Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

A Procedure til implantering en Spinal afdeling for Longitudinal Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52196
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Summary

I denne video, beskriver vi en fremgangsmåde til implantering af en kronisk optisk billeddannelse kammer i den dorsale rygmarv af en levende mus. Kammeret, kirurgiske procedure, og kronisk billedbehandling gennemgås og demonstreres.

Introduction

Time-lapse in vivo mikroskopi i intakte organismer muliggør direkte visualisering af komplekse biologiske processer, der er utilgængelige for traditionelle enkelt tidspunkt analyse, såsom immunhistokemi. Specifikt multi-foton mikroskopi (MPM) 1 giver mulighed for billeddannelse i spredende væv, såsom gnaver neocortex, hvor billeddannelse op til 2,3 og over 4 1 mm er opnået. Når det kombineres med kirurgiske præparater 5-7, hvor en enkelt procedure giver optisk adgang til hjernen i uger til måneder, har disse mikroskopi fremgangsmåder blevet anvendt til at studere dynamiske processer i hjernen hos raske og syge tilstande 8-11. Desuden har protokoller blevet udviklet 12,13 der tilvejebringer in vivo-billeddannelse i vågne (dvs. ikke bedøvede) dyr, der giver mulighed for cellulær opløsning funktionel billeddannelse under adfærdsmæssige assays. Disse protokoller er blevet anvendt til comparisons af korrelerede neuronal aktivitet 14, astrocyt calcium signalering 15 i bedøvede og vågen dyr, identifikation af task-specifikke neuronale klynger 16, og evnen af neuroner til at skelne objekt placering ved knurhår stimulation 17.

I betragtning af potentialet i denne tilgang at belyse sunde og patologiske mekanismer, time-lapse in vivo imaging blev anvendt til musen rygmarven (SC), giver mulighed for at identificere akut axonal degeneration (AAD) som en sygdom mekanisme 18. Efterfølgende undersøgelser undersøgt virkningerne af perifere læsioner på dorsale rodganglier (DRG) axon regeneration 19 rolle af blodkar i axon regeneration 20, glial kemotaksi som respons på skade 21, T-celle-migration i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) 22 aktivitet af mikroglia 23,24 og astrocytter 25 som svar på amyotrophic lateral sklerose (ALS), rolle STAT-3 i axonal spiring efter SC skade (SCI) 26, og en mekanisme for axon tab og nyttiggørelse i EAE 27. På trods af succesen af ​​disse metoder, blev alle disse undersøgelser er begrænset til enten en enkelt imaging session og derved begrænse undersøgelser kortsigtsdynamikken, ellers kræves gentagne kirurgiske åbninger af dyret på hver imaging tidspunkt, begrænsning af antallet af tidspunkter tilgængelige og øge sandsynligheden for confounding eksperimentelle artefakter. Protokoller for disse operationer er blevet offentliggjort tidligere 28,29.

For nylig offentliggjorde vi en teknik 30 for implantation af en kronisk spinal kammer, aktiveret time-lapse MPM billeddannelse i muse SC over flere uger uden behov for gentagne operationer. Kort fortalt denne kirurgiske præparat, udfører laminektomi i den nederste thorakale hvirvelsøjle og implantation af en firedelt kammer. Kammeret inkluderettre custom-bearbejdede rustfrit stål dele, fastspændt ryghvirvler omkring laminektomi, og et dækglas placeret over SC og sikret med silicone elastomer. Denne teknik tilladt for rutinemæssig billeddannelse ud til mere end 5 uger postoperativt hos raske og sårede stater uden behov for gentagne operationer. Antallet af billeddannende tidspunkter blev kun begrænset af den frekvens, ved hvilken dyret kan tolerere bedøvelsesmiddel induktion. Imaging levetid var begrænset af væksten i en tæt, fibrøst væv over overfladen af ​​SC. Desuden har vi bekræftet, at det kirurgiske implantat havde ingen langsigtet effekt på motorisk funktion.

Siden vores første offentliggørelse, har alternative tilgange også muliggør langsigtet billeddannelse i SC blevet beskrevet andetsteds 31-33. Denne protokol viser vores procedure for implantering af spinal kammer vi udviklet.

