Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En Prosedyre for Implantere en Spinal Chamber for Longitudinal Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52196
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Summary

I denne videoen beskriver vi en prosedyre for å implantere en kronisk optisk avbildning salen over dorsal ryggmargen av en levende mus. Kammeret, kirurgisk prosedyre, og kronisk bildebehandling blir gjennomgått og demonstrert.

Introduction

Time-lapse in vivo mikros i intakte organismer gjør det mulig direkte visualisering av komplekse biologiske prosesser som er utilgjengelige for tradisjonelle én-tidspunkt analyse, for eksempel immunhistokjemi. Nærmere bestemt tillater multi-foton mikroskopi (MPM) 1 for avbildning i sprednings vev, slik som gnager neocortex, hvor avbildnings opp til 2,3 og i overkant av fire 1 mm er oppnådd. Når den kombineres med kirurgiske preparater 5-7 hvori en enkelt prosedyre tillater optisk adgang til hjernen i uker til måneder, har disse mikros tilnærminger blitt brukt til å studere dynamiske prosesser i hjernen hos friske og syke tilstander 8-11. I tillegg har protokoller er utviklet 12,13 som sørger for in vivo avbildning i våken (dvs. ikke-bedøvede dyr), slik at for cellulær oppløsning funksjonell avbildning under atferdsmessige analyser. Disse protokollene har blitt brukt for comparisons av korrelerte neuronal aktivitet 14, astrocytt kalsiumsignalering 15 i bedøvede og våkne dyr, identifisering av oppgavespesifikke neuronal klynger 16, og evnen av nerveceller for å diskriminere objekt sted ved whisker stimulering 17.

Gitt den potensielle av denne tilnærmingen for å belyse sunne og patologiske mekanismene, time-lapse in vivo avbildning ble anvendt på mus ryggmargen (SC), slik at for identifisering av akutt aksonal degenerasjon (AAD) som en sykdomsmekanisme 18. Senere studier undersøkte effekten av perifere lesjoner på ryggmargen (DRG) axon regenerering 19, rollen av blodkar i axon regenerering 20, glial kjemotaksis i respons til skade 21, T-celle migrasjon i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 22, aktivitet av mikroglia 23,24 og astrocytter 25 i respons til amyotrophic lateral sklerose (ALS), rollen STAT-3 i aksonal spirende etter SC skader (SCI) 26, og en mekanisme av axon tap og utvinning i EAE 27. Til tross for suksessen av disse metodene, ble alle disse studiene er begrenset til enten en enkelt avbildning økt, og dermed begrense studier for å korte dynamikk, eller ellers kreves gjentatt kirurgiske åpninger til dyret ved enhver tenkelig tidspunkt, noe som begrenser antallet tidspunkter tilgjengelige og øker sannsynligheten for konfunderende eksperimentelle gjenstander. Protokoller for disse operasjonene har vært publisert tidligere 28,29.

Nylig publiserte vi en teknikk 30 for implantering av en kronisk rygg kammer som mulig time-lapse MPM bildebehandling i muse SC over flere uker uten behov for gjentatt operasjoner. I korthet, dette inkludert kirurgiske preparatet utfører laminektomi i nedre thorax ryggraden og implantasjon av et firedelt kammeret. Kammeret inkluderttre tilpasset maskinerte deler av rustfritt stål som klemmes rundt ryggvirvlene laminektomi, og et dekkglass plasseres over SC og sikret med silikonelastomer. Denne teknikken er tillatt for rutine bildebehandling ut til mer enn fem uker postoperativt hos friske og skadde stater uten behov for gjentatt operasjoner. Antallet bilde tidspunkter var begrenset bare av frekvensen ved hvilket dyret kan tolerere bedøvelse induksjon. Imaging levetid var begrenset av veksten av et tett, fibrøst vev over overflaten av SC. I tillegg bekreftet vi at kirurgisk implantat hadde ingen langsiktig effekt på motorisk funksjon.

Siden vår første utgivelse, har alternative tilnærminger også muliggjør langsiktig bildebehandling i SC blitt beskrevet andre steder 31-33. Denne protokollen demonstrerer vår prosedyre for å implantere rygg kammer vi utviklet.

