Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Introduction

Perjodsäure Schiff (PAS) -Färbung eine immunohistochemische Technik, die weit verbreitet in der Muskel Forschung und Diagnostik eingesetzt wird. Es wird auch als ein diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet. Diese Technik funktioniert, indem Periodsäure-Lösung zu der Probe, die innerhalb der Polysaccharid Schaffung Aldehydgruppen, die mit dem farblosen Schiffs-Reagenz, wodurch eine tiefmagenta Produkt reagieren Einheiten oxidiert. Die Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Fleck macht nichts mit Polysacchariden magenta, einschließlich Glykogen, Glycoproteine, Glycolipide, Mucinen, oder andere Moleküle mit Polysaccharid-Gruppierungen.

PAS-Färbung wird oft verwendet, um Glykogenspiegel in Muskelfasern messen. Muskeln Gewebeschnitte sind für die Technik, wenn sie fest an dem Schieber aushalten mehrere Wasch- und Färbeschritte. Glykogen ist den meisten in schnell kontra vorhanden Typ-II-Muskelfasern, die einen hohen Bedarf habenfür die schnelle Produktion von ATP Glykogen für maximale Leistung ^1,2 erfordern. Glycogen ist ein verzweigtes Polymer von Glucose, die in freie Glucose durch die Wirkung von Glycogenphosphorylase-Enzyme abgebaut werden können. In Zeiten der Ruhe und Nahrungsversorgung, wird Glykogen durch den Prozess der Glykogenese aufgefüllt, während in Zeiten der Mangelernährung oder Hochenergiebedarf; Glykogen in Glukose durch Glykogenolyse gebrochen. Bereits ab den 1950er Jahren Kliniker Wissenschaftler haben erforscht PAS-Färbung auf Blutproben Glykogengehalt bei verschiedenen Erkrankungen ^3-7 analysieren. Zum Beispiel bei Morbus Pompe-einer bonafide Glykogenspeicher krankheits- weißen Blutkörperchen sammeln sich große Mengen an Glykogen, die wesentlich von gesunden Kontrollen ⁸ unterscheidet.

Dieses Video-Artikel beschreibt eine angepasste Version von PAS-Färbung für den Einsatz in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) Proben von venösem Blut von gesunden Probanden. PBMCs enthalten hauptsächlich Lymphozyten T-Lymphozyten und B-Lymphozyten-Familien, wie auch andere Immunzellen, wie NK-Zellen und Monozyten. Der erste Reinigungsschritt entfernt Erythrozyten, Neutrophilen, Granulozyten und andere. Diese Technik liefert Daten zu einer konzentrierten Anteil der Lymphozyten sich die Robustheit Aufzählung von PAS-positiven Zellen im Vergleich zur Verwendung von Vollblutabstrichen.

Abb. 1: Schritt für Schritt Methodik der PAS-Färbung auf PBMC (A) Zunächst wird Isolierung von PBMC durch Ficoll Gradienten erreicht, zeigt der linken Seite die Vorbereitung vor dem Zentrifugieren, zeigt sie nach der Zentrifugation im rechten Feld, wo die Speckhaut, die den PBMC ist in der Mitte des Rohres beobachtet. (B) Isolierte PBMC werden auf den Objektträger unter Verwendung von Formalin-ethanol Fixierungslösungen festtion. Der Schieber wird sanft mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche gespült. (C) Der Objektträger wird dann in einem 100 ml-Becherglas zur Hälfte mit Amylase-Lösung gefüllt, die Glykogen auflöst platziert. Der Objektträger wird vorsichtig gespült. (D) Der Objektträger wird mit Perjodsäure-Lösung, wobei die Oxidation von Sacchariden erfolgt behandelt. Die Objektträger werden schonend gespült; Dies wird das überschüssige Periodsäure zu entfernen und Beenden des Oxidationsschrittes. (E) Wenn der Schiff'schen Reagenz auf den Objektträgern zu, wird es mit Aldehyden während der Oxidationsstufe erstellt reagieren. Dieser farblose Reagenz wird dann in einem tiefrote magenta Produkt führen. Die Objektträger werden schonend gespült, das überschüssige Schiff-Reagenz zu entfernen.

Protocol

Forschung mit menschlichen Blutproben wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 10000618. die Arbeit an dem Maus-Muskel wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 2010BERG zugelassen.

1. PBMC Isolierung aus Vollblut

HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang in einer Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik und hersteller sterilisiert Ausrüstung.

1. Gießen Sie 10-15 ml Vollblut aus dem heparinisierten (Antikoagulans) Blutentnahmeröhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Für kleinere Blutverschmutzungen, wischen Sie mit ddH ₂ O und 70% EtOH mit Reinigungstuch.
2. Verdünne das Blut in dem konischen Rohr an einen 1: 1-Verhältnis mit Phosphatpuffer-Saline (PBS 1x), pH 7,4. Stellen Sie sicher, dass die maximale Gesamtmenge ist 30 ml nicht überschreiten.
3. Mischen Sie vorsichtig mit einem serologische Pipettenpistole blasenfrei.
   HINWEIS: durch Umdrehen des Röhrchens, um Blut zu vermeiden eine nicht mischenccumulation in der Kappe und nachfolgende Einsickern während der Zentrifugation.
4. Hinzufügen 13 ml Ficoll-Paque (siehe Materialien und Geräte-Tabelle), in ein neues konisches Rohr 50 ml Kapazität. Halten Sie das Rohr aufrecht im Rack.
5. Mit Hilfe einer Transferpipette, nehmen verdünnte Blut, berühren Sie die Transferpipettenspitze an der Innenwand der Röhre in der Nähe der Spitze. Mit langsamen und stetigen Druck, übertragen das Blut entlang der Innenwand des Rohres bildet eine Blutschicht, die auf der Oberseite des Saccharose-Schicht. Führen Sie diesen Schritt so oft, bis alle Blut übertragen wurde.
6. Das Röhrchen verschließen und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 700 · g in einer Schaukel Rotor mit mittleren Beschleunigungssatz bis 5, und Verzögerung auf Null gesetzt.
7. Langsam nehmen Sie das Rohr und ohne die Schichten zu stören, nehmen Sie es zurück zu der Biosicherheitswerkbank.
8. Die Buffy-Coat (dünne weiße Schicht bedeckt), wobei PBMCs werden, zwischen dem PBS / Plasma ein gelegt sorgfältig sammelnnd ficoll Schichten mit einer Transferpipette. Vermeiden Sammeln Saccharoseschicht und nicht die Schicht roter Blutkörperchen stören.
9. Übertragen Sie die Buffy-Coat in eine neue 50 ml sterilen konischen Rohr. Es kann mehrmals der Wiederholung von Schritt 1.8, alle PBMC sammeln zu nehmen.
10. In PBS pH 7,4 in das Röhrchen mit der PBMC und füllen Sie bis zur 45 ml-Marke. Schütteln Sie Rohr gründlich. Nicht mit dem Vortex.
11. Waschen Sie 1: Zentrifuge für 15 Minuten bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung bis 9 eingestellt Bildung eines Pellets aus PBMCs Beachten Sie am unteren Rand der konischen Rohr.
12. Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in einem Kunststoffbecher mit 10 ml Bleichmittel.
13. Lösen Zellpellet vorsichtig "Abstich" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex.
14. Zugeben von 25 ml frischer PBS pH 7.4 mit dem Rohr. Wenn mehr als ein Rohr bearbeitet wird, bündeln die Pellets zusammen in diesem Schritt.
15. Waschen 2: zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 · g with sowohl maximale Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt.
16. Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Kunststoffbecher mit einem Schuss Bleichmittel.
17. Gently "Rack" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex.
18. Zugeben von 25 ml frischer PBS zu dem Rohr.
    1. Nehmen Sie 50 ul der Zellen und Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Lebensfähigkeit Zahl.
    2. In die gleiche Menge (50 ul) von Trypanblau (a Lebensfähigkeit Färbung) und Pipette auf und ab, um sanft zu mischen.
19. Nehmen Sie 10 ul und überträgt es auf einem Hämocytometer, um die Lebensfähigkeit der Zellen pro ml zu überprüfen. Nehmen die Anzahl der Zellen / ml.
20. Nehmen Sie die gewünschte Menge an Zellen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt.
21. Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Becher mit Bleichmittel.
22. Gently "Rack" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). In 80 ul PBS in die Röhre.

2. Machen Sie die PBMC Slide

1. Platzieren 80 ul der Zellen auf einen Objektträger. Schmieren Sie das Drop mit Hilfe von einer anderen Folie oder stellen Sie 2 Tropfen von 40 ul jeweils an beiden Enden des Schlittens.
2. Lassen Sie Folie in der biologischen Sicherheitswerkbank, um zu trocknen. Beschriften Sie die Folie mit einem Bleistift auf der mattierten Seite.

3. Befestigung der Proben auf den Objektträger

1. Bereiten Sie die Fixierungslösung durch Mischen von 0,5 ml 37% Formaldehyd und 4,5 ml 99% Ethanol.
2. Nachdem die Folien getrocknet sind, nehmen Sie 2 ml der frisch zubereiteten Fixierlösung und gießen Sie sie auf der Folie, so dass die gesamte Oberfläche der Folie bedeckt ist.
3. Verlassen die Lösung auf den Objektträger für 1 min. Spülen Sie den Schieber für 1 Minute mit Leitungswasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.

4. Erstellen Sie die Amylase-Lösung für Negativkontrolle

1. Nehmen 0,25 g Amylase Pulver und in 50 ml Di auflösengestillt Wasser. Füllen Sie die Lösung in einem sauberen 100 ml-Becher.
2. Tauchen Sie die Folie in den Becher, so dass die Hälfte der Folie erhält die Behandlung und die andere Hälfte bleibt unbehandelt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur (Abbildung 1 C) inkubieren.
3. Notieren Sie sich auf der Seite des Schlittens erhält den Amylase-Behandlung. Ziehen Sie eine Linie auf der Rückseite der Folie, die die Grenze zwischen der Behandlung und Kontrolle.
4. Waschen Sie die Objektträger mit ddH ₂ O, um die Amylase-Lösung zu entfernen und die Folie an der Luft trocknen.

5. Führen Sie Periodic Acid Schiff (PAS) Färbung und Imaging

HINWEIS: PAS Reagenzien sind giftig beim Einatmen und korrosiv sind, so dass die Schritte müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden, und die Abfallprodukte müssen fachgerecht gemäß gültiger Richtlinien entsorgt werden.

1. Stellen Sie den Schieber auf eine flache Oberfläche und gießen 1,50-2,00 ml Perjodsäure-Lösung auf die Probe. Incubate für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Spülen Sie die Folien in mehreren Ladungen destilliertem Wasser.
3. Gießen 1,50-2,00 ml Schiffs-Reagenz auf den Objektträger, Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
4. Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser für 5 Minuten und lassen Sie es an der Luft trocknen.
5. Übernehmen 10 ul Eindeckmittel auf dem Objektträger geben und mit zwei kleinen Deckgläser oder gelten 50 ul und Nutzung einer großen Deckglas.
6. Bewerben klaren Nagellack auf den Kanten des Deckglases, lassen Sie über Nacht trocknen.

6. Rufen Sie Bilder mit dem Fernglas Lichtmikroskop Mit dem 100X Ziel

Representative Results

Um die Reagenzien und grundlegende Technik zu validieren, wurde PAS-Färbung nach Angaben des Herstellers auf der Maus Soleusmuskel Abschnitten durchgeführt. Die Färbung wurde am gleichen Tag wie die Opfer gemacht und im letzten Schritt der Färbung wurden die Schnitte mit Xylol fixiert. Der M. soleus ist bekannt, enthalten ~ 35% Glykogen-positiven Zellen ^9. Die gefärbten Muskelzellen angezeigt zwei verschiedene PAS-positiven Features-punktförmige Granulat in der Zelle, und eine durchgehende Linie Demarkieren die Zellmembran (Abbildung 2A). Die Anwesenheit von punktförmigen Körnchen entspricht Glykogenvorräte, und wurde verwendet, um eine positive Muskelzelle definieren. Die Behandlung von Proben mit Amylase entfernte die punktförmige Körnchen, die mit denen Glykogen (2B) ist.

Abbildung 2: PAS- Bunt Maus Muskelschnitte wurden mit Lichtmikroskopie analysiert. Maus Soleusmuskel Schnitte wurden mit PAS angefärbt. Einige Proben wurden mit Amylase vorbehandelt. (A) PAS-positive Partikel wurden Innenseite Muskelzellen sichtbar. (B) Weniger PAS-positive Zellen beobachtet, wenn die Muskelpartien wurden vorbehandelt mit Amylase. Die Färbung auf der Zellmembran blieb nach Amylase-Behandlung (Maßstab = 100 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Die Membran-Färbung Signal blieb auch nach Amylase-Behandlung. Wie erwartet war der Prozentsatz der PAS-positiven Zellen in der nicht-Amylase Muskel Abschnitt betrug 37%, während die Amylase behandelt Muskelabschnitte hatten signifikant weniger, etwa 5% PAS-positiven Zellen (Figur 3).

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Abbildung 3: Quantifizierung der PAS-positive Muskelzellen Der Anteil der Muskelzellen, die PAS positiv wurde von einem Vertreter Rutsche ohne oder mit der Amylase-Vorbehandlung gezählt waren.. Wie erwartet, 37% der Muskelzellen waren positiv für Glykogen. Amylase-Behandlung die PAS-Signal deutlich reduziert auf 4% (* p <0,001).

Als nächstes wurde PAS-Färbung auf PBMC aus venösem Blut von gesunden menschlichen Probanden durchgeführt unter Verwendung einer modifizierten Technik, wie in dem Protokoll beschrieben und in 1 dargestellt. Die PBMC klebt auch wenn die Waschschritte wurden sorgfältig durchgeführt. Die PAS-gefärbten PBMCs angezeigt eine Vielzahl von Färbungsmuster. Kleine Zellen (5 & mgr; m) mit Granulat wurde leicht beobachtet. Ein Anteil von größeren Zellen mit einem diffusen Färbungsmuster wurden ebenfalls beobachtet (4A, eingesetzte A.1-6 (4B).

Abb. 4: Periodsäure-Schiff (PAS) Flecken auf humanen PBMCs (A) PAS-Färbung auf PBMCs durchgeführt wurde. Zwei Arten von Zellen wurden beobachtet. (A.1-6) Kleinere Zellen (5 & mgr; m) in einer Nicht-Amylase behandelte Folien zeigten Magenta-Partikel, die mit Glycogen. Diese Zellen könnten ruhenden Zellen. Grßere Zellen (mehr als 5 & mgr; m) in einer Nicht-Amylase behandelten Zellen hatten diffuse PAS-positive Färbung. Diese Zellen konnten Lymphozyten aktiviert werden. (B) PBMCs wurden mit Amylase für 15 min vor der Färbung, die das PAS-Signal vermindert behandelt. Vertreter der sieben gesunden Probanden. (C) Das PAS und hematoxylin-Färbung an Vollblut Schiebe getan. Der Pfeil zeigt eine PBMC von vielen Erythrozyten (Maßstab = 10 & mgr; m) umgeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Der Anteil, der PAS positive war, betrug 98% für die kleineren Zellen und 40% für die größeren Zellen. Amylase-Behandlung beseitigte die PAS-Signal in den kleinen Zellen (p <0,001) und verminderte den PAS-Signal in den größeren Zellen zu 7% (5) deutlich.

Abbildung 5: Quantifizierung der PAS-positiven PBMC Der Anteil der PBMCs, die PAS positive wurde aus einer repräsentativen Rutsche ohne oder mit der Amylase-Vorbehandlung gezählt waren.. 98% der kleinen Zellen waren positiv für PAS. 40% der größeren Zellen wurden positive für PAS. Amylase-Behandlung beseitigte die PAS-Signal in den kleinen Zellen (p <0,001) und verminderte den PAS-Signal in den größeren Zellen zu 7% (p <0,001) signifikant.

Um zu bestätigen, dass PBMCs besitzen Glykogen ein zweites, unabhängiges Verfahren, das auch die Quantifizierung der Menge an Glycogen wurde ^10,11 verwendet, und wurde vorher in JoVE auf anderen Zelltypen ¹² veröffentlicht. PBMCs wurden in hypotonischem Puffer und Glykogen wurde wie beschrieben kurz Legende zu Abbildung 6 getrennt.

Figur 6: Messung von Glykogen mit enzymatischen Verdau mit Hydrolyse Enzyme. Glycogen wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, bringt das Protokoll hypotonische Lyse von 1 x 10 ⁶ PBMC, gefolgt von Pelletieren von unlöslichem Materialdass Glykogen enthält. Das Pellet wurde gewaschen und mit der Hydrolyse Enzyme wodurch Glucose, die spektrophotometrisch gemessen und mit einer Standardkurve wurde verdaut. Das Zelllysat wurde in den angegebenen Verhältnissen mit der Hydrolyse-Puffer verdünnt. Die Daten sind repräsentativ für drei Experimente. Signifikante Spiegel von Glykogen wurden in 1 detektiert: 1 Verdünnung (p = 0,02), und dieses Signal als Lysat titriert weiter verdünnt wurde.

Der unlösliche Glykogen wurde mehrmals gewaschen und mit Hydrolyse Enzyme dann verdaut. Die Menge an Glucose aus dem Verdau ergab wurde mit Spektrophotometrie gemessen und mit einer Standardkurve. Eine Million PBMCs hatte 1,19 ug Glykogen. Die Glykogen-Signal setzt sich wie Zelllysat titriert wurde weiter verdünnt (Abbildung 6).

Discussion

Die kritischen Schritte dieses Video Artikel waren beim Waschen und Amylase-Behandlung der Zellen. Beim Waschen der Objektträger wurde der entscheidende Schritt mit einem Kunststoff squeezable Waschflasche und ließ das Wasser sanft durch die Probe auf dem Objektträger laufen und nicht direkt mit dem Ziel auf die Proben. Selbst die geringste direkte Wasserdruck würde die Zellen veranlassen, kommen aus der Folie. Ein weiterer wichtiger Schritt war, um dieselbe Folie für ± Amylase Bedingungen. Nachdem die PBMCs mit dem Schlitten haftet, wurde der Objektträger vorsichtig in ein Becherglas gegeben, so dass nur die Hälfte der Abstrich wurde dem Amylase Lösung ausgesetzt platziert. Dieser Schritt stellt eine robuste Steuerung, da die Blutzellen vom gleichen Objektträger, damit Störvariablen, die durch leichte Timing-Schwankungen auftreten können, zu minimieren. Die Zellen auch ohne Behandlung geklebt, so dass die zusätzlichen Kosten und die Zeit mit Poly-L-Lysin oder Polyethylenglycol Beschichtung beispiels beteiligt wäre nicht gewährleistet werden.

Durch troubleshooting die optimale Aktivität der Amylase bestimmt. Zur Muskelschnitte wurde festgestellt, dass die optimale Aktivität der Amylase wurde innerhalb von 1 h Inkubation beobachtet. Bei längeren Zeiten die Muskelpartien langsam schälen würde sich vom Objektträger, während in kürzeren Zeiten Amylase nicht ausreichend die PAS-Signal zu entfernen. Das Timing für die Amylase Inkubation PBMC Folien hatten relativ zum Muskel-Abtastzeitsteuerung, aber nur 15 min (die 1 h war) zu reduzieren. Längere Zeiten verursacht PBMCs zu kommen von der Rutsche, während kürzere Zeiten nicht effektiv die PAS-Signals auswirken. Eine Modifikation des Standardprotokolls von PAS-Färbung wurde die Änderung der Verfahren zum Waschen der Objektträger. Anweisungen des Herstellers angegeben ist, um die Folien mit fließendem Leitungswasser, das die Zellen, kommen aus der Objektträger verursacht waschen. Die Änderung war es, die Objektträger mit squeezable Waschflasche waschen, um die Zellen zu erhalten. Wie in der kritischen Schritte beschrieben, war es sehr wichtig, nicht Wasser direkt anwendenDruck auf die Zellen.

Es gibt einige Einschränkungen in dieser Technik. Der Muskel Zellmembran wurde zusammen mit punctata Granula im Zytoplasma der Muskelzelle gefärbt. Die Körnchen wurden durch Amylase-Behandlung und daher wahrscheinlich Glykogen werden eliminiert, während die Membranfärbung war unempfindlich gegen Amylase. Die Identität der PAS-positiven Partikeln auf der Zellmembran, ist nicht bekannt. Es könnte der Muskel Keller (Perimysium) Membran sein. Diese Membran umgibt die Muskel Faszikel und aufgrund seiner hohen Glykoprotein Gehalt bekannt ist, PAS positiv. Eine weitere Einschränkung ist, daß PAS-Färbung Glykogengranula muß mindestens 50 nm im Durchmesser durch herkömmliche Lichtmikroskopie sichtbar zu sein. So kleineren Glykogengranula in einer Zelle vorhanden sein, aber immer noch registrieren negativ auf PAS-Test. Die zweite Methode verwendet, überwindet diese Einschränkung durch Nachweis von Glykogen in einem Lysat. In Kombination mit einer Standardkurve kann diese verwendet werden, um Dete werdenrmine die genaue Höhe der Glykogen. Obwohl diese Technik sehr quantifizierbare und nicht von der Größe des Granulats beschränkt sind, wird auch selbst eine gewisse Einschränkungen. Glykogengranula sind komplex verzweigten Strukturen mit vielen Hilfsproteine ​​und chemische Querverbindungen, so dass es unwahrscheinlich ist, dass die Hydrolyse Enzyme eine ganze Glykogenmolekül ¹³ vollständig auflösen. Somit ist die enzymatischen-Erkennung (wie das PAS-Technik) kann unter stellen die tatsächliche Menge an Glykogen in einer Probe. Eine Möglichkeit, diese Einschränkung zu umgehen ist mit Elektronenmikroskopie, die selbst kleinste Glykogengranula ¹⁴ löst. Man müsste eine Kombination dieser Techniken, PAS-Färbung, enzymatische Verdauung, und Elektronenmikroskopie für die umfassendste Charakterisierung Glykogen eingesetzt werden.

Dieser Artikel und Video demonstriert die Perjodsäure Schiff (PAS) Färbetechnik für den Einsatz auf PBMCs angepasst. Die Bedeutung dieser Studie ist in der Wahl der Anwendung gesehenPBMCs über Blutausstrichen, die es möglich ist, Lymphozyten aufzuzählen gemacht. Zunächst wurde eine klassische Blutabstrichtechnik getestet, aber die Mehrheit der Zellen auf dem Objektträger wurden rote Blutkörperchen und möglicherweise Neutrophilen (4C). Um die Lymphozyten zu konzentrieren, wurden PBMCs von Blut unter Verwendung von Standard-Dichtegradienten-Verfahren gereinigt. Verwendung einer Technik, ähnlich wie bei einem Blut-Abstrich, die PBMCs ohne weiteres für die Dauer des PAS-Verfahren, das viele kräftige Waschschritten anhaftet. Die PAS-Technik ist seit Jahrzehnten verwendet worden, um Glycogen im Muskel Gewebebiopsien, die in dünne Schnitte geschnitten und auf Objektträger geklebt bestimmen. PAS-Färbung wurde über andere Kohlenhydratfärbung Chemikalien aufgrund ihrer hohen Zuverlässigkeit und die Anwesenheit der erwarteten Ergebnisse in der Literatur ausgewählt. Eine Maus (Mus spretus) Muskelpartien wurde als positive Kontrolle verwendet und festgestellt, wie erwartet, dass 37% der Zellen waren PAS-positive ^9. In Bezug auf die Kosten und die Zeit, die Vorbereitung PBMC ist belastender als ein Blut-Abstrich, aber es gibt eine Reihe von Vorteilen. Zum einen ist die Vorbereitung mehr bereichert in Lymphozyten, die die Zellen von Interesse für Projekte, die auf Autoimmunität zentriert sind. Wenn Blutausstrichen verwendet wurden, würde Lymphozyten in der Minderheit zu sein, so dass es eine Herausforderung, um die Zelle von Interesse zu finden. Man müsste vorzubereiten und zu analysieren, weit mehr Folien, die gleichen Zahlen, die Sie mit ein paar PBMC Dias bekommen würde zu bekommen. Forscher sehr daran interessiert, unsere neue, optimierte Technik in Autoimmunität Projekten zu-1-Diabetes, Multiple Sklerose, Lupus, rheumatoide Arthritis, usw. Geben Sie in dem T- und B-Lymphozyten und NK-Zellen eine Rolle spielen würde. Natürlich, für andere Anwendungen, bei denen Erythrozyten oder Neutrophile sind von Interesse der Blutausstrich wäre empfehlenswert. Der andere Vorteil ist, dass PBMCs für das Studium der menschlichen Lymphozyten Biologie in vitro verwendet werden.

Eine fortlaufende Forschung untersucht die Quelle von Glykogen in PBMCs. Ichn die Zukunft ist geplant, Glykogengehalt im Zusammenhang mit Multipler Sklerose, einer T-Lymphozyten-vermittelte Autoimmunerkrankung, die schätzungsweise 2,3 Millionen Menschen ab 2013 ^15,16 wirkt sich weltweit zu messen. Was sind die großen und kleinen Zellen in der PBMC-Proben? Zellen in 5 & mgr; m sind konsistent mit der lymphoiden Linie in ihrem Ruhezustand. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, natürliche Killerzellen und andere kleinere Untergruppen sind in diesem Größenbereich. Die größeren PBMCs werden wahrscheinlich von aktivierten Lymphozyten, die größer werden, wie sie inflammatorische Signale aus dem Immunsystem zu empfangen und Monozyten aus der myeloiden Linie zusammengesetzt ist. Erweiterte Zellsortiertechniken wie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder Magnetvermittelte Zellsortierung erforderlich sind, um die Teilmenge, die Glykogen drückt weiter zu verfeinern.

Hämatoxylin Gegenfärbung wurde verwendet, wenn die Färbung wurde an Vollblut durchgeführt. So konnten wir Monozyten aus Erythrozyten (zu unterscheiden4C). Wenn die Färbung wurde auf PBMCs erfolgen, da alle Zellen wurden mononukleäre gab es keine Notwendigkeit, die mit Hämatoxylin-Färbung von Zellen zu identifizieren entgegenzuwirken. Auch Hämatoxylin wurde Stören der PAS-Signal in den Zellen. Zusammenfassend haben wir ein PAS-Färbeverfahren für PBMCs angepasst demonstriert. Diese Technik ist nützlich für Wissenschaftler und Kliniker der Erforschung der Autoimmunität, Infektionen und Allergien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.