Protocol

BEMÆRK: pleje og eksperimentel manipulation af alle mus i dette papir blev godkendt af Cornell University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Opsætning til operation

  1. Steriliseres alle nødvendige værktøjer ved hjælp af en autoklave eller godkendte steriliseringsprocedurer. Som et minimum omfatter en skalpel, saks, Vanna saks, pincet, guldsmedens skruetrækker, vatpinde, et sæt af retraktorer, implantatet (figur 1A) og dens leveringssystem (figur 1D, E).
  2. Tør alle overflader, herunder eventuelle Stereoskopet drejeknapper, med 70% ethanol og / eller egnede desinfektionsmidler.
  3. Opret et sterilt område ved at lægge den brugerdefinerede stereotax (figur 1D) og omgivende benchtop med sterile forhæng. En varmepude (helst tilbagemeldinger kontrolleret) skal placeres på toppen af ​​stereotax og under de sterile forhæng.

2. Forberedelsemusen til operation

  1. Bedøver en mus under 5% isofluran / oxygen i en induktion kammer indtil vejrtrækning bremser til ca. 1 åndedrag / sek.
  2. Overfør musen til en mellemstation område væk fra det sterile område ved hjælp af en næse kegle at fortsætte isofluran eksponering. Reducer isofluran til 2%. Anvend øjet salve for at forhindre udtørring af hornhinden.
  3. Indgives glycopyrrolat (et anticholinergt lægemiddel) på 0,05 mg / 100 g mus intramuskulært i baglemmer anvender 29-30 G nåle og 3/10 cc sprøjte, der leverer ca. 50% af injektionsvolumenet per lem.
    BEMÆRK: Glycopyrrolat tjener til at forhindre væske buildup i lungerne, mens musen er under anæstesi.
  4. Brug af elektriske klippere, barbere en del af den dorsale aspekt af mus, ca. 3 cm lang og 2 cm brede og centreret om thorax Arch. Rengør helst trimmet hår langt væk fra det barberede område.
  5. Indgiv følgende injektioner subkutant og distalt for barberedepatch anvendelse 29-30 G kanyler og 3/10 cc sprøjter: 1 ml / 100 g mus 5% glucose i saltvand (for hydrering), 5 mg / kg mus ketoprofen (et NSAID for analgesi), 0,2 mg / kg mus dexamethason ( et antiinflammatorisk steroid at reducere inflammation).
  6. Ved hjælp af vatpinde, udføre tre alternerende vaske af jod og 70% ethanol, venter 1 min i mellem vaskene.
  7. Injicer 100 pi 0,125% bupivacain (en perifer nerve blok) subkutant anvendelse 29-30 G nåle og 3/10 cc sprøjte til centrum af den barberede patch til at mindske smerter ved incisionsstedet.
  8. Overførsel musen til den brugerdefinerede stereotax (figur 1D), indsæt rektal termometer, og vent ca. 10 min for bupivicain kan træde i kraft.

3. Expose og Rengør Dorsal laminae af 3 Tilstødende brysthvirvel

  1. Ved hjælp af skalpel, oprette en lille (5 mm eller mindre) indsnit over ryghvirvler af interesse (figur 2A).
  2. Ved hjælp af en skalpel eller kirurgiske sakse, forsigtigt adskille binde- fascia mellem huden og underliggende muskel.
  3. Brug retraktorer at holde tilbage i huden, der giver mulighed for så stort et arbejdsområde som muligt (figur 2B). Pas på ikke at øge belastningen på brystet og dermed hindre vejrtrækning.
  4. Ved hjælp af en pincet, greb rostral længst ryghvirvel der vil blive udsat gennem overliggende muskler. Ved hjælp af en skalpel skæres væv væk på hver side af den dorsale processen fra alle 3 ryghvirvler (figur 2c).
  5. Brug en kombination af en skalpel, vatpinde, og / eller knogle skraber, fjern alle overliggende væv fra dorsale lagene (figur 2D).
  6. Ved hjælp af kirurgiske sakse, omhyggeligt skåret væk sener knyttet til hvirvlerne på begge Lateral kanter af rygsøjlen (Figur 2E).
  7. Ved hjælp af skalpel forsigtigt fjerne så meget væv fra de laterale kanter af rygsøjlen som muligt for at give en ren fastspændingsoverflade.
  8. Forsigtigt debridere ryghvirvler resterende blødt væv ved hjælp af en knogle skraber og / eller vatpind. Trim væk enhver inkongruent væv andre steder ved hjælp af kirurgiske sakse (figur 2F).
    BEMÆRK: Det er vigtigt for både fastspænding og udførelse af dorsale laminektomi, at hvirvlerne rent udsættes. En cauterizer kan være nyttigt til at kontrollere efterfølgende blødning.
  9. Shift retraktorer at tilbageholde væv, der omgiver rygsøjlen foruden huden (figur 2F).
  10. Sæt implantatet side barer til tænderne på leveringen stillinger og indlæse disse i den post-indehavere (som i figur 1E).
  11. Spænd 3 ryghvirvler ved hjælp af side barer, gælder lige nok pres til at holde securely (figur 2G, H). Brug pincet til at sikre et niveau fastspænding af 3 ryghvirvler. Bemærk, at flere forsøg kan være nødvendige. Sørg for, at den side barer er både niveau og parallelle før udførelse af laminektomi.
  12. Omhyggeligt rene og tørre den dorsale overflade af den fastspændte ryghvirvler hjælp vatpinde.