Protocol

MERK: Omsorg og eksperimentell manipulering av alle mus i denne artikkelen ble godkjent av Cornell University Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Sette opp for kirurgi

  1. Sterilisere alle nødvendige verktøy som bruker en autoklav eller godkjent steriliseringsprosedyrer. På et minimum inneholde en skalpell, saks, Vanna saks, pinsett, gullsmed skrutrekker, bomullspinner, et sett med haker, implantatet (figur 1A) og dets leveringssystem (figur 1D, E).
  2. Tørk av alle overflater, inkludert eventuelle stereoskop knotter, med 70% etanol og / eller egnede desinfeksjonsmidler.
  3. Lag et sterilt felt ved overliggende tilpasset stereotax (figur 1D) og omkringliggende benkeplate med sterile forheng. En varmepute (helst tilbakemeldinger styrt) bør plasseres på toppen av stereotax og under sterile forheng.

2. ForberederMus for kirurgi

  1. Bedøve en mus på under 5% isofluran / oksygen i en induksjonskammeret til pustefrekvens bremser til ca en pust / sek.
  2. Overføre musen til en oppsetning område vekk fra det sterile feltet, ved hjelp av en nese kjegle å fortsette isofluran eksponering. Redusere isofluran til 2%. Påfør øyesalve for å hindre hornhinnen tørking.
  3. Administrere glykopyrrolat (et anticholinergisk stoff) på 0,05 mg / 100 g mus intramuskulært i bakbena ved hjelp av 29-30 G nåler og 3/10 cc sprøyte, som leverer omtrent 50% av injeksjonsvolum pr lem.
    MERK: glykopyrrolat tjener til å forhindre væske buildup i lungene mens musen er under narkose.
  4. Bruk av elektriske klippere, barbere en del av rygg aspekt av musen, ca 3 cm lang ved 2 cm brede og sentrert på thorax bue. Rense trimmet hår godt unna det barberte området.
  5. Administrere de følgende injeksjoner subkutant og distalt til det barbertepatch bruker 29-30 G nåler og 3/10 cc sprøyter: 1 ml / 100 g muse 5% glukose i saltvann (for hydrering), 5 mg / kg mus ketoprofen (et NSAID for smertelindring), 0,2 mg / kg mus deksametason ( en betennelsesdempende steroid å redusere betennelse).
  6. Ved hjelp av bomullspinner, utføre tre vekslende vasker av jod og 70% etanol, venter 1 min i mellom hver vask.
  7. Administrer 100 mL 0,125% bupivacain (en perifer nerve blokk) subkutant bruker 29-30 G nåler og 3/10 cc sprøyte til sentrum av den barberte patch for å redusere smerte ved innsnitt området.
  8. Overføring musen til skikken stereotax (figur 1D), sett rektal termometer, og vente ca 10 min for bupivicaine skal tre i kraft.

3. Expose og Rengjør Dorsal lameller av tre Tilstøtende Thoracic Vertebrae

  1. Ved hjelp av skalpell blad, lage en liten (5 mm eller mindre) snitt over ryggvirvlene av interesse (Figur 2A).
  2. Ved hjelp av en skalpell eller kirurgisk saks, forsiktig distansere binde fascia mellom huden og underliggende muskel.
  3. Bruk Saker å holde tilbake huden, noe som åpner for et så stort arbeidsområde som mulig (figur 2B). Pass på å ikke øke belastningen på brystet og dermed hindre pusting.
  4. Ved hjelp av en pinsett, grep rostral-mest vertebra som vil bli eksponert gjennom den overliggende muskel. Ved hjelp av en skalpell, skjære vev bort på hver side av den dorsale prosessen fra alle tre ryggvirvler (figur 2c).
  5. Ved hjelp av en kombinasjon av en skalpell blad, bomullspinner, og / eller bein skraper, fjerne alle overliggende vev fra rygg lameller (figur 2D).
  6. Ved hjelp av kirurgiske saks, klippe bort nøye sener festet til ryggvirvler på begge Lateral kanter av ryggsøylen (figur 2E).
  7. Ved hjelp av skalpellen, forsiktig fjerne så mye vev fra de laterale kanter av virvelsøylen som mulig for å gi en ren klemflate.
  8. Forsiktig debride ryggvirvlene av eventuelle gjenværende mykt vev ved hjelp av et bein skraper og / eller bomullspinne. Trimme bort noen urimelig vev andre steder ved hjelp av kirurgiske saks (Figur 2F).
    MERK: Det er viktig for både klemming og utfører rygg laminektomi at ryggvirvlene er ren utsatt. En cauterizer kan være nyttig for å kontrollere påfølgende blødning.
  9. Skift haker for å holde tilbake i vevet som omgir virvelsøylen i tillegg til hud (figur 2F).
  10. Fest implantatet siden barer til de ledende delene på leverings innlegg og laste disse inn i post-holdere (som i figur 1E).
  11. Klem tre ryggvirvler med side barer, bruke akkurat nok press for å holde securely (figur 2G, H). Bruk pinsett til å bidra til å sikre et nivå klemming av tre ryggvirvler. Legg merke til at flere forsøk kan være nødvendig. Sørg for at side barer er både nivå og parallelt før gjennomføring av den laminektomi.
  12. Nøye ren og tørr dorsalflaten av den klemte ryggvirvlene ved hjelp av bomullspinner.

