Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Introduction

Periyodik asit Schiff (PAS) boyama yaygın kas araştırma ve teşhis kullanılan bir immunohistokimyasal tekniktir. Aynı zamanda kan örnekleri üzerinde bir teşhis aracı olarak kullanılır. tekniği renksiz Schiff reaktifi böylece derin bir kırmızı ürünü üreten tepki polisakkarit oluşturarak aldehit grupları içinde birimler okside numune, periyodik asit çözeltisi uygulayarak çalışır. Bu işlem aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. leke glikojen, glikoproteinler, glikolipidler, müsin veya polisakarit parçası ile diğer moleküller de dahil olmak üzere polisakaritler, kırmızı, herhangi bir şey döner.

PAS boyama, genellikle kas lifleri glikojen seviyelerini ölçmek için kullanılır. Kaslar doku bölümleri onlar sıkıca slayt eklemek ve çoklu yıkama ve boyama aşamaları dayanacak gibi tekniği için idealdir. Glikojen yüksek bir talep var Tip II kas lifleri, hızlı seğirme en mevcutMaksimum performans için ^1,2 glikojen gerektiren hızlı ATP üretimi için. Glikojen glikojen fosforilaz enzimlerinin hareketiyle serbest glukoz ayrılabilir bir glikoz dallı bir polimerdir. Dinlenme ve beslenme yeterliliği zamanlarda, glikojen, glikojen depo sürecinde doldurulan ise beslenme yetersizliği veya yüksek-enerji talebi zamanlarında; glikojen glikojenoliz tarafından glikoz bölünür. Kan örneklerinde olduğu gibi erken 1950 en klinisyen bilim adamları araştırdı gibi PAS boyama çeşitli hastalıklarda ^3-7 glikojen içeriğini analiz etmek. Örneğin, Pompe hastalığı bir bonafide glikojen depolama hastalıksız beyaz kan hücreleri sağlıklı kontrollerden ⁸ önemli ölçüde farklıdır glikojen büyük miktarlarda birikir.

Bu video-madde periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) sağlıklı bir insan deneklerin venöz kan numuneleri kullanmak için PAS boyanması uyarlanmış bir versiyonunu gösterir. PBMCs örneğin doğal katil hücreler ve monositler gibi T lenfosit ve B lenfosit ailesine ve diğer bağışıklık hücrelerinin, çoğunlukla lenfositler içerir. İlk saflaştırma adımı, eritrositleri, nötrofiller ve diğer granülositler kaldırır. Bu teknik, tam kan smear ile karşılaştırıldığında PAS pozitif hücrelerin daha güçlü sayımı için izin lenfositlerin konsantre oranı ilgili verileri sağlar.

Şekil 1:. PBMC PAS boyama aşaması yöntem vasıtasıyla, aşama (a) İlk olarak, PBMC izole Ficoll gradyanı ile elde edilir, Sol panel, santrifüj işleminden önce hazırlanışını göstermektedir, sağ panel santrifüj sonra gösterilmekte olup, burada PBMC içeren ince beyaz tabaka tüpün merkezinde görülmektedir. (B) izole edilmiş PBMC, formalinle etanol sabitleyici Solu kullanılarak slayt üzerine sabitleniryon. Slayt hafifçe plastik bir yıkama şişesinden damıtılmış su ile iyice durulanır. (C), Lam, daha sonra glikojen eriyecektir amilaz çözeltisi ile doldurulmuş 100 ml'lik bir beher yarım, yerleştirilir. Slayt hafifçe çalkalanır. (D) slayt sakarit oksidasyon meydana periyodik asit çözeltisi ile muamele edilir. Slaytlar hafifçe durulanır; bu fazla periyodik asit çıkarın ve oksidasyon aşamasını durur. (E) Schiff reaktif slaytlara eklendi, bu oksitleme adımı sırasında oluşturulan aldehit ile reaksiyona girer. Bu, renksiz bir reaktif maddesi daha sonra, bir koyu kırmızı eflatun bir ürün ile sonuçlanır. Slaytlar hafifçe fazla Schiff reaktifi kaldırmak için durulanır.

Protocol

İnsan kan örnekleri ile Araştırma Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 10000618. tarafından Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 2010BERG tarafından onaylanan fare kas çalışmalarını kabul edildi.

Tüm Blood 1. PBMC İzolasyon

NOT: Steril teknik ve üretici-sterilize ekipmanı kullanarak bir biyogüvenlik kabini bu prosedürü gerçekleştirin.