4. Udfør en Dorsal laminektomi

  1. Sæt spidsen af ​​Vännäs saks i epiduralrummet af den mediale fastspændt ryghvirvel og presse håndtagene let; hvis knoglen er tørt, skal det revne langs den dorsale lamina. Gentag denne procedure på den kontralaterale side for at frigøre lamina.
  2. Forsigtigt gribende løs lamina ved dorsale processen med pincet, forsigtigt skære væk enhver bindevæv ved rostralt og caudale ender af lamina og løft den væk.
  3. Brug 0,9% saltvand og / eller kunstig cerebral spinalvæske (ACSF), vaskes væk enhver blod overlying rygmarven. Brug vatpinde til at absorbere overskydende væske.
  4. Brug Vännäs saks, omhyggeligt trimme de laterale kanter af knoglen tilbage til sidepaneler af implantatet. Igen, vaske væk og styre blødning ved brug vatpinde og saltvand / ACSF.
  5. I tilfælde af at en del af periost har afmonteret og ligger over rygmarven, forsigtigt fjerne dette væv ved hjælp af vatpinde og / eller en 29-30 G nål. Pas på ikke at skade rygmarven i denne del af proceduren. Du må ikke forveksle den løse periosteum med tæt pakket dura mater.
  6. Forsigtigt, forsegle de resterende blotlagte kanter af knoglen med en eller begge af dental akryl og cyanoacrylat (Figur 2i). Vær særlig opmærksom på ikke at lade lim til at flyde på den blottede rygmarven.

5. Seal mødesalen

  1. Placer den øverste plade omhyggeligt, så de 4 pladser i linje med de 4 huller på siden barer og åbningen ligger over den udsatte centrifugeringal ledningen (figur 1B og 2J).
  2. Brug af guldsmedens skruetrækker forsigtigt starte den første skrue, stabilisere aksel skruetrækker med et andet par pincet. Du må ikke stramme skruen på dette tidspunkt, men sæt den så de første par tråde er engageret. Gentag denne proces for de andre 3 skruer.
    BEMÆRK: Det er nyttigt at bruge titanium eller andre ikke magnetiserbare pincet til at placere skruerne på nuværende tidspunkt.
  3. Med alle 4 skruer på plads, spændes hver skrue skiftevis med samme beløb i små trin, indtil skruer er sikkert fastgjort (figur 2K). Bemærk, at det ikke er usædvanligt for topplade til at bøje under denne proces. Pas på ikke at stramme skruerne for meget, da skruehovedet kan bryde og overdreven nedadgående pres vil løsne klemmen og / eller resultere i rygmarvsskade.
  4. Brug en silikoneelastomer at fylde rummet mellem rygmarven og glasset. Fordi det does ikke producere eddikesyre under hærdning, brug KwikSil mærke elastomer og blande tips. Påfør en liberal del af silicone til den eksponerede rygmarven. Vær omhyggelig med at slippe af med nogen silicone indeholder luftbobler fra blandespids før påføring på rygmarven.
  5. Arbejde hurtigt Tryk forsigtigt en 5 mm # 0 dækglas i indsatte i toppladen. Påfør nok tryk til gradvist presse væsken elastomer omgiver rygmarven, men ikke medføre rygmarvskompression (figur 2L). Indstilling tid til elastomeren er ca. 90 sek, så sørg dækglasset anvendes hurtigt.
  6. I tilfælde af en mislykket forsegling, vente, indtil elastomer har sat, forsigtigt fjerne det fra implantatet med en pincet, og gentag 5,4-5,5.
  7. Dæk kanterne af udsondret elastomer med dental acryl / cyanoacrylat og klæbe til den omgivende knogle så meget som muligt at forhindre elastomeren fra skiftende over overfladen af ​​rygmarven.
  8. Fjern retraktorer og trække huden op omkring kanten af ​​implantatet. Brug cyanoacrylat, holde huden til kanterne af implantatet (figur 2M, N).
  9. Indsæt # 0-80 - 1/4 "sæt skruerne i vingerne af den øverste plade (figur 1C og 2 O).
  10. Ved hjælp af dental akryl, forsegle eventuelle huller i skruen huller i toppladen (Figur 2P).