4. Utfør en Dorsal laminectomy

  1. Sett tuppen av Vännäs saks inn i epiduralrommet av den mediale klemte virvelen og presse håndtakene lett; hvis ben er tørr, bør den sprekke langs lengden av rygg lamina. Gjenta denne prosedyren på motsatt side for å frigjøre lamina.
  2. Forsiktig tak i løs lamina av rygg prosessen med tang, må du kutte bort noen bindevev på rostral og caudal ender av lamina og løfte den vekk.
  3. Ved hjelp av 0,9% saltvann og / eller kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF), grundig vaske bort blod overlying ryggmargen. Bruke bomullspinner til å absorbere overflødig væske.
  4. Ved hjelp av Vännäs saks, nøye trimme sidekantene av benet tilbake til sidestengene av implantatet. Igjen, vaske bort og kontrollere blødning ved bruk bomullspinner og saltvann / ACSF.
  5. I tilfelle at en del av periosteum har frittliggende og ligger over ryggmargen, forsiktig fjerne dette vevet ved hjelp av bomullspinner og / eller en 29-30 G nål. Pass på å ikke skade ryggmargen i denne delen av prosedyren. Ikke forveksle den løse periosteum med tett innpakket dura mater.
  6. Nøye, forsegle de gjenværende eksponerte kanter av benet med en eller begge av dental akryl og cyanoakrylat (figur 2I). Vis forsiktighet for ikke å tillate lim til å flyte på den eksponerte ryggmargen.

5. Seal Chamber

  1. Plasser topplaten nøye slik at de fire sporene på linje med de fire hullene på side barer og åpningen ligger over den eksponerte spinal ledningen (Figur 1B og 2J).
  2. Ved hjelp av gullsmed skrutrekker, begynner forsiktig første skrue, stabiliserende skaftet av skrutrekkeren med en annen pinsett. Ikke skru til skruen på dette stadiet, men sette det slik at de første gjengene er engasjert. Gjenta denne prosessen for de andre tre skruer.
    MERK: Det er nyttig å bruke titan eller andre ikke magnetiser pinsett til å plassere skruene på dette stadiet.
  3. Med alle fire skruer på plass, stram hver skrue vekselvis med samme beløp i små trinn til skruene er godt sikret (figur 2K). Legg merke til at det ikke er uvanlig at den øverste plate for å bøye under denne prosessen. Pass på å ikke stramme skruene for mye, da skruehodet kan bryte og overdreven press vil løsne klemmen og / eller resultere i ryggmargsskade.
  4. Bruk en silikon-elastomer for å fylle rommet mellom ryggmargen og glassvinduet. Fordi det does ikke produsere eddiksyre ved herding, bruker KwikSil merkevare elastomer og miksing tips. Anvende et liberalt parti av silikon til den eksponerte ryggmargen. Vær nøye med å kvitte seg med noen silikon som inneholder luftbobler fra blandespissen før søknad til ryggmargen.
  5. Arbeider raskt, trykk forsiktig en 5 mm # 0 dekk inn i innfelt i topplaten. Trykk hardt gradvis presse væsken elastomer å omringe den ryggmargen, men ikke resultere i ryggmargskompresjon (figur 2L). Stille tid for elastomer er ca 90 sek, så sørg for at dekk påføres raskt.
  6. I tilfelle av en mislykket forsegling, venter du til elastomer har satt, fjern det forsiktig fra implantatet med pinsett, og gjenta 05.04 til 05.05.
  7. Dekke kantene av utstrålte elastomer med dental akryl / cyanoakrylat og holder seg til den omgivende ben så mye som mulig for å hindre at elastomer fra å forskyve seg over overflaten av ryggmargen.
  8. Fjerne haker og dra huden opp rundt kanten av implantatet. Ved hjelp av cyanoakrylat, holder seg på huden til kantene av implantatet (figur 2 M, N).
  9. Sett # 0-80 - 1/4 "sette skruene i vingene av topplaten (figur 1C og 2 O).
  10. Ved hjelp av dental akryl, forsegle eventuelle hull i skruespor av topplaten (figur 2P).