1. Dikkatli bir şekilde 50 ml steril konik tüp içine heparinize (anti-koagülant), kan toplama tüpleri tam kan 10-15 ml dökün. Küçük kan dökülmeleri için, temizlik bezi kullanarak GKD ₂ O ve% 70 EtOH ile silin.
2. Fosfat tamponlu salin (PBS 1x), pH 7.4 ile 1: 1 oranında, konik bir tüp içinde kan seyreltin. Maksimum toplam hacim 30 ml aşmayacak emin olun.
3. Hafifçe kabarcıklar kaçınarak bir serolojik pipet tabancası kullanarak karıştırın.
   NOT: Kan a önlemek için tüp tersini KARIŞTIRMAYINIZSantrifüj sırasında kapak ve daha sonra sızma olarak ccumulation.
4. Yeni 50 ml kapasiteli konik tüp, Ficoll Paque 13 ml (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) ekleyin. Rafa tüp dik tutun.
5. Bir transfer pipet kullanarak, sulandırılmış kan almak tepesine yakın tüpün iç duvarına aktarım pipet dokunun. Yavaş ve sabit bir basınç ile, sukroz tabakanın üstünde kan tabakayı oluşturan borunun iç duvarı boyunca kan aktarın. Tüm kan transfer olmuştur kadar bu adımı birkaç kez yapın.
6. Sıkıca tüp Cap ve 5 orta hızlanma seti ile bir salıncak rotor 700 xg'de 30 dakika oda sıcaklığında santrifüj tüpü, ve yavaşlama SIFIR ayarlanır.
7. Yavaşça tüp almak ve katmanları bozmadan, biyogüvenlik kabini onu geri almak.
8. Dikkatle PBS / plazma a arasına yerleştirilen PBMCler bulunduğu buffy coat (ince bulutlu beyaz tabaka), toplamaknd fikol tabakalar Bir transfer pipeti kullanarak. Sakaroz tabakası toplama kaçının ve kırmızı kan hücresi katmanı rahatsız etmeyin.
9. Yeni 50 ml steril konik tüp içine buffy coat aktarın. Tüm PBMC'yi toplamak için adım 1.8 tekrarlayarak birkaç kez alabilir.
10. PBMC ile tüp PBS pH 7.4 ekleyin ve 45 ml işaretine kadar doldurun. Iyice tüp sallayın. Vorteks etmeyin.
11. 1 yıkayın: Santrifüj 15 dakika konik tüpün dibinde PBMC'lerin bir pelet oluşumunu gözlemleyin 9'a ayarlanmış maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg'de.
12. Ağartıcı 10 ml bir plastik geniş şişenin içine PBS (süpernatant) atın.
13. Hafifçe dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı "bozucu" hücre pelet gevşetin. Vorteks etmeyin.
14. Tüpüne taze PBS pH 7.4, 25 ml ilave edilir. Birden fazla tüp işlenirken, bu aşamada topaklan bir arada havuz.
15. 2 yıkayın: santrifüj tüpüne 12 dakika için 480 xg wi9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem de inci.
16. Çamaşır suyu bir sıçrama ile plastik beher içine PBS (süpernatant) atın.
17. Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça "raf". Vorteks etmeyin.
18. Tüpüne taze PBS 25 ml ilave edilir.
    1. Hücrelerin 50 ul çıkarın ve canlılık saymak için bir mikrosantrifüj tüp içine aktarın.
    2. Tripan mavisi (bir canlılık leke) ve pipet kadar eşit miktarda (50 ul) ekleyin ve yavaşça karıştırın.
19. 10 ul çıkarın ve ml başına hücre canlılığı kontrol etmek için bir hemositometrede transfer. Hücre / ml sayısını kaydeder.
20. Hücrelerin istenilen miktarda çıkarın ve 9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg'de 12 dakika santrifüj tüpü.
21. Ağartıcı ile çanak içine PBS (süpernatant) atın.
22. Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça "raf". 8 EkleTüpüne PBS 0 ul.

2. PBMC Slide yapma

1. Bir mikroskop lamı üzerine hücreler 80 ul koyun. Başka bir sürgü yardımı ile damla yayma ya da sürgünün her iki ucunda 40 ul, her 2 damla yerleştirin.
2. Kuruması için biyolojik güvenlik kabininde slayt bırakın. Buzlu tarafında bir kalem ile slayt etiketleyin.