6. Postoperativ pleje

  1. Fjern dyret fra anæstesi og sted i et stort rent bur. Kontroller, at buret er så store, at kammeret ikke vil hænge fast på noget (såsom v-formede dip til en vandflaske og / eller fødevarer) i løbet af den normale bevægelse hele buret.
    BEMÆRK: En standard rotte bur er ideel.
  2. Placer buret på en opvarmet overflade, mens dyret kommer sig. Du må ikke vende tilbage musen til selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt.
  3. Tjek dyr Behavior inden for 1 - 2 timer postoperation for tegn på smerte eller angst og implantat integritet.
    BEMÆRK: Under normale forhold, skal dyret kunne ambulate med beskedne forstyrrelser til bevægelse.
  4. Fortsæt med at kontrollere dyr hver 8-12 timer for de første 72 timer, måling vægt og overvågning adfærd. Kontroller, at dyrene er aktive og mobile løbet af natten. Våd mad i form af jord chow blandet med vand eller ernæringsmæssige geler, chow pellets, og drikkevand bør gives på jordoverfladen. Yderligere hydrering ved subkutan eller intraperiotoneal injektioner bør gives efter behov.
  5. Anvend 5 mg / kg mus ketoprofen og 0,2 mg / kg mus dexamethason subkutant ved 24 og 48 timers tidspunkter, postoperativt. Derudover bør ,005-,010 mg / 100 g mus administreres hver 8. time ved subkutan injektion i 72 timer.

7. In Vivo Imaging

  1. Bedøver en mus under5% isofluran / oxygen i en induktion kammer indtil vejrtrækning bremser til ca. 1 åndedrag / sek.
  2. Overfør musen til den brugerdefinerede stereotax (Figur 1D) feedback kontrolleret varmepude og indsæt rektal termometer. Reducer isofluran til 2%.
  3. Administrere glycopyrrolat 0,05 mg / 100 g mus intramuskulært i baglemmer anvender 29-30 G nåle og 3/10 cc sprøjte, der leverer ca. 50% af injektionsvolumenet per lem.
  4. Indgiv 1 ml / 100 g mus 5% glucose (for hydrering) subkutant i saltvand en gang pr time.
  5. Sæt gevind kammer indehavere i den post-holdere, der anvendes til kirurgi (figur 1F). Juster højden og sno de stillinger onto sætskruerne i toppladen.
  6. Med begge holdere fastgjort, ophøje indehaverne i post-indehavere, indtil brystet frit kan udvide inspiration.
    BEMÆRK: Både fast fastgørelse af indehavere og fri ekspansion af brystet significantly reducere bevægelsesartefakter grund vejrtrækning.
  7. Udfør billeddannelse som ønsket.
  8. Når billeddannelse er færdig, lavere stillinger, twist off kammer indehavere, fjern rektal termometer og sted musen på en opvarmet overflade for at komme sig. Du må ikke vende tilbage musen til selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt.

Representative Results

Ved at følge ovenstående procedure, bør hvert trin i operationen efterligne resultaterne for hver fase af operationen er skitseret i figur 2. Der skal udvises særlig forsigtighed ved anvendelsen af silikone elastomer at fjerne luftbobler under glas eller i det mindste sikre, at de placeret ved periferien af området af interesse (figur 2L). For en erfaren kirurg, kirurgiske komplikationer, der kræver eutanasi enten under kirurgi eller inden for de første 24 timers postsurgery forekommer hos ca. 20% af transaktionerne. Disse komplikationer oftest opstå overdreven blødt væv blødning eller manglende fastgøre kammeret til rygsøjlen.

I held implanterede kamre, vinduet typisk forbliver optisk transparent for flere uger (Figur 3). Trods bedste indsats, en uigennemsigtig, fibrøs, neoplastisk vækst danner ofte inden for et par dage, hvilket resulterer i delvis obscuring af vinduet (figur 3C - F, sort stiplet linje). Fluorescerende strukturer er svært at se at bruge 2PEF mikroskopi under denne fibrøst væv. Vi finder en bimodal fordeling af resultater, med ca. 50% af succes implanterede vinduer resterende klar i mere end 5 uger postoperativt, og ca. 50% blive korrumperet indenfor 1 - 3 uger. For vinduer, der forbliver klare, de fleste steder i tegnevinduet erfaring kun en beskeden grad af neovaskularisering i eller over dura (figur 3D - F, grøn asterisk), som ikke hindrer 2PEF billeddannelse. Vores tidligere undersøgelse 30 viste en stigning i mikroglia, men ikke astrocyt tæthed under vinduet og tilstødende ryghvirvler, hvilket indikerer mild inflammation analog med den, der ses i kraniel vindue præparater 5.

I transgene mus, der udtrykker gult fluorescerende protein (YFP) i en delmængde af dorsale Ganglia (DRG) neuroner (YFPH linje; Jackson Labs), axoner var klart skelnes uger postoperativt (figur 4A og B), og så længe fire måneder i et dyr (data ikke vist). Blodkar (figur 4A og B) blev gjort synlige ved retro-orbitalt injicere fluorescerende Texas Red mærkede dextran i blodplasma. Mikroglia blev også visualiseret i mus, der udtrykker GFP i en CX3CR1 knock-i mus (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) krydses til YFPH linje (figur 4C). Kontrast og opløsning forværret beskedent over tid (figur 4C) på grund af dannelsen af en fibrøs overvækst tidligere 30 beskrevet. Vi rutinemæssigt afbildet i 3 timer i en enkelt session uden dødelighed og så ofte som hver 12 timer. Session varighed og hyppighed er begrænset af tolerancen af ​​dyret for bedøvelse induktion, samtidig med de etiske overvejelser, der ledsager smerte og lidelse til forsøgsdyr.

< p class = "jove_content" FO: keep-together.within-side = "altid"> Figur 1
Figur 1. En brugerdefineret kirurgisk suite letter levering kammeret under implantation og stabiliserer kammeret under efterfølgende billeddannelse sessioner. To ved siden barer og en topplade (A) er samlet (B) ved hjælp af små skruer i spinal kammer (C). Et kirurgisk bord med forlænges stillinger (D) giver mulighed for levering og fastspænding af side-barer til hvirvlerne ved hjælp holde-stifter (E). Efterfølgende billedbehandling sessioner i stedet bruge internt gevind stillinger for at knytte til kammeret via skruerne på vingerne af implantatet (F). Panel B i denne figur er blevet ændret fra Farrar et al., Nature Methods 2012 30 med tilladelse fra Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. En dorsal laminektomi udføres, og en kronisk afbildningskammeret implanteres for at give optisk adgang til rygmarven. Fremgangsmåden er beskrevet i montage. Først huden (panel A, B Protokol sektioner 3,1-3,4) og muskler (C; 3.5) trækkes tilbage for at blotlægge de tre underliggende ryghvirvler. Vævet overliggende disse tre hvirvler er fjernet (D, E, F; 3,6-3,10) og de ​​laterale processer skrabes rene før de er fastspændt på begge sider (G, H; 3,12). Forsigtigt, den dorsale lamina af den centrale ryghvirvel fjernes, og kanterne af knoglen forseglet (I (J 5.1) og skruer fastgøres i position (K 5.3) for at sikre kammeret før forsegling kammeret med silikone elastomer og dækglas (L 5.5). Efter levering stifter fjernes (M 5.8), huden limet til siderne af kammeret (M, N; 5.8) og stilleskruerne er indsat i vingerne (O; 5.9). Endelig er skruekærve forseglet med dental akryl (P; 5,10). Og musen placeres i et rent bur til at inddrive Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3

Figur 3. En kronisk spinal kammer forbliver optisk transparent ovER flere uger. Hvidt lys billeder af rygmarven, der spænder fra flere minutter (A) til tre uger postoperativt (F). Vaskulære vartegn kan identificeres på alle tidspunkter (gule pile). Lille ændring ses ved en dag postsurgery (B). Tætte fiberholdigt tilgroning (C - F, der er afgrænset af stiplet linje på nederst til højre) er til stede så tidligt som tre dage og resulterer i en delvis formørkelse af imaging-området. Mild neovaskularisering (D, E, F, grønne asterisker) er også til stede, men ikke skjule den oprindelige kar i hvidt lys eller 2PEF billeddannelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4

Figur 4. En kronisk spinal kammer giver mulighed for gentagen multi-foton billeddannelse uden behov for gentagne operationer. Gentagen billeddannelse af transgene mus, der udtrykker YFP i en undergruppe af DRG axoner (grøn) i den dorsale Funiculi af spinal ledning og vaskulatur (rød) mærket ved intravaskulær farvestof injektion (A, B). Aktiviteten af mikroglia (lilla) kan også spores over tid i Thy1-YFP / CX3CR1-GFP dobbelt transgene mus (C). Mens axoner og mikroglia forbliver synlige, kontrast og opløsning tilbagegang beskedent over tid (C). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Teknikken demonstreret her mulighed for gentagen, tidsforskudt, in vivo billeddannelse af dorsale muse SC ud til mange uger efter operation uden behov for efterfølgende kirurgiske procedurer. Denne procedure udgør en væsentlig forbedring i forhold til gentagen kirurgi billeddiagnostiske undersøgelser eller over portmortem histologiske metoder, hvor oplysninger om cellulære dynamik går tabt. Vi har tidligere 30 demonstreret værdien af denne teknik til at studere SCI patologi in vivo.

Den maksimale langsgående udstrækning af billeddannelse blev bestemt ved væksten af ​​en tæt, fibrøst væv over dorsale overflade af SC. Over tid, denne vækst resulterede i tab af billedets kontrast og opløsning. Denne vækst er også blevet set i alternative kirurgiske præparater 31. Anekdotisk, har vi observeret, at denne vækst kan minimeres ved omhyggelig vask af dorsale SC overflade for at fjerne blodprodukter, forsegling overfladecut ben med cyanoacrylat, forsegling kanter af kammeret godt med silikoneelastomer, og minimere det interstitielle rum mellem den dorsale SC og dækglasset.

For nylig har en anden tilgang ligner vores egen ved hjælp af en polycarbonat kammer påvist 32. Anvendelse af polycarbonat er fordelagtig, da det er kompatibelt med røntgen og akustiske afbildningsmodaliteter, hvilket ikke er tilfældet for vores rustfri ståldele. Men med den nu allestedsnærværende teknologi 3D-printere, chamber dele kan være fremstillet af en bred vifte af materialer, der passer til specifikke behov. Vi har for nylig udskrevet alle vores dele i en klar fotopolymer.

En vigtig ulempe ved et lukket kammer er den manglende evne til at administrere gentagne doser af lægemidler eller exogene farvestoffer egnede til SC billeddannelse 34. Men ved at udnytte den mekaniske stabilitet i vores nuværende system, vi har allerede brugt vores nuværende kammer til en vellykketly forankre et intratekalt kateter forbundet til en subkutant implanteret injektionsporten, som er tilladt for lægemiddelafgivelse på forskellige tidspunkter, selv i et lukket system kammer (ikke offentliggjort arbejde). På grund af den modulære beskaffenhed af den øverste plade, vil fremtidige versioner af dette præparat omfatter en genlukkelig kammer for at tillade gentagen anvendelse af både terapeutiske midler og fluorescerende mærker. Det er også muligt at forestille topplader med monteringer til optagelse elektroder, optiske skær og porte for drug delivery. Sådanne tilføjelser vil sandsynligvis være mere udfordrende at gennemføre ved hjælp af mere minimalistisk system Fenrich et al. 31. Sammenfattende vores kammer tilvejebringer en gateway platform, hvorpå forskellige eksperimenter kan baseres.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc. Fine Science Tools multiple 
retractor kit -magnetic fixator Fine Science Tools 18200-02
retractor kit -retractor Fine Science Tools 18200-09 other retractors may also be used
retractor kit -elastomer Fine Science Tools 18200-07
feedback controlled heating blanket CWE Inc. Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue Loctite Loctite 495 multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) Teets Mfg. Part: 8101 multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) Teets Mfg. Part: 8501 multiple suppliers
Glycopyrrolate MWI Veterinary Supply MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Bupivacaine MWI Veterinary Supply MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen MWI Veterinary Supply MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone MWI Veterinary Supply MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer World Precision Inc. KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips World Precision Inc. KWIKMIX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910 (2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227 (2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081 (2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Tags

Neuroscience rygmarv, multiphoton mikroskopi dyr operation fluorescensmikroskopi biomedicinsk optik
A Procedure til implantering en Spinal afdeling for Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging af Mouse Spinal Cord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A… More

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (94), e52196, doi:10.3791/52196 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter