維組織の成長によって決定した。時間が経つにつれて、この成長は、画像コントラスト及び解像度の損失をもたらした。この成長は、代替外科の製剤31で確認されています。逸話的には、表面をシールする、この成長は慎重に血液製剤を除去するために、背側SCの表面を洗浄することにより最小限に抑えることができることを観察したシアノアクリレートとカット骨、シリコーンエラストマーとよく、チャンバの縁部をシールし、背側SCとカバーガラスとの間の間隙空間を最小化する。
近年、ポリカーボネートチャンバーを用いて我々自身に類似した別のアプローチは、32実証されている。それが私たちのステンレス鋼部品の場合ではないX線及び音響イメージングモダリティと互換性があるので、ポリカーボネートの使用が有利である。しかし、3Dプリンタの現在ユビキタス技術で、チャンバー部品は、特定のニーズに合わせて多種多様な材料から製造することができる。我々は最近、明確なフォトポリマー内のすべての私達の部分を印刷している。
密閉チャンバーの一つの重要な欠点は、薬物やSCイメージング34に適し外因性染料の繰り返し投与量を管理することができないことである。しかし、私たちの本システムの機械的安定性を活かしことにより、我々はすでに成功に私たちの現在の室を使用していたlyがあっても、閉じたチャンバーシステム（未発表）に複数の時点での薬物送達のために許可された皮下移植注入口に接続された髄腔内カテーテルを固定する。また、原因天板のモジュラー性質のため、この準備の将来のバージョンは、両方の治療剤および蛍光標識を繰り返し適用を可能にするために再シール可能なチャンバーが含まれます。これは、薬物送達のための電極、光学インサート、およびポートを記録するためのマウントを有する天板を想定することも可能である。このような追加は可能性が高いFenrich らのより多くのミニマリストシステムを使用して実装するために、より困難になる。31。結論として、私たちの室は、多様な実験が基づくことができるゲートウェイプラットフォームを提供します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
| forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
| retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
| retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
| retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
| feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
| stereotax | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | ||
| spinal chamber | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | ||
| spinal chamber holders | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | ||
| Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
| Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
| Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
| Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
| Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
| Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
| KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |
References
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