3. Slaytlar üzerinde Örnekleri Tespit

1. 4.5 ml% 99 etanol,% 37 formaldehid 0.5 ml karıştırılarak sabitleyici çözelti hazırlayın.
2. Slaytlar kurutulur sonra, taze yapılmış fiksatif solüsyonu 2 ml çıkar ve slayt tüm yüzeyi kaplı olduğunu, böylece slayt üzerine dökün.
3. 1 dakika slayt üzerinde çözüm bırakın. Musluk suyu ile 1 dakika boyunca slayt durulayın ve kurumaya bırakın.

4. Negatif Kontrol Amilaz Çözüm yapma

1. Amilaz toz 0.25 g almak ve di 50 ml içinde çözülürstilled su. Temiz bir 100 ml beher çözüm dökün.
2. Sürgünün yarısı muameleye tabi tutulur ve diğer yarısı tedavi edilmezse, ve daha sonra oda sıcaklığında (Şekil 1 C) 'de 15 dakika boyunca inkübe yani beher içinde slayt bırakın.
3. Slayt yan amilaz tedavi olduğu not edin. Tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren slayt arkasında bir çizgi çizin.
4. Amilaz çözüm kaldırmak ve kuru hava slayt bırakmak GKD ₂ O slaytlar yıkayın.

5. Periyodik Asit Schiff (PAS) Boyama ve Görüntüleme gerçekleştirin

NOT: PAS reaktifler Teneffüs yoluyla toksik ve korozif, bu yüzden adımlar kimyasal davlumbaz yapılması gereken, ve atık ürünleri düzgün kurumsal kurallarına göre imha edilmelidir.

1. Düz bir yüzeye yerleştirin ve slayt örnek üzerinde Periyodik Asit Çözüm 1,50-2,00 ml dökün. Doğmuş iyileşmesiniOda sıcaklığında 5 dakika boyunca te.
2. Distile su birkaç ücretleri slaytlar durulayın.
3. Slayt Schiff reaktifi 1,50-2,00 ml dökün ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
4. 5 dakika distile su ile yıkayın ve slayt kuru hava bırakın.
5. Slaytta 10 ul montaj medya uygulayın ve iki küçük lamelleri ile kaplayın ya da 50 ul uygulamak ve büyük bir lamel kullanın.
6. Lamel kenarlarında açık oje uygulayın, kuru gecede izin.

6. 100X Amaç kullanma Dürbün Işık Mikroskobu ile Görüntüler elde

Representative Results

Reaktifler ve temel tekniği doğrulamak için, PAS boyama fare soleus kas bölümlerinde üreticinin talimatlarına göre yapıldı. boyama kurban aynı gün yapıldı ve boyama son adımda, bölümler ksilen ile tespit edildi. Soleus Kas ~% 35 glikojen-pozitif hücrelerin ⁹ ihtiva ettiği bilinmektedir. lekeli, kas hücreleri, hücre içinde iki farklı PAS pozitif özellikleri-noktalı granüller görüntülenir ve hücre zarı (Şekil 2A) demarking işlem kesintisiz bir hat. noktalı granüllerin varlığının glikojen depolarda ile tutarlıdır ve pozitif kas hücre tanımlamak için kullanılmıştır. Amilaz ile örnekleri tedavisi bunların glikojen (Şekil 2B) olmak üzere tutarlı noktalı granüller kaldırıldı.

Şekil 2: PASSENGER lekeli fare kas bölümleri ışık mikroskobu ile incelendi. Fare soleus kas bölümleri PAS ile boyandı. Bazı numuneler amilaz ile ön-muamele edilmiştir. (A), PAS pozitif parçacıklar kas hücreleri içinde görünür. Kas kesitleri ön işlemden amilaz ile ne zaman (B) 'azı PAS pozitif hücreler gözlemlenmiştir. Hücre zarının etrafında boyama amilaz tedavisi (ölçek çubuğu = 100 mikron) sonra kalmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

zar lekeleme sinyal bile amilaz tedaviden sonra kalmıştır. Beklendiği gibi amilaz tedavi kas kesitleri yaklaşık olarak% 5 PAS pozitif hücreleri (Şekil 3), çok daha az olmasıyla birlikte, sigara-amilaz kas bölümüne PAS pozitif hücrelerin yüzdesi,% 37 olmuştur.

">
Şekil 3: PAS pozitif kas hücrelerinin sayılmasına PAS pozitif olmayan veya amilaz ön-muamelesi yapılan temsili bir slayt sayılmıştır edildi kas hücrelerin oranı.. Beklendiği gibi, kas hücreleri% 37 glikojen pozitifti. Amilaz tedavisi önemli ölçüde% 4 (* p <0.001) PAS-sinyali azalır.

Daha sonra, PAS boyama protokolü bölümünde tarif edildiği gibi bir tadil edilmiş teknik kullanılarak, sağlıklı insan deneklerin toplardamar kanından PBMC üzerinde gerçekleştirildi ve Şekil 1 'de gösterilen edildi. Yıkama adımları dikkatli bir şekilde yapıldı ise PBMC, iyi yapışmış. PAS ile boyanmış olan PBMC'ler boyanma çeşitli gösterilir. Granüller ile küçük hücreleri (5 um) hali hazırda tespit edilmiştir. Diffüz boyanması daha büyük hücrelerin bir kısmı, aynı zamanda gözlenmiştir (Şekil 4A ve ilave A.1-6 (Şekil 4B) azaldı.

Şekil 4:. PBMC insan PBMC ile periyodik asit-Schiff (PAS) boyama, (A) PAS boyama yapılmıştır. Iki tip hücre gözlenmiştir. Olmayan-amilaz tedavi slaytlar (A.1-6) küçük hücreler (5 mikron at) glikojen ile uyumlu kırmızı parçacıklar gösterdi. Bu hücreler dinlenme edilebilir. Olmayan amilaz ile muamele edilmiş hücreler içinde, daha büyük hücreler (en fazla 5 um) yaygın PAS pozitif boyanma yoktu. Bu hücreler, lenfositler devreye sokulabilir. (B) PBMCler önce PAS sinyali azalmış boyama, 15 dakika için amilaz ile işleme tabi tutuldu. Yedi farklı, sağlıklı insan deneklerin Temsilcisi. (C) PAS ve hematoxylin boyama tam kan slayt üzerinde yapılan. ok sayıda eritrositler (ölçek çubuğu = 10 um) ile çevrili bir PBMC'yi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

PAS pozitif oranı daha küçük hücreler için% 98 ve daha büyük hücreler için% 40 idi. Amilaz tedavi küçük hücreler PAS sinyali bulundu (p <0.001) elimine edilmiş ve önemli ölçüde% 7 (Şekil 5), daha büyük hücrelerin PAS sinyalini azalttı.

Şekil 5: PAS-pozitif PBMC'lerin Niceliklendirilmesi PAS pozitif olmayan veya amilaz ön-tedavi ile temsili slayt sayılır idi PBMC'lerin oranı.. Küçük ölçekli hücrelerin% 98 PAS pozitif idi. Daha büyük hücreler% 40 s idiPAS için ositive. Amilaz tedavi küçük hücreler PAS sinyali bulundu (p <0.001) elimine edilmiş ve önemli ölçüde% 7 (p <0.001) daha büyük hücreler PAS sinyalini azalttı.

PBMC'ler de glikojen miktarının nicelendirilmesi, ^10,11 kullanıldı içerir ve daha önce diğer hücre tipleri ¹² Jüpiter yayınlanmıştır, ikinci, bağımsız bir yöntem glikojen sahip olduğunu doğrulamak için. PBMC'ler, hipotonik tampon maddesi içinde lize edildi ve glikojen Şekil 6'nın başlık tarif kısaca ayrıldı.

Şekil 6: hidroliz enzimleri ile enzimatik sindirim kullanılarak glikojen ölçümü. Glikojen, üreticinin talimatlarına uygun olarak ölçüldü. Kısaca, protokol çözünmeyen malzemenin topaklama, ardından 1 x 10 ⁶ PBMC hipotonik liziz gerektirirBu glikojen içerir. pelet yıkanmış ve spektrofotometri ile ölçülmüş ve standart bir eğri ile karşılaştırılmıştır glukoz elde hidroliz enzimleri ile sindirilmiştir. Hücre lizatı hidroliz tamponu ile belirtilen oranlarda seyreltilmiştir. Veriler üç deneyi temsil etmektedir. Glikojen önemli seviyelerde 1 tespit edilmiştir: 1 seyreltme (p = 0.02) ve lizat olarak titre bu sinyal daha seyreltildi.

çözünmeyen glikojen birkaç kez yıkandı ve daha sonra hidroliz enzimleri kullanılarak sindirilmiştir. sindiriminden elde glukoz miktarı, spektrofotometri ile ölçülmüş ve standart bir eğri ile karşılaştırılmıştır. Bir milyon PBMC glikojen 1.19 ug vardı. Hücre lizatının aşağı titre glikojen sinyalinin ayrıca (Şekil 6) ile seyreltildi.

Discussion

Bu video makalede kritik adım hücrelerin yıkanması ve amilaz işlemi sırasında idi. Slaytlar yıkarken önemli bir adım bir plastik sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak ve su yavaşça slayt üzerinde numune üzerinden çalıştırmak izin ve örneklerin doğrudan hedefleyen değildi. Hatta ufak doğrudan su basıncı slayt dökülmek hücreleri neden olur. Bir başka önemli adım ± amilaz koşulları için aynı slayt kullanmak oldu. PBMC slayta yapıştırılmış sonra, dikkatli bir şekilde kayar, böylece yayma sadece yarısı amilaz çözeltisine maruz kalmış bir kap içine yerleştirilmiştir. Kan hücreleri aynı slayt çünkü bu adım, böylece hafif zamanlama varyasyonları nedeniyle oluşabilecek karıştırıcı değişkenler minimize, sağlam bir kontrol sağlar. Hücreler herhangi bir tedavi ile takılıp, bu yüzden, örneğin, poli-L-lisin ya da polietilen glikol kaplama ile ilgili ek bir maliyet ve zaman garanti edilemez olacaktır.

TR'denamilaz optimal aktivitesi oubleshooting belirlenmiştir. Kas bölümler için, amilaz optimal aktivitesi, inkübasyondan 1 saat içerisinde gözlenmiştir not edilmiştir. Yeterince PAS-sinyali çıkarmak değildi kısa süreler amilaz iken uzun zamanlarda kas bölümleri yavaş yavaş, slayt soyulabilir olur. PBMC slaytlar için amilaz inkübasyon için zamanlama sadece 15 dakika kadar (1 saat oldu) kas-örnek zamanlama göre azaltılmış gerekiyordu. Daha uzun kez daha kısa süreleri etkili bir PAS-sinyal etkisi olmazken PBMC'Ier, slayt dökülmek neden oldu. PAS boyama standart protokole Bir değişiklik slaytları yıkama yöntemi değişiyordu. Üreticinin talimatları hücreleri slaytları dökülmek neden musluk suyu, çalışan ile slaytlar yıkayın belirtti. modifikasyon hücreleri korumak için sıkılabilir yıkama şişesi ile slaytlar yıkamak oldu. Kritik adım bölümünde tarif edildiği gibi, doğrudan su uygulamak için çok önemliydihücreleri üzerinde baskı.

Bu teknikte bazı sınırlamalar vardır. kas hücre zarı kas hücre sitoplazması içinde noktalı granüller ile birlikte boyandı. membran boyanması amilaz duyarsız ise granüller, amilaz tedavisi ve glikojen olması olasıdır suretiyle bertaraf edilmiştir. hücre zarı üzerinde PAS pozitif parçacıkların kimliği bilinmemektedir. Bu kas bodrum (perimysium) zar olabilir. Bu membran kas liflerinin sarmakta ve yüksek glikoprotein içeriğine pozitif PAS bilinmektedir. PAS boyama başka sınırlama glikojen granülleri çapının en az 50 nm geleneksel ışık mikroskobu ile görünür olmasını olmasıdır. Bu durumda, daha küçük bir glikojen granülleri, bir hücre içinde mevcut olabilir, ancak yine de bir PAS testi negatif kayıt olabilir. kullanılan ikinci yöntem, bir lizat glikojen algılama sağlayarak bu tür kısıtlamalar ortadan kalkmaktadır. Standart bir eğri ile birlikte bu deterjanları için kullanılabilirglikojen tam miktarını rmine. Bu teknik, kolay ölçülebilir ve granül boyutu ile sınırlı değildir, ancak kendisi bazı sınırlamalar söz konusudur. Glikojen granüller bu olası hidroliz enzimleri tamamen bütün bir glikojen molekülü ¹³ çözünmesi hale birçok aksesuar proteinler ve kimyasal olarak çapraz bağlantıları olan karmaşık bir dallanmış yapılardır. Böylece, (PAS tekniği gibi) enzimatik algılama bir örnekteki glikojen gerçek miktarı altında temsil edebilir. Bu sınırlama işlemek için bir yolu bile küçük glikojen granülleri ¹⁴ giderir elektron mikroskobu ile. Bir glikojen en kapsamlı karakterizasyonu için bu tekniklerin, PAS boyama, enzimatik sindirim ve elektron mikroskobu bir arada istihdam etmesi gerekir.

Bu makalede, ve video PBMC'ler kullanıma uygun periyodik asit Schiff (PAS) boyama tekniği göstermektedir. Bu çalışmanın önemi kullanarak bir seçim olarak görülmektedirDaha uygun lenfositler numaralandırmak için yapılan kan yayması üzerinde PBMCler. İlk olarak, bir klasik kan yayma tekniği test edildi, slayt üzerinde hücrelerin ve çoğunluğu kırmızı kan hücreleri ve muhtemelen nötrofiller (Şekil 4C) idi. Lenfositleri yoğunlaştırmak PBMC'ler standart yoğunluk gradyan yöntemi kullanılarak kandan arıtılmıştır. Kan-smear benzer bir tekniği kullanarak, PBMC'ler kolayca birçok kuvvetli yıkama adımlar vardır PAS prosedürü, süresi boyunca yapıştırılır. PAS tekniği ince kesit halinde kesilmiş ve slaytlar yapıştırılır kas dokusu biyopsi, glikojen seviyelerini belirlemek için yıllardır kullanılmaktadır. PAS boyama nedeniyle yüksek güvenilirlik ve literatürde beklenen sonuçların varlığı diğer karbonhidrat boyama kimyasallar üzerinde seçildi. Beklendiği gibi bir fare (Mus spretus) kas kesitleri hücrelerin% 37 PAS pozitif ⁹ olduğu, bir pozitif kontrol olarak kullanılmış ve tespit edilmiştir. Maliyet ve zaman açısından, PBM hazırlanıyorC kan yaymasında daha zahmetli olduğunu, ancak çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, hazırlık otoimmünitesi üzerinde merkezi projeler için ilgi hücreleri lenfositler, daha zenginleştirilmiş olduğunu. Kan lekeleri kullanılmış olsaydı, lenfositler zorlu ilgi hücreyi bulmak için yapım, azınlık olacaktır. Bir hazırlamak ve bir kaç PBMC kaydıraklı alacağı aynı numaraları almak için çok daha fazla slayt analiz etmek gerekir. Araştırmacılar T ve B lenfositler ve NK hücreleri rol oynadığı 1 diyabet, multipl skleroz vb, lupus, romatoid artrit, yazın ile ilgili otoimmünite projelerinde yeni optimize tekniği kullanarak çok ilgi olacaktır. Tabii ki, eritrositler veya nötrofiller ilgilendiren diğer uygulamalar için kan yayması tavsiye ederim. Diğer bir avantaj PBMC in vitro insan lenfosit biyoloji çalışmaları için kullanılabilir olmasıdır.

Devam eden araştırmalar PBMC'lerin glikojen kaynağı araştırıyor. Benn gelecekte, multipl skleroz, 2013 ^15,16 olarak dünyada tahminen 2,3 milyon kişiyi etkileyen bir T lenfosit aracılı otoimmün hastalık bağlamında glikojen içeriği ölçmek için planlanmıştır. PBMC örnekleri küçük ve büyük hücreler nelerdir? 5 mikron de Hücreler kendi dinlenme devlet lenfoid soy ile tutarlıdır. T lemfosit, B lenfositleri ve doğal öldürücü hücreler ve diğer küçük alt-kümeleri, bu boyut aralığı içindedir. Büyük olasılıkla PBMCler miyeloid soydan aktif bağışıklık sisteminden inflamatuar sinyalleri almak gibi büyük büyümek lenfositlerin, ve monositlerin oluşmaktadır. Böyle floresan aktive hücre sıralama veya manyetik aktive hücre sıralama gibi gelişmiş hücre sıralama teknikleri daha glikojen ifade alt kümesini rafine gerekmektedir.

Boyama tam kan yapıldığında Hematoksilen sayacı boyama kullanıldı. Bu eritrositten monositler (ayırt etmemizi sağladıŞekil 4C). Boyama PBMC'lere üzerinde bittiğinde tüm hücreleri tek çekirdekli beri, hücreleri tanımlamak için hematoksilen ile lekeyi karşı gerek yoktu. Ayrıca hematoksilen hücrelerinde PAS sinyali ile müdahale edildi. Özet olarak, PBMC için uyarlanmış bir PAS boyama prosedürü gösterilmiştir. Bu teknik otoimmünitesi, enfeksiyon ve alerji araştırma bilim adamları ve klinisyenler için yararlıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.