6. Postoperativ Care

  1. Fjerne dyr fra anestesi og plasser i en stor ren bur. Pass på at buret er tilstrekkelig stor at kammeret ikke vil snag på noe (for eksempel v-formet dukkert for en vannflaske og / eller mat) i løpet av normal bevegelse i hele buret.
    MERK: En standard rotte bur er ideelt.
  2. Plasser buret på et oppvarmet underlag mens dyret kommer seg. Ikke returner musen til selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.
  3. Sjekk dyr Behavior innen 1 - 2 timer etter operasjonen for tegn på smerte eller ubehag og implantat integritet.
    MERK: Under normale forhold, skal dyret kunne ambulate med beskjedne forstyrrelsene til bevegelse.
  4. Fortsett å sjekke dyret hver 8-12 timer for første 72 timer, måling av vekt og overvåking atferd. Kontroller at dyrene er aktive og mobil i løpet av natten. Våt mat i form av bakken Chow blandet med vann eller ernærings gels, chow pellets, og drikkevann bør gis på bakkenivå. Tilleggs hydrering av subkutane eller intraperiotoneal injeksjoner bør gis etter behov.
  5. Administrere 5 mg / kg mus ketoprofen og 0,2 mg / kg subkutant i mus deksametason 24 og 48 timers tidspunkter, postoperativt. I tillegg bør 0,005 til 0,010 mg / 100 g mus administreres hver 8. time ved subkutan injeksjon for 72 timer.

7. In vivo avbildning

  1. Bedøve en mus i henhold5% isofluran / oksygen i en induksjonskammeret til pustefrekvens bremser til omtrent en pust / sek.
  2. Overføre musen til skikken stereotax (figur 1D) med tilbakemeldinger kontrollert oppvarming pad og sett rektal termometer. Redusere isofluran til 2%.
  3. Administrere glykopyrrolat 0,05 mg / 100 g mus intramuskulært i bakbena ved hjelp av 29-30 G nåler og 3/10 cc sprøyte, som leverer omtrent 50% av injeksjonsvolum pr lem.
  4. Administrere en ml / 100 g mus 5% glukose (for hydrering) subkutant i saltvann en gang per time.
  5. Sett av gjengekammerholdere inn i post-holdere som brukes for operasjonen (figur 1F). Justere høyden og vri innleggene på justeringsskruene i topplaten.
  6. Med begge holdere festet, heve Eierne i de post-holdere inntil brystet kan fritt utvide på inspirasjon.
    MERK: Både fast feste av innehaverne og fri utvidelse av brystet significantly redusere bevegelsesartefakter grunn til å puste.
  7. Utføre bildebehandling som ønsket.
  8. Ved avbildning er fullført, lavere innlegg, vri av kammerholdere, fjerne rektal termometer, og sted musen på en oppvarmet underlag for å gjenopprette. Ikke returner musen til selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.

Representative Results

Ved å følge fremgangsmåten ovenfor, bør hver fase av operasjonen ligne resultatene for hver fase av operasjonen skissert i figur 2. Man må være forsiktig når du påfører den silikon elastomer å eliminere luftbobler under glass eller i det minste sørge for at de er plassert ved omkretsen av området av interesse (fig 2L). For en erfaren kirurg, kirurgiske komplikasjoner som krever aktiv dødshjelp enten under operasjonen eller innen de første 24 timer etter kirurgi forekommer hos ca. 20% av operasjonene. Disse komplikasjonene oftest oppstår fra overdreven bløtvev blødninger eller unnlatelse av å sikkert feste kammeret til virvelsøylen.

Vellykket implantert kamre, vinduet forblir vanligvis optisk transparent for flere uker (figur 3). Til tross for beste innsats, danner en ugjennomsiktig, fibrøs, neoplastisk vekst ofte i løpet av få dager, noe som resulterer i delvis obscuring av vinduet (figur 3C - F, svart stiplet linje). Fluorescent strukturer er vanskelig å se ved hjelp 2PEF mikros under denne bindevev. Vi finner en bimodal fordeling av resultater, med ca 50% av vellykket implantert vinduer resterende klart for mer enn fem uker etter operasjonen, og ca 50% blir uklar innen 1 - 3 uker. For vinduer som forblir klare, de fleste steder i visningsvinduet erfaring bare en beskjeden grad av neovaskularisering i eller over dura (Figur 3D - F, grønn stjerne), som ikke hindrer 2PEF bildebehandling. Vår tidligere studie 30 viste en økning i mikroglia men ikke astrocyte tetthet under vinduet og tilstøtende ryggvirvler, noe som indikerer mild betennelse analogt til det man ser i hjernevindus forberedelsene fem.

I transgene mus som uttrykker gul fluoriserende protein (YFP) i en undergruppe av dorsal root Ganglia (DRG) nevroner (YFPH linje; Jackson Labs), aksoner var klart kan skilles i flere uker postoperativt (Figur 4A og b) og så lenge som fire måneder i ett dyr (data ikke vist). Blodkar (figur 4A og B) ble gjort synlig ved retro-orbitalt injisere fluorescerende Texas Rødt-merket dekstran inn i blodplasma. Mikroglia ble også visualisert i mus som uttrykker GFP i en CX3CR1 knock-in mus (CX3CR1-GFP, Jackson Labs) krysset til YFPH linje (Figur 4C). Kontrast og oppløsning forverret beskjedent over tid (figur 4C) på grunn av dannelsen av et fibrøst overvekst beskrevet tidligere 30. Vi rutinemessig avbildes i 3 timer i en enkelt økt uten dødelighet og så ofte som hver 12. time. Session varighet og hyppighet er begrenset av toleranse av dyret for bedøvelse induksjon, samtidig med de etiske hensyn som følger med smerte og nød til forsøksdyr.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "always"> Figur 1
Figure1. En tilpasset kirurgisk suite letter kammer levering under implanteringen og stabiliserer kammeret under påfølgende bilde sesjoner. To sideskinner og en topp-plate (A) er montert (B) ved hjelp av små skruer inn i ryggkammeret (C). Et operasjonsbord med uttrekkbare innlegg (D) gjør det mulig for levering og fastspenning av sideskinner til ryggvirvlene ved hjelp av holdestifter (E). Påfølgende bilde økter i stedet bruke internt gjengede innlegg å feste til kammeret via settskruene på vingene av implantatet (F). Panel b av dette tallet har blitt forandret fra Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 med tillatelse fra Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. En rygg laminektomi er utført og en kronisk bildebehandling kammer er implantert å gi optisk tilgang til ryggmargen. Prosedyren er beskrevet i montasje. Først huden (paneler A, B; protokoll seksjoner 03.01 til 03.04) og muskler (C, 3,5) er trukket tilbake for å eksponere de tre underliggende ryggvirvler. Den overliggende vev disse tre ryggvirvler er fjernet (D, E, F; 3,6 til 3,10), og den laterale prosesser er skrapt rene før de er klemt fast på begge sider (G, H; 3.12). Nøye, er den dorsale lamina av den sentrale vertebra fjernet, og de ​​kanter av benet forseglet (I (J, 5,1) og skruer festet i stilling (K; 5.3) for å feste kammeret før forsegling av kammeret med silikon-elastomer og dekkglass (L; 5,5). Etter levering pinnene er fjernet (M; 5,8), huden er limt til sidene av kammeret (M, N; 5,8), og settskruene er satt inn i vingene (O, 5,9). Til slutt blir de skruespor forseglet med dental akryl (P; 5.10). Og musen er plassert i et rent bur å gjenopprette Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3

Figur 3. En kronisk rygg kammer forblir optisk transparent over flere uker. Hvitt lys bilder av ryggmargen, alt fra noen minutter (A) til tre uker postoperativt (F). Vaskulære landemerker er identifiserbar på alle tidspunkter (gule piler). Liten endring er observert ved en dag etter kirurgi (B). Tett fibervekst (C - F, avgrenset av stiplet linje på nedre høyre) er til stede så tidlig som tre dager og resultater i delvis tåkelegging av bildeområdet. Mild neovascularization (D, E, F, grønn stjerne) er også til stede, men ikke skjule den opprinnelige blodkar i hvitt lys eller 2PEF bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4

