Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ett förfarande för att implantera en Spinal avdelningen för Längs Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52196
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Summary

I den här videon beskriver vi ett förfarande för att implantera en kronisk optisk avbildning kammare över ryggens ryggmärgen hos en levande mus. Kammaren, kirurgiska ingrepp, och kronisk avbildning granskas och demonstreras.

Introduction

Time-lapse in vivo mikroskopi i intakta organismer möjliggör direkt visualisering av komplexa biologiska processer som är otillgängliga för traditionell enkeltidpunktsanalysen, såsom immunohistokemi. Specifikt multi-foton mikroskopi (MPM) 1 möjliggör avbildning i spridnings vävnad, såsom gnagare neocortex, där avbildning upp till 2,3 och över 4 1 mm har uppnåtts. I kombination med kirurgiska preparat 5-7 där ett enda förfarande möjliggör optisk access till hjärnan i veckor till månader, har dessa mikroskopi metoder använts för att studera dynamiska processer i hjärnan hos friska och sjukdomstillstånd 8-11. Dessutom har protokoll utvecklats 12,13 som ger för in vivo imaging i vaken (dvs icke sövda) djur, vilket möjliggör cellulär upplösning funktionell avbildning under beteendeanalyser. Dessa protokoll har använts för comparisons för korrelerade nervaktivitet 14, astrocyternas kalcium signalering 15 i bedövade och vakna djur, identifiering av uppgiftsspecifika neuronala kluster 16, och förmågan hos nervceller att diskriminera objekt plats vid morrhår stimulering 17.

Med tanke på den potential denna metod för att belysa hälsosamma och patologiska mekanismer, time-lapse in vivo imaging tillämpades på den musen ryggmärgen (SC), vilket möjliggör identifiering av akut axonal degeneration (AAD) som en sjukdom mekanism 18. Senare studier undersökt effekter av perifera lesioner på dorsalrotsganglier (DRG) Axon förnyelse 19, rollen av blodkärl i Axon förnyelse 20, gliaceller kemotaxi som svar på skada 21, T-cellmigration i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) 22, aktivitet av mikroglia 23,24 och astrocyter 25 som svar på amyotrophic lateralskleros (ALS), vilken roll STAT-3 i axonal groning efter SC skada (SCI) 26, och en mekanism för axon förlust och återhämtning i EAE 27. Trots framgångarna med dessa metoder, var alla dessa studier begränsade till antingen en enda bildsession, vilket begränsar studier till kortsiktiga dynamiken, annars krävs upprepade kirurgiska öppningar av djuret vid varje avbildning tidpunkt, begränsa antalet tidpunkter tillgängliga och ökar sannolikheten för påverkande experimentella artefakter. Protokollen för dessa operationer har tidigare 28,29 publicerats.

Nyligen publicerade vi en teknik 30 för implantation av en kronisk spinal kammare som möjligtidsförlopp MPM avbildning i musen SC över flera veckor utan behov av upprepade operationer. I korthet inkluderade detta kirurgiska preparat utför laminektomi i nedre bröstryggraden och implantation av en fyrdelad kammare. Kammaren ingårtre special bearbetade detaljer i rostfritt stål som klämda kotorna omger laminektomi, och ett glas täck placeras över SC och säkras med silikon elastomer. Denna teknik tillåtet för rutin avbildning ut till mer än 5 veckor postoperativt hos friska och skadade stater utan behov av upprepade operationer. Antalet imaging tidpunkter begränsades endast av den frekvens vid vilken djuret kan tolerera narkosinduktion. Imaging livstid begränsades av tillväxten av en tät, fibrös vävnad över ytan på SC. Dessutom verifierade vi att det kirurgiska implantatet hade ingen långsiktig effekt på motoriska funktioner.

Sedan vår första publicering, har alternativa tillvägagångssätt också möjliggör långsiktig avbildning i SC beskrivits på annan plats 31-33. Detta protokoll visar vårt förfarande för implantering ryggradskammaren vi utvecklat.

Protocol

OBS: Vården och experimentell manipulation av alla möss i denna uppsats godkändes av Cornell University Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Inställning för kirurgi

  1. Sterilisera alla nödvändiga verktyg som använder en autoklav eller godkända steriliseringsförfaranden. På ett minimum, innehålla en skalpell, sax, Vanna sax, pincett, juvelerare skruvmejsel, bomullspinnar, en uppsättning upprullningsdon implantatet (Figur 1A) och dess leveranssystem (figur 1D, E).
  2. Torka alla ytor, inklusive eventuella stereoscope rattar, med 70% etanol och / eller lämpliga desinfektionsmedel.
  3. Skapa ett sterilt område genom att lägga den anpassade stereotax (figur 1D) och omgivande bänkskiva med sterila dukar. En värmedyna (helst återkoppling kontrollerad) ska placeras ovanpå stereotax och under sterila draperier.

2. Förberedamusen för kirurgi

  1. Söva en mus under 5% isofluran / syre i en induktionskammare tills andning saktar till cirka 1 andetag / sek.
  2. Överför musen till en mellanstation område bort från det sterila området, med hjälp av en noskon fortsätta isofluran exponering. Minska isofluran till 2%. Applicera ögonsalva att förhindra hornhinnan torkning.
  3. Administrera glykopyrrolat (en antikolinerg läkemedel) vid 0,05 mg / 100 g mus intramuskulärt i bakbenen med hjälp av 29-30 G nålar och 3/10 cc spruta, vilket ger cirka 50% av injektionsvolymen per lem.
    OBS: Glykopyrrolat tjänar till att förhindra vätska uppbyggd i lungorna när musen är under narkos.
  4. Använda elektriska hårklippnings, raka ett parti av den dorsala aspekten av mus, ca 3 cm lång och 2 cm bred och centrerad på thoraxbågen. Rengör trimmade håret borta från det rakade området.
  5. Administrera följande injektionerna subkutant och distalt om rakadepatch använder 29-30 G nålar och 3/10 cc sprutor: 1 ml / 100 g mus 5% glukos i saltlösning (för vätske), 5 mg / kg mus ketoprofen (ett NSAID för smärtlindring), 0,2 mg / kg mus dexametason ( en antiinflammatorisk steroid att minska inflammation).
  6. Använda bomullspinnar, utföra tre alternerande tvättar av jod och 70% etanol, väntar 1 minut mellan tvättar.
  7. Administrera 100 pl av 0,125% bupivakain (en perifer nervblockad) subkutant med användning av 29 till 30 G nålar och 3/10 cc spruta till centrum av den rakade plåstret för att minska smärta vid snittstället.
  8. Överför musen till anpassade stereotax (Figur 1D), sätt rektal termometer, och vänta ca 10 min för bupivicaine ska börja gälla.

3. Exponera och Rengör Dorsal lameller av 3 Intill bröstkotan

  1. Med hjälp av skalpellblad, skapa en liten (5 mm eller mindre) snitt ovanför kotorna av intresse (Figur 2A).
  2. Med hjälp av en skalpell eller kirurgisk sax, försiktigt dissociera bind fascia mellan huden och underliggande muskler.
  3. Använd upprullningsdon att hålla tillbaka huden, vilket möjliggör en så stor arbetsområde som möjligt (figur 2B). Se till att inte öka belastningen på bröstet och därmed hindra andningen.
  4. Med hjälp av en pincett, greppa rostral-mest kota som kommer att exponeras genom den överliggande muskeln. Med en skalpell skära vävnad bort på vardera sidan av den dorsala processen från alla tre kotor (figur 2c).
  5. Med valfri kombination av ett skalpellblad, bomullspinnar, och / eller ben skrapa, ta bort alla överliggande vävnad från rygg lameller (Figur 2D).
  6. Använda kirurgisk sax, klippa försiktigt bort senor kopplade till kotorna på båda Lateral kanter ryggraden (Figur 2E).
  7. Med användning av skalpell, försiktigt bort så mycket vävnad från sidokanterna av kotpelaren som möjligt för att ge en ren klämyta.
  8. Debridera försiktigt kotorna av resterande mjukvävnad med hjälp av en ben skrapa och / eller bomullspinne. Klipp bort alla ologiskt vävnad på andra håll med kirurgiska saxar (Figur 2F).
    OBS: Det är viktigt för både kläm och utföra rygg laminektomi att kotorna är rent utsatta. En cauterizer kan vara användbara vid reglering av efterföljande blödning.
  9. Shift upprullningsdon att hålla tillbaka den vävnad som omger ryggraden utöver huden (Figur 2F).
  10. Fäst implantatsidostänger till stiften på leverans inlägg och ladda in dessa i de befattningshavare (som i figur 1E).
  11. Kläm fast 3 kotor med sidostänger, applicera bara tillräckligt tryck för att hålla securely (figur 2G, H). Använd pincett för att säkerställa en nivå fastspänning av 3 kotor. Notera att flera försök kan vara nödvändiga. Se till att sido barer är både nivå och parallellt innan du utför laminektomistället.
  12. Försiktigt rent och torka den dorsala ytan av den fastklämda kotor använder bomullspinnar.

4. Utför en Dorsal Laminektomi

  1. Sätt tips av Vannas sax i epiduralrummet i den mediala fastklämda kota och pressa handtagen lätt; Om benet är torr, bör det spricka utmed längden av den dorsala lamina. Upprepa denna procedur på motsatt sida för att frigöra lamina.
  2. Försiktigt gripa den lösa lamina av ryggens processen med pincett, försiktigt skära bort något bindväv vid rostralt och stjärt ändar lamina och lyft bort.
  3. Använda 0,9% koksaltlösning och / eller artificiell cerebrospinalvätska (ACSF), grundligt tvätta bort något blod overlying ryggmärgen. Använd tops att absorbera överflödig vätska.
  4. Använda Vannas sax, försiktigt trimma sidokanter benet tillbaka till sidostänger implantatet. Återigen, tvätta bort och kontrollera blödning använder bomullspinnar och saltlösning / ACSF.
  5. I händelse av att en del av benhinnan har lossnat och ligger över ryggmärgen, försiktigt bort denna vävnad med hjälp bomullspinnar och / eller en 29-30 G nål. Se till att inte skada ryggmärgen i denna del av förfarandet. Blanda inte ihop den lösa benhinnan med hårt lindade dura mater.
  6. Försiktigt, försegla de återstående exponerade kanterna på benet med en eller båda av dental akryl och cyanoakrylat (fig 2i). Var särskilt försiktig att inte låta lim att flyta på den exponerade ryggmärgen.

5. Tätning kammaren

  1. Placera den övre plattan försiktigt så att de 4 platser i linje med de fyra hålen på sidostänger och öppningen ligger över exponerade spinnal sladd (Figur 1B och 2J).
  2. Använda guldsmeds skruvmejseln försiktigt starta den första skruven, stabilisera skaftet på skruvmejseln med en annan pincett. Dra inte åt skruven i detta skede, men för in den så att de första trådarna är engagerade. Upprepa denna process för de övriga 3 skruvarna.
    OBS: Det är bra att använda titan eller andra icke magnetiserbara pincett för att hjälpa ställning skruvarna i detta skede.
  3. Med alla fyra skruvar på plats, dra åt varje skruv växelvis med samma belopp i små steg tills skruvar fast ordentligt (Figur 2K). Observera att det inte är ovanligt för den översta plattan att böjas under denna process. Se till att inte dra åt skruvarna för mycket, eftersom skruvhuvudet kan bryta och överdriven press nedåt kommer loss klämman och / eller resultera i ryggmärgsskada.
  4. Använd en silikonelastomer för att fylla utrymmet mellan ryggmärgen och glasfönstret. Eftersom det does inte producerar ättiksyra under härdning, använd KwikSil varumärke elastomer och blandningstips. Applicera en ordentlig del av silikon på den exponerade ryggmärgen. Var noga med att bli av med någon silikon som innehåller luftbubblor från blandningsspetsen före applicering till ryggmärgen.
  5. Arbeta snabbt, tryck försiktigt en 5 mm # 0 täck i infällda i topplattan. Applicera tillräckligt tryck för att gradvis pressa vätskan elastomeren att omge ryggmärgen, men inte resultera i ryggmärgskompression (fig 2L). Ställa tid för elastomer är ungefär 90 sekunder, så se till att täck appliceras snabbt.
  6. I händelse av en misslyckad tätning, vänta tills elastomer har satt, försiktigt bort den från implantatet med pincett, och upprepa 5,4-5,5.
  7. Täck kanterna på exuded elast med dentala akryl / cyanoakrylat och vidhäftar till det omgivande benet så mycket som möjligt för att hindra elastomeren från att förskjutas över ytan av ryggmärgen.
  8. Avlägsna sårhakar och dra huden upp runt kanten av implantatet. Använda cyanoakrylat, följa huden till kanterna av implantatet (Figur 2 M, N).
  9. Infoga # 0-80 - 1/4 "set skruvar i vingar topplattan (Figur 1C och 2 O).
  10. Använda dentala akryl, täta eventuella luckor i skruvhålen i den övre plattan (Figur 2P).

6. Postoperativ vård

  1. Ta bort djuret från anestesi och placera i en stor ren bur. Se till att buren är tillräckligt stor att kammaren inte kommer att fastna på något (t.ex. v-formade dipp till en vattenflaska och / eller mat) under normal förflyttning hela buren.
    OBS: En standard råtta bur är perfekt.
  2. Placera buren på en uppvärmd yta, medan djuret återhämtar sig. Skicka inte tillbaka musen till företaget av andra djur tills den har återhämtat sig helt.
  3. Kontrollera djur Behavior inom 1 - 2 tim postoperation för tecken på smärta eller ångest och implantat integritet.
    OBS: Under normala förhållanden, bör djuret kunna pendla med blygsamma störningar till rörelse.
  4. Fortsätt att kontrollera djur varje 8-12 timmar för första 72 timmar, vägning och övervakning beteende. Kontrollera att djuren är aktiva och rörliga under natten. Våt mat i form av mark Chow blandas med vatten eller närings geler, chow pellets, och dricksvatten bör tillhandahållas på marknivå. Ytterligare hydrering av subkutana eller intraperiotoneal injektioner bör ges vid behov.
  5. Administrera 5 mg / kg mus ketoprofen och 0,2 mg / kg mus dexametason subkutant vid 24 och 48 h tidpunkterna, postoperativt. Dessutom bör 0,005-0,010 mg / 100 g mus administreras var 8 tim subkutant under 72 timmar.

7. In vivo Imaging

  1. Bedöva en mus under5% isofluran / syre i en induktionskammare tills andning saktar till cirka 1 andetag / sek.
  2. Överför musen till den anpassade stereotax (Figur 1D) med återkoppling kontrollerad värmedyna och sätt rektal termometer. Minska isofluran till 2%.
  3. Administrera glykopyrrolat 0,05 mg / 100 g mus intramuskulärt i bakbenen med hjälp av 29-30 G nålar och 3/10 cc spruta, vilket ger cirka 50% av injektionsvolymen per lem.
  4. Administrera 1 ml / 100 g mus 5% glukos (för vätske) subkutant i saltlösning gång per timme.
  5. Sätt de gängade kammarhållarna i befattningshavare som används för kirurgi (figur 1F). Justera höjden och vrida stolparna på ställskruvarna i topplattan.
  6. Med båda innehavare bifogas, höja hållarna i befattningshavare tills bröstet kan fritt expandera vid inspiration.
    OBS: Både företaget fastsättning av innehavarna och fri expansion av bröst significantly bort artefakterna på grund av andning.
  7. Utför avbildning som önskat.
  8. När bildbehandling är klar, lägre inlägg, skruva av kammarhållare, ta bort rektal termometer och plats musen på en uppvärmd yta för att återhämta sig. Skicka inte tillbaka musen till företaget av andra djur tills den har återhämtat sig helt.

Representative Results

Genom att följa proceduren ovan, bör varje skede av operationen härma resultaten för varje steg i operationen beskrivs i figur 2. Särskild försiktighet måste iakttas vid tillämpningen silikonelastomeren att eliminera luftbubblor under glas eller åtminstone se till att de är belägen vid periferin av området av intresse (fig 2L). För en erfaren kirurg, kirurgiska komplikationer som kräver dödshjälp antingen under operation eller inom de första 24 tim postsurgery förekommer hos cirka 20% av verksamheten. Dessa komplikationer uppstår oftast från alltför mjuk vävnad blödning eller underlåtenhet att säkert fästa kammaren med ryggraden.

I framgångsrikt implanterade kamrar, förblir fönstret normalt optiskt transparent för flera veckor (Figur 3). Trots ansträngningar, bildar en ogenomskinlig, fibrösa, neoplastisk tillväxt ofta inom några dagar, vilket resulterar i partiell obscuring av fönstret (Figur 3C - F, svart streckad linje). Fluorescerande strukturer är svåra att se med hjälp av 2PEF mikroskopi under denna fibrös vävnad. Vi hittar en bimodal fördelning av resultat, med ca 50% av framgångsrikt implanterade fönster återstående klart mer än 5 veckor efter operationen, och ca 50% blir förvrängd inom 1 - 3 veckor. För fönster som förblir tydliga, de flesta platser inom siktfönstret upplevelse endast en blygsam grad av kärlnybildning i eller ovanför dura (Figur 3D - F, grön asterisker), vilket inte hindrar 2PEF avbildning. Vår tidigare studie 30 visade en ökning av mikroglia men inte astrocyternas tätheten under fönstret och intilliggande kotor, vilket indikerar mild inflammation analog med den som ses i skallfönster preparat 5.

I transgena möss som uttrycker gula fluorescerande protein (YFP) i en delmängd av dorsala Ganglia (DRG) neuroner (YFPH linje; Jackson Labs), axoner var tydligt urskiljbar i veckor postoperativt (Figur 4A och B) och så länge som fyra månader i ett djur (data ej visade). Blodkärl (Figur 4A och B) gjordes synliga genom retroorbitalt injicera fluorescerande Texas Red märkt dextran i blodplasma. Mikroglia också visualiseras i möss som uttrycker GFP i ett CX3CR1 knock-in mus (CX3CR1-GFP, Jackson Labs) korsade till YFPH linjen (Figur 4C). Kontrast och upplösning försämrats måttligt över tiden (Figur 4C) på grund av bildningen av en fibrös överväxt beskrivits tidigare 30. Vi rutinmässigt avbildas under 3 timmar i en enda session utan dödlighet och så ofta som var 12 timmar. Session varaktighet och frekvens begränsas av toleransen av djuret för narkosinduktion, samtidigt med de etiska överväganden som åtföljer smärta och lidande för försöksdjur.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 1
Figur1. En anpassad kirurgisk svit underlättar kammar leverans under implantation och stabiliserar kammaren under efterföljande avbildning sessioner. Två sidostänger och en toppskiva (A) sätts samman (B) med hjälp av små skruvar i spinalkammaren (C). En operationsbordet med utdrag inlägg (D) möjliggör leverans och fastspänning av sidostänger till kotorna använder hållar stift (E). Efterföljande avbildning sessioner istället använda invändigt gängade inlägg att fästa till kammaren via fästskruvarna på vingar implantatet (F). Panel B av denna siffra har modifierats Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 med tillstånd från Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. En dorsal laminektomi utförs och en kronisk avbildning kammare implanteras för att ge optisk access till ryggmärgen. Förfarandet beskrivs i montage. Först huden (panelerna A, B, protokoll sektioner 3,1-3,4) och muskler (C, 3.5) dras tillbaka för att exponera tre underliggande kotor. Den vävnad som ligger över dessa tre kotor avlägsnas (D, E, F; 3,6-3,10) och de laterala processer skrapas rena innan de är fastklämda på båda sidor (G, H; 3,12). Försiktigt, är borttagna rygg lamina av centralkota och kanter benet förseglade (I (J, 5,1) och skruvar fast i läge (K; 5,3) för att säkra kammaren före försegling kammaren med silikonelastomeren och täckglas (L; 5,5). Efter leveransstiften avlägsnas (M; 5,8), huden limmad till sidorna av kammaren (M, N; 5,8) och ställskruvarna förs in i vingarna (O; 5,9). Slutligen skruv slots tätas med dentala akryl (P; 5,10). Och musen placeras i en ren bur att återhämta Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3

Figur 3. En kronisk spinal kammare förblir optiskt transparent over flera veckor. Vitt ljus bilder av ryggmärgen, allt från flera minuter (A) till tre veckor efter operationen (F). Kärllandmärken kan identifieras vid alla tidpunkter (gula pilar). Liten förändring ses vid en dag postsurgery (B). Tät fiber överväxt (C - F, som begränsas av streckad linje på nedre högra) är närvarande så tidigt som tre dagar och resulterar i partiell mörkläggning av bildområdet. Mild kärlnybildning (D, E, F, gröna asterisker) är också närvarande, men inte skymma den ursprungliga kärl i vitt ljus eller 2PEF avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4

Figur 4. En kronisk rygg kammare medger upprepad multifotonavbildning utan behov av upprepade operationer. Upprepad avbildning av transgena möss som uttrycker YFP i en delmängd av DRG axoner (gröna) i de dorsala Funiculi hos ryggrads sladd och kärl (röd) märkt med intravaskulär färgämne injektion (A, B). Aktiviteten hos mikroglia (violett) kan också spåras över tiden i Thy1-YFP / CX3CR1-GFP dubbel transgena möss (C). Medan axoner och mikroglia förblir synliga, kontrast och upplösning nedgång måttligt över tiden (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Tekniken demonstreras här tillåter upprepad, Time-lapse, in vivo imaging av ryggens musen SC ut till många veckor efter operativt utan behov av efterföljande kirurgiska ingrepp. Detta förfarande innebär en avsevärd förbättring jämfört med upprepad kirurgi imaging studier eller över portmortem histologiska metoder, där information om cellulära dynamik är förlorad. Vi har tidigare 30 visade värdet av denna teknik för att studera SCI patologi in vivo.

Den maximala längsgående utsträckningen av avbildning bestämdes genom tillväxten av en tät, fibrös vävnad över den dorsala ytan av SC. Med tiden ledde denna tillväxt i förlust av bildens kontrast och upplösning. Denna tillväxt har också setts i alternativa kirurgiska preparat 31. Anekdotiskt, har vi observerat att denna tillväxt kan minimeras genom att försiktigt tvätta ryggens SC ytan för att avlägsna blodprodukter, försegling ytaden skurna ben med cyanoakrylat, tätningskanter kammaren väl med silikonelastomer, och minimera det interstitiella utrymmet mellan den dorsala SC och täckglaset.

Nyligen har en annan metod som liknar vår egen med hjälp av en polykarbonatkammare visats 32. Användningen av polykarbonat är fördelaktigt eftersom det är kompatibelt med röntgen och akustiska avbildningsmodaliteter, vilket inte är fallet för våra delar av rostfritt stål. Men med det nu allestädes närvarande tekniken för 3D-skrivare, kammardelar kan tillverkas av en mängd olika material för att passa specifika behov. Vi har nyligen skrivit ut alla våra delar i en klar fotopolymer.

En viktig nackdel med en sluten kammare är oförmågan att administrera upprepade doser av läkemedel eller exogena färgämnen lämpliga för SC avbildning 34. Men genom att utnyttja den mekaniska stabiliteten i vårt nuvarande system, vi har redan använt vår nuvarande kammare till framgångsrikly förankra en intratekal kateter som är ansluten till en subkutant implanterad injektionsöppning, som tillåtet för läkemedelsavgivning vid flera tidpunkter och med i en sluten kammare system (opublicerat arbete). Vidare, beroende på den modulära naturen hos den övre plattan, kommer framtida versioner av denna beredning innefattar en återförslutningsbar kammare för att möjliggöra upprepad tillämpning av båda terapeutiska medel och fluorescerande markörer. Det är också möjligt att föreställa bästa plattor med fästen för inspelning elektroder, optiska skär och portar för läkemedelstillförsel. Sådana tillägg skulle sannolikt bli mer utmanande att genomföra med hjälp av mer minimalistiska system Fenrich et al. 31. Sammanfattningsvis ger vår kammare en gateway plattform på vilken olika experiment kan baseras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc. Fine Science Tools multiple 
retractor kit -magnetic fixator Fine Science Tools 18200-02
retractor kit -retractor Fine Science Tools 18200-09 other retractors may also be used
retractor kit -elastomer Fine Science Tools 18200-07
feedback controlled heating blanket CWE Inc. Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue Loctite Loctite 495 multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) Teets Mfg. Part: 8101 multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) Teets Mfg. Part: 8501 multiple suppliers
Glycopyrrolate MWI Veterinary Supply MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Bupivacaine MWI Veterinary Supply MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen MWI Veterinary Supply MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone MWI Veterinary Supply MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer World Precision Inc. KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips World Precision Inc. KWIKMIX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910 (2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227 (2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081 (2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Tags

Neurovetenskap ryggmärg, multifoton mikroskopi djurkirurgi fluorescensmikroskopi biomedicinsk optik
Ett förfarande för att implantera en Spinal avdelningen för Längs<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Mouse Spinal Cord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A… More

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (94), e52196, doi:10.3791/52196 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter