Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Introduction

Perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring is een immunohistochemische techniek die algemeen wordt gebruikt in de spieren onderzoek en diagnostiek. Het wordt ook gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel op bloedmonsters. De techniek werkt door het aanbrengen van periodieke zuuroplossing aan het monster, welke eenheden oxideert in het polysaccharide maken aldehydegroepen die reageren met de kleurloze Schiff reagens waardoor een diep magenta product produceren. De stappen van deze werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De vlek wordt alles met magenta polysacchariden, zoals glycogeen, glycoproteïnen, glycolipiden, mucinen of andere moleculen met polysaccharide eenheden.

PAS kleuring wordt vaak gebruikt om glycogeen niveaus spiervezels meten. Spieren coupes zijn ideaal voor de techniek als ze stevig aan de glijbaan en bestand tegen meerdere stappen wassen en vlekken. Glycogeen is het meest aanwezig in fast twitch type II spiervezels, die een grote vraag hebbenvoor snelle ATP productie vereisen glycogeen voor maximale prestaties ^1,2. Glycogeen is een vertakt polymeer van glucose dat in het vrije glucose kan worden gebroken door de werking van glycogeen fosforylase enzymen. In tijden van rust en voedingswaarde-genoegzaamheid, wordt glycogeen aangevuld door het proces van glycogenese, terwijl in tijden van nutritionele insufficiëntie of hoge-energie-vraag; glycogeen wordt afgebroken tot glucose door glycogenolyse. Al sinds 1950 clinicus wetenschappers ontdekt PAS-kleuring op bloedmonsters glycogeengehalte in verschillende ziekten ^3-7 analyseren. Bijvoorbeeld, in Pompe ziekte een bonafide glycogeen opslag ziekte-witte bloedcellen accumuleren grote hoeveelheden glycogeen die aanzienlijk verschilt van gezonde controles ^8.

Dit video-artikel wordt een aangepaste versie van PAS kleuring voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters uit veneus bloed van gezonde vrijwilligers. PBMCs bevatten meestal lymfocyten van T lymfocyten en B-lymfocyten families, evenals andere immuuncellen zoals natuurlijke killer-cellen en monocyten. De eerste zuiveringsstap verwijdert erytrocyten, neutrofielen en andere granulocyten. Deze techniek verschaft gegevens over een geconcentreerde hoeveelheid lymfocyten waardoor robuustere opsomming van PAS-positieve cellen in vergelijking met volbloed uitstrijkjes.

Figuur 1:. Stapsgewijze methode PAS kleuring van PBMC (A) Ten eerste wordt isolatie van PBMC bereikt door Ficoll, het linkerpaneel toont de bereiding vóór centrifugatie, het rechter paneel toont het na centrifugeren waarbij de bufferlaag die de PBMC waargenomen in het midden van de buis. (B) Geïsoleerde PBMC worden bevestigd op de slede met formaline-ethanol fixeermiddel oplostie. De slede wordt voorzichtig gespoeld met gedestilleerd water uit een plastic wasfles. (C) Het objectglaasje wordt vervolgens in een 100 ml bekerglas halverwege gevuld met amylase oplossing die glycogeen zal oplossen. De slede wordt voorzichtig gespoeld. (D) De schuif wordt met periodieke zuuroplossing, waarbij oxidatie van sachariden plaatsvindt. Dia's worden voorzichtig gespoeld; Dit zal de overmaat perjoodzuur verwijderen en stop de oxidatiestap. (E) Wanneer de Schiffs reagens wordt toegevoegd aan de dia, zal het reageren met aldehyden die tijdens de oxidatiestap. Deze kleurloze reagens resulteert dan in een donkerrode magenta product. Dia's worden voorzichtig gespoeld om het overtollige Schiff reagens te verwijderen.

Protocol

Onderzoek met menselijke bloedmonsters werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaat nummer 10000618. Het werk op de muis spier werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaatnummer 2010BERG.

1. PBMC Isolatie van volbloed

OPMERKING: Voer deze procedure in een bioveiligheid kast met behulp van steriele techniek en-fabrikant gesteriliseerde apparatuur.

1. Giet 10-15 ml volbloed uit het gehepariniseerde (anti-coagulant) bloedafnamebuisjes in een 50 ml steriele conische buis. Voor kleine bloed morst, veeg met DDH ₂ O en 70% EtOH behulp reiniging weefsel.
2. Verdun het bloed in de conische buis een 1: 1 verhouding met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS 1x) pH 7,4. Zorg ervoor dat de maximale totale volume niet meer dan 30 ml.
3. Meng voorzichtig met behulp van een serologische pipet pistool vermijden bubbels.
   OPMERKING: Niet mengen door het buisje om bloed een te vermijdenccumulation in de dop en de daaropvolgende kwel tijdens het centrifugeren.
4. Voeg 13 ml Ficoll-Paque (zie materialen en apparatuur tabel), om een nieuwe 50 ml conische buis. Houd de tube rechtop in het rek.
5. Met behulp van een transferpipet, neem verdunde bloed, raakt de transferpipet tip om de binnenwand van de buis in de buurt van de top. Met langzame en constante druk, dragen het bloed langs de binnenwand van de buis die een bloed laag bovenop de sucrose laag. Doe deze stap een paar keer tot alle bloed is overgedragen.
6. Sluit het buisje stevig en centrifugeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 min bij 700 xg in een schommel rotor met gemiddelde versnelling ingesteld op 5, en vertraging op nul gezet.
7. Neemt langzaam uit de buis en zonder verstoring van de lagen, neem het terug naar de bioveiligheid kast.
8. Verzamel zorgvuldig de buffycoat (dunne troebel witte laag), waar de PBMC's worden gevestigd, geplaatst tussen de PBS / plasma eennd ficoll lagen met behulp van een pipet overdracht. Vermijd het verzamelen van sucrose laag en niet de rode bloedcellen laag niet verstoren.
9. Breng de buffy coat in een nieuwe 50 ml steriele conische buis. Het kan verscheidene malen herhalen van stap 1.8 alle PBMC is verzameld.
10. Voeg PBS pH 7,4 op de buis met de PBMC en vul tot de 45 ml markering. Schud de buis grondig. Doe niet vortex.
11. Was 1: Centrifugeer gedurende 15 min bij 480 xg zowel maximale versnelling en vertraging ingesteld op 9. Let vorming van een pellet van PBMC op de bodem van de conische buis.
12. Verwijder het PBS (supernatant) in een plastic bekerglas met 10 ml bleekwater.
13. Draai cel pellet door voorzichtig "rekken" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex.
14. Voeg 25 ml verse PBS pH 7,4 tot de buis. Indien meer dan één buis wordt verwerkt, zwembad de pellets samen in deze stap.
15. Was 2: Centrifuge de buis gedurende 12 min bij 480 xg with zowel maximale versnelling en vertraging op 9 gezet.
16. Gooi het PBS (supernatant) in de plastic beker met een scheutje bleekmiddel.
17. Zachtjes "rack" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex.
18. Voeg 25 ml vers PBS aan de buis.
    1. Neem 50 pi van de cellen en overbrengen naar een microcentrifugebuis levensvatbaarheid tellen.
    2. Voeg een gelijke hoeveelheid (50 pl) van trypaanblauw (a levensvatbaarheid vlek) en pipet op en neer om voorzichtig te mengen.
19. Neem 10 pi en overbrengen naar een hemocytometer om de levensvatbaarheid van cellen per ml controleren. Noteer het aantal cellen / ml.
20. Neem de gewenste hoeveelheid cellen en centrifugeer de buis gedurende 12 min bij 480 xg zowel maximale acceleratie en deceleratie op 9 gezet.
21. Gooi het PBS (supernatant) in de beker met bleekmiddel.
22. Zachtjes "rack" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Voeg 80 ul PBS in de buis.

2. Het maken van de PBMC Slide

1. Plaats 80 gl van de cellen op een objectglaasje. Smeer de druppel met behulp van een slede of plaats 2 druppels van 40 pi elk aan beide uiteinden van de schuif.
2. Verlaat dia in de biologische veiligheidskabinet te drogen. Label de dia met een potlood op de berijpte kant.

3. Vaststelling van de monsters op de dia

1. Bereid de fixerende oplossing door het mengen van 0,5 ml 37% formaldehyde en 4,5 ml 99% ethanol.
2. Na de dia's worden gedroogd, neem 2 ml van de vers gemaakte fixeeroplossing en giet het op de dia, zodat het gehele oppervlak van de dia wordt gedekt.
3. Laat de oplossing op de glijbaan voor 1 min. Spoel de glijbaan voor 1 min met water uit de kraan en laat het aan de lucht drogen.

4. Het maken van de amylase Oplossing voor Negatieve controle

1. Neem 0,25 g amylase poeder en los op in 50 ml diverstilde water. Giet de oplossing in een schoon bekerglas van 100 ml.
2. Dompel de dia in het bekerglas dat de helft van de schuif ontvangt de behandeling en de andere helft onbehandeld blijft en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 1C).
3. Maak een notitie aan welke kant van de glijbaan is het ontvangen van de amylase behandeling. Teken een lijn op de achterkant van de slede waarin de grens tussen de behandelde en controlegroepen.
4. Was de dia's met DDH ₂ O om de amylase oplossing te verwijderen en laat de dia aan de lucht drogen.

5. Voer perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring en Imaging

LET OP: PAS reagentia zijn giftig bij inademing en zijn corrosief, dus de stappen die moeten worden gedaan in een zuurkast, en de afvalstoffen moet goed worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.

1. Plaats de dia op een vlakke ondergrond en giet 1,50-2,00 ml perjoodzuur Solution op het monster. Incubate gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. De dia's te spoelen in een aantal beschuldigingen van gedestilleerd water.
3. Giet 1,50-2,00 ml Schiffs reagens op de glijbaan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
4. Was de dia met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en laat het aan de lucht drogen.
5. Solliciteer 10 ul montage media op de dia en dek af met twee kleine dekglaasjes, of toe te passen 50 ui en gebruik een groot dekglaasje.
6. Gelden duidelijke nagellak op de randen van het dekglaasje, laat een nacht drogen.

6. Zorg voor afbeeldingen met de Verrekijker microscoop met de 100X Doelstelling

Representative Results

De reagentia en basistechniek valideren, werd PAS-kleuring uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant op muis soleus spier secties. De kleuring werd uitgevoerd op dezelfde dag als het offer en in de laatste stap van de kleuring werden de coupes vastgesteld door xyleen. De soleus spier is bekend dat 35% glycogeen-positieve cellen bevatten ⁹ ~. De gekleurde spiercellen weergegeven twee verschillende PAS-positieve functies-punctata korrels in de cel, en een doorlopende lijn markeren van de celmembraan (Figuur 2A). De aanwezigheid van punctata granules is met glycogeen, en werd gebruikt om een ​​positieve spiercel definiëren. Behandeling van de monsters met amylase verwijderde de punctate korrels die in overeenstemming is met hen wordt glycogeen (Figuur 2B).

Figuur 2: PAS- gebrandschilderde muizenspier secties werden geanalyseerd met een lichtmicroscoop. Muis soleus spier secties werden gekleurd met PAS. Sommige monsters werden voorbehandeld met amylase. (A) PAS-positieve deeltjes waren zichtbaar in spiercellen. (B) minder PAS positieve cellen waargenomen wanneer de spier coupes werden voorbehandeld met amylase. De vlekken rond de celmembraan bleef na amylase behandeling (schaal bar = 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het membraan-kleuring signaal bleef ook na amylase behandeling. Zoals verwacht was het percentage PAS-positieve cellen in de niet-amylase sectie spier was 37%, terwijl amylase behandeld spier secties hadden significant minder, ongeveer 5% PAS-positieve cellen (figuur 3).

">
Figuur 3: Kwantificering van PAS-positieve spiercellen Het aantal spiercellen werden PAS positief werd geteld vanaf een representatieve dia zonder of met amylase voorbehandeling.. Zoals verwacht, 37% spiercellen waren positief voor glycogeen. Amylase behandeling de PAS-signaal aanzienlijk verlaagd tot 4% (* p <0,001).

Vervolgens werd PAS-kleuring uitgevoerd op PBMC van veneus bloed van gezonde vrijwilligers met een aangepaste techniek, zoals beschreven in de sectie protocol en in figuur 1. De PBMC gehecht goed als de wasstappen werden zorgvuldig uitgevoerd. De PAS-gekleurd PBMCs weergegeven diverse kleurpatronen. Kleine cellen (5 urn) met granules werden gemakkelijk waargenomen. Een deel van grotere cellen met een diffuse kleurpatroon werd ook waargenomen (Figuur 4A en bijvoegsel A.1-6 (Figuur 4B).

Figuur 4:. Periodic zuur-Schiff (PAS) kleuring op humane PBMC (A) PAS-kleuring van PBMC werd uitgevoerd. Twee typen cellen waargenomen. (A.1-6) kleinere cellen (5 pm) in niet-behandelde slides amylase toonde magenta deeltjes overeenstemming met glycogeen. Deze cellen kunnen worden rustende cellen. Grotere cellen (meer dan 5 pm) in niet-amylase behandelde cellen had diffuse PAS-positieve kleuring. Deze cellen kunnen worden geactiveerd lymfocyten. (B) PBMCs werden behandeld met amylase gedurende 15 min voor kleuring, waarbij de PAS signaal verminderd. Vertegenwoordiger van zeven verschillende gezonde proefpersonen. (C) Het PAS en hematoxylin vlekken gedaan op volbloed dia. De pijl geeft een PBMC omringd door vele erytrocyten (schaal bar = 10 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het percentage dat PAS positieve was was 98% voor de kleinere cellen en 40% voor de grotere cellen. Amylase behandeling verdween de PAS signaal in de kleine cellen (p <0,001) en verminderde significant de PAS-signaal in de grotere cellen tot 7% (Figuur 5).

Figuur 5: Kwantificering van PAS-positieve PBMC Het aandeel van PBMC die waren PAS positief werd geteld vanaf een representatieve dia zonder of met amylase voorbehandeling.. 98% van de kleine cellen waren positief voor PAS. 40% van de grotere cellen pOSITIEVE voor PAS. Amylase behandeling verdween de PAS signaal in de kleine cellen (p <0,001) en verminderde significant de PAS-signaal in de grotere cellen tot 7% ​​(p <0,001).

Om te bevestigen dat PBMC bezitten glycogeen een tweede onafhankelijke werkwijze die ook voorziet kwantificering van de hoeveelheid glycogeen werd ^10,11 en is eerder gepubliceerd in Jupiter op andere celtypes ^12. PBMC werden gelyseerd in hypotone buffer en glycogeen werd afgescheiden zoals beschreven kort bijschrift van figuur 6.

Figuur 6: Meting van glycogeen middels enzymatische digestie met hydrolyse enzymen. Glycogeen werd gemeten volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, het protocol houdt hypotone lysis van 1 x 10 ⁶ PBMCs, gevolgd door pelleteren van onoplosbare materiaaldat bevat glycogeen. De pellet werd gewassen en gedigereerd met hydrolyse enzymen waarbij glucose die werd gemeten met spectrofotometrie en vergeleken met een standaard curve. Het cellysaat werd verdund bij de aangegeven verhoudingen met hydrolyse buffer. Gegevens zijn representatief voor drie experimenten. Significante niveaus van glycogeen werden gedetecteerd in de 1: 1 verdunning (p = 0,02) en dit signaal getitreerd als het lysaat werd verder verdund.

De onoplosbare glycogeen werd verscheidene malen gewassen en vervolgens gedigereerd met hydrolyse enzymen. De hoeveelheid glucose verkregen van digestie werd gemeten met spectrofotometrie en vergeleken met een standaard curve. Een miljoen PBMC was 1,19 pg glycogeen. Het glycogeen signaal getitreerd als de cel lysaat werd verder verdund (figuur 6).

Discussion

De kritische stappen van deze video artikel waren tijdens het wassen en amylase behandeling van de cellen. Terwijl het wassen van de dia's, werd de belangrijkste stap met behulp van een plastic samendrukbare wassen fles en het water te laten zachtjes lopen door het monster op de dia en niet direct gericht op de monsters. Zelfs de geringste directe waterdruk zou ertoe leiden dat de cellen af ​​te komen van de glijbaan. Een andere belangrijke stap was dezelfde dia gebruiken ± amylase omstandigheden. Nadat de PBMC gehandeld op grond van de glijbaan, werd de dia voorzichtig geplaatst in een beker, zodat slechts de helft van het uitstrijkje werd blootgesteld aan de amylase oplossing. Deze stap biedt een robuuste controle omdat de bloedcellen zijn van dezelfde dia, dus het minimaliseren van verstorende variabelen die kunnen optreden als gevolg van een lichte timing variaties. De cellen goed geplakt met geen behandeling, zodat de extra kosten en tijd die met poly-L-lysine of polyethyleenglycol coating zou bijvoorbeeld niet gerechtvaardigd.

Door trde optimale activiteit van amylase oubleshooting bepaald. Voor spier secties, werd vastgesteld dat de optimale activiteit van amylase werd waargenomen binnen 1 uur incubatie. Op langere tijden de spier secties zou langzaam loskomen van de glijbaan, terwijl op kortere tijden amylase heeft de PAS-signaal niet adequaat te verwijderen. De timing voor de amylase incuberen PBMC slides moest opzichte van de spier-bemonsteringstijdgeving (die 1 uur) tot slechts 15 minuten te verminderen. Langere tijden veroorzaakt PBMCs al aan de glijbaan, terwijl kortere tijden niet effectief invloed op de PAS-signaal. Een wijziging van het standaardprotocol van PAS kleuring werd de werkwijze van wassen van de glaasjes veranderen. Instructies van de fabrikant aangegeven om de dia's te wassen met stromend water uit de kraan, die de oorzaak van de cellen af ​​te komen van de dia's. De modificatie was de dia wassen met indrukbare wasfles om de cellen te behouden. Zoals beschreven in de stappen sectie kritische, was het erg belangrijk om niet om direct te solliciteren waterdruk op de cellen.

Er zijn enkele beperkingen in deze techniek. De spiercellen membraan werd gekleurd met punctata korrels in het cytoplasma van de spiercel. De granules werden verwijderd door amylase behandeling en daarom waarschijnlijk glycogeen, terwijl het membraan kleuring was ongevoelig voor amylase. De identiteit van de PAS-positieve deeltjes op het celmembraan is niet bekend. Het zou de spier kelder (perimysium) membraan zijn. Dit membraan omgeeft de spier bundels en door zijn hoge gehalte glycoproteïne is bekend PAS-positief. Een andere beperking van PAS kleuring dat glycogeen granules moet ten minste 50 nm in diameter zichtbaar conventionele lichtmicroscopie zijn. Zo kunnen kleinere glycogeen korrels aanwezig is in een cel, maar nog inschrijven negatief op een PAS-test. De tweede methode overwint deze beperking door detectie van glycogeen in een lysaat. In combinatie met een standaard curve kan dit worden gebruikt om Determine het exacte bedrag van glycogeen. Hoewel deze techniek zeer kwantificeerbaar is niet beperkt door de grootte van de korrels heeft het zelf bepaalde beperkingen. Glycogeen korrels zijn complexe vertakte structuren met vele accessoire eiwitten en chemische cross-links, waardoor het onwaarschijnlijk is dat hydrolyse enzymen een hele glycogeen molecuul ¹³ volledig te ontbinden. Zo is de enzymatische-detectie (zoals de PAS-techniek) mag onder-vertegenwoordigen de werkelijke bedrag van glycogeen in een monster. Een manier om deze beperking te behandelen is met elektronenmicroscopie waarmee zelfs de kleinste glycogeen korrels ¹⁴ oplost. Men zou een combinatie van deze technieken, PAS-kleuring, enzymatische digestie en elektronenmicroscopie gebruiken voor de meest uitgebreide karakterisering van glycogeen.

Dit artikel en video toont perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring techniek aangepast voor gebruik van PBMC. Het belang van deze studie is te zien in de keuze van het gebruikPBMCs dan bloeduitstrijkje, waardoor het meer haalbaar is om lymfocyten op te sommen. Aanvankelijk werd een klassieke bloed uitstrijkjes techniek getest, maar de meerderheid van cellen op het glaasje werden rode bloedcellen en mogelijk neutrofielen (figuur 4C). Om de lymfocyten te concentreren, werden PBMC's gezuiverd uit bloed middels standaard dichtheidsgradiënt techniek. Met behulp van een techniek die vergelijkbaar bloed-uitstrijkje, de PBMC gemakkelijk gehecht gedurende de duur van het PAS procedure, die vele krachtige wasstappen heeft. De PAS techniek is gebruikt voor decennia om glycogeen niveaus in spierweefsel biopsieën, die in dunne secties en gehecht aan dia bepalen. PAS kleuring werd gekozen boven andere koolhydraten kleuring chemicaliën vanwege zijn hoge betrouwbaarheid en de aanwezigheid van de verwachte resultaten in de literatuur. Een muis (Mus spretus) spier secties werd gebruikt als een positieve controle en gevonden, zoals verwacht, dat 37% van de cellen werden PAS-positieve ^9. In termen van kosten en tijd, het voorbereiden van PBMC is zwaarder dan een bloeduitstrijkje, maar er zijn een aantal voordelen. Ten eerste, de bereiding is verrijkt in lymfocyten, waarbij de cellen van belang voor projecten waarbij het gaat autoimmuniteit zijn. Als er bloed uitstrijkjes werden gebruikt, zou lymfocyten de minderheid zijn, waardoor het een uitdaging om de cel van belang te vinden. Men zou moeten voorbereiden en veel meer dia's te analyseren om dezelfde nummers die u zou krijgen met een paar PBMC glijbanen krijgen. Onderzoekers zeer geïnteresseerd in het gebruik van onze nieuwe, geoptimaliseerde techniek in de auto-immuniteit projecten in verband met type 1 diabetes, multiple sclerose, lupus, reumatoïde artritis, enz. Waar de T- en B-lymfocyten en NK-cellen spelen een rol zou zijn. Natuurlijk, voor andere toepassingen waar erytrocyten of neutrofielen zijn van het belang van de bloedvlek zou worden aanbevolen. Het andere voordeel is dat de PBMC's kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van humane lymfocyten in vitro biologie.

Een lopend onderzoek is het onderzoek naar de bron van glycogeen in PBMCs. Ikn de toekomst is het de bedoeling om glycogeen gehalte in het kader van multiple sclerose, een T-lymfocyt-gemedieerde auto-immuunziekte die wereldwijd naar schatting 2,3 miljoen mensen treft vanaf 2013 ^15,16 meten. Wat zijn de grote en kleine cellen in de PBMC monsters? Cellen bij 5 pm zijn consistent met de lymfoïde afstamming in hun rusttoestand. T-lymfocyten, B-lymfocyten, natural killer cellen, en andere kleine subgroepen binnen deze omvang. De grotere PBMC's worden waarschijnlijk uit geactiveerde lymfocyten, die groter groeien als ze inflammatoire signalen van het immuunsysteem ontvangen en monocyten van de myeloïde lijn. Geavanceerde celsortering technieken zoals fluorescentie geactiveerde celsortering of magnetische-geactiveerde celsortering moeten verfijning van de deelverzameling die glycogeen uitdrukt.

Hematoxyline teller kleuring werd gebruikt bij de kleuring werd uitgevoerd op volbloed. Dit stelde ons in staat om monocyten van erytrocyten (onderscheidenFiguur 4C). Toen de kleuring werd uitgevoerd op PBMC's, omdat alle cellen mononucleaire was niet nodig vlek tegengaan hematoxyline om cellen te identificeren. Ook hematoxyline werd interfereren met de PAS signaal in de cellen. Samengevat hebben we een PAS-kleuring aangepast voor PBMC aangetoond. Deze techniek is nuttig voor wetenschappers en artsen onderzoeken autoimmuniteit, infectie en allergie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.