Figur 4. En kronisk rygg kammer tillater gjentatt multi-foton bildebehandling uten behov for gjentatt operasjoner. Gjentatt avbildning av transgene mus som uttrykker YFP i en undergruppe av DRG axoner (grønn) i rygg funiculi i rygg ledningen og vaskulatur (rød) merket ved intravaskulær injeksjon fargestoff (A, B). Aktiviteten av mikroglia (fiolett) kan også spores over tid i Thy1-YFP / CX3CR1-GFP dobbelt transgene mus (C). Mens axoner og mikroglia forbli synlig, kontrast og oppløsning nedgang beskjedent over tid (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Teknikken vist her tillater gjentatt, time-lapse, in vivo avbildning av dorsal mus SC ut til mange uker etter operasjonen uten behov for etterfølgende operasjoner. Denne prosedyren representerer en betydelig forbedring i forhold til gjenta-kirurgi imaging studier eller over portmortem histologiske tilnærminger, der informasjon om cellulære dynamikk går tapt. Vi har tidligere demonstrert 30 verdien av denne teknikken for å studere SCI patologi in vivo.

Den maksimale langsgående utstrekning av avbildnings ble bestemt ved veksten av et tett, fibrøst vev i løpet av den dorsale overflate av SC. Over tid, resulterte dette vekst i tap av bilde kontrast og oppløsning. Denne veksten har også blitt sett i alternative kirurgiske forberedelser 31. Anecdotally, har vi observert at veksten kan reduseres ved forsiktig vasking av dorsal SC overflaten for å fjerne blodprodukter, tettende overflaten avkuttet ben med cyanoakrylat, tettende kanter av kammeret godt med silikon-elastomer, og å minimere den interstitielle rom mellom den dorsale SC og dekkglass.

Nylig har en annen tilnærming som ligner på vår egen ved hjelp av en polykarbonat kammer blitt vist 32. Bruken av polykarbonat er en fordel siden det er kompatibelt med X-ray og akustiske bildediagnostikk, som ikke er tilfelle for våre deler i rustfritt stål. Men med den nå utbredte teknologi for 3D-skrivere, kammer deler kan fremstilles av et bredt utvalg av materialer for å dekke spesielle behov. Vi har nylig skrevet ut alle våre deler i et klart fotopolymer.

En nøkkel ulempe med et lukket kammer er den manglende evne til å administrere gjentatte doser av legemidler eller eksogene fargestoffer som er egnet for avbildning SC 34. Men ved å utnytte den mekaniske stabiliteten i vårt nåværende system, vi har allerede brukt vår nåværende kammer til vellykketly forankre en intratekal kateter koblet til en subkutant implantert injeksjonsporten, som er tillatt for levering av legemidler ved flere tidspunkter selv i et lukket kammer system (upublisert arbeid). Videre, på grunn av den modulære naturen til topp-platen vil fremtidige versjoner av dette preparatet omfatte et kammer som kan lukkes for å tillate gjentatt anvendelse av både terapeutiske midler og fluorescerende markører. Det er også mulig å se for seg topplater med mounts for opptak elektroder, optiske inserts, og havner for levering av legemidler. Slike tilsetninger vil trolig være mer utfordrende å gjennomføre bruke mer minimalistisk system av Fenrich et al. 31. I konklusjonen, gir vår kammer en gateway plattform hvor ulike eksperimenter kan være basert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc. Fine Science Tools multiple 
retractor kit -magnetic fixator Fine Science Tools 18200-02
retractor kit -retractor Fine Science Tools 18200-09 other retractors may also be used
retractor kit -elastomer Fine Science Tools 18200-07
feedback controlled heating blanket CWE Inc. Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue Loctite Loctite 495 multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) Teets Mfg. Part: 8101 multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) Teets Mfg. Part: 8501 multiple suppliers
Glycopyrrolate MWI Veterinary Supply MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Bupivacaine MWI Veterinary Supply MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen MWI Veterinary Supply MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone MWI Veterinary Supply MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer World Precision Inc. KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips World Precision Inc. KWIKMIX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910 (2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227 (2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081 (2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Tags

Nevrovitenskap ryggmarg, multiphoton mikroskopi dyr kirurgi fluorescens mikroskopi biomedisinsk optikk
En Prosedyre for Implantere en Spinal Chamber for Longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Mouse Spinal Cord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A… More

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (94), e52196, doi:10.3791/52196 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter