Introduction
Granulocytter udgør en komponent af kroppens medfødte immunsystem, der giver den første linje i forsvaret mod invaderende antigener. Tidligere metoder til vurdering granulocyt-funktion med fokus på fagocytose kapacitet eller oxidative burst bruger separate metoder, hvilket gør det vanskeligt at fastslå kollektivt hvordan granulocytter har ændret 1-4. Fremskridt inden for flowcytometri har resulteret i produktionen af stationære instrumenter, der kan i høj opløsning, multi-farve imaging af celler i en high throughput måde 5. Evnen til at kombinere billeder med traditionelle flowcytometri repræsenterer et fremskridt, der giver den teknologiske platform er nødvendig for at innovere inden for eksisterende flowcytometri metoder og udtrække nye oplysninger om immunsystemet.
I løbet af de seneste ti år har vores laboratorium, bl.a. været stor fokus på effekten af forskellige ernæringsmæssige og motion behandlinger patteRNS på medfødte immunfunktion 6-9. Metoden demonstreret i dette manuskript har praktiske konsekvenser, inden for klinisk immunologi. Den nuværende metode udnytter kraften i billedbaseret flowcytometri til samtidig fagocytose af bakterielle partikler og oxidativ burst. Ved hjælp af denne metode, man er i stand til at adskille aktiverede granulocytter ved hjælp variabler, som billedet baserede del af analysen. Disse undergrupper var kun identificeres efter at have vurderet de cellulære billeder på de enkelte granulocytter. Yderligere assay inkubationstid påvirkede overgangen mellem de tre aktivering delmængder 10. Således er det sandsynligt, at anvendelsen af flere inkubationstider kan tillade en metode til at teste ændringen i granulocyt funktion efter en specifik eksperimentel behandling. Formålet med dette manuskript var at vise en metode til vurdering granulocyt funktion ved hjælp af billedet baseret flowcytometri til samtidig fagocytose med oxidative briste.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer for indsamling af blod, der er beskrevet i denne metode er udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af UNT Institutional Review Board (IRB) for mennesker. Alle individer gav skriftligt samtykke til blodtapning, som blev anvendt i den foreliggende metode til at sikre, at de var tilsyneladende sunde, normale legemsvægt og sygdomsfri.
1. Reagens Kilde & Fremstilling
- Brug CD66b-APC (klon # G10F5; DF = 1: 50) og CD45-APCeFluor780 (klon # 2D1, DF = 1: 50) til denne analyse.
BEMÆRK: Før undersøgelsen blev CD45 og CD66b antistoffer titreret at bestemme den optimale fortynding, der klart løst granulocytter (CD45 + / 66b +) fra andre leukocytter (CD45 + / 66b-) 11. Efter tilsætning af den fortyndede antistof til farvning den endelige fortynding i røret var 875. - Køb og tø lager S. aureus biopartikler mærket med pHrodo rødt farvestof. Suspend i en koncentration på 1 mg biopartikler pr ml i sterilt PBS. Alikvote fortyndede biopartikler og opbevare frosset ved -20 ° C indtil anvendelse i assayet.
- Opløs dihydroethidium (DHE), som omdannes til fluorescerende ethidiumbromid i nærværelse af oxygen-frie radikaler (dvs. den oxidative burst) i DMSO til en slutkoncentration på 10 g / ml.
- Bland N-ethylmaleimid (anvendes til at forhindre yderligere fagocytose efter den angivne assay inkubation varighed) med sterilt PBS i en 2 trin fortynding af 200 mg / ml og 17,5 mg / ml. I assayet bruger en slutkoncentration på 15 mM. Når optøning N-ethylmaleimid bruge en 37 ° C varmeblok, som N-ethylmaleimid ikke forbliver i opløsning.
- Efter den sidste fiksering trin, skal du bruge 7AAD at farve nukleare DNA. Før desuden fortynde lager 7AAD 1:10 med sterilt PBS.
2. blodprøvetagning
- Spørg emner at nå frem til laboratoriet efter en O / N hurtig (> 8 timer) og abstentipå fra fysisk aktivitet (> 12 timer).
- Efter rengøring af huden med en alkohol prep pad, indsætte en steril blodtapning nål i en perifer arm vene.
- Saml blod ind evakuerede rør, der er kommercielt fyldt med natrium heparin.
- Efter indsamling, anvende en selvklæbende bandage til emnet arm.
- Vend blod rør til at blande 10 gange og derefter placere på en rocker indtil analyse.
3. Fagocytose assayteknik
- Thaw S. aureus biopartikler (RT), DHE (RT) og N-ethylmaleimid (37 ° C).
- Tilføj 20 L af S. aureus biopartikler til 4 individuelle 1,2 ml rør, mens du arbejder i den sterile hætte.
- Tilsæt 40 L af DHE til hvert rør indeholdende biopartikler.
- Bankes forsigtigt rørene på bænken overflade for at indsamle reagenserne i bunden af røret.
- Tilsæt 100 L af blandet fuldblod til hvert rør, der er blevet fyldt med biopartikler og DHE.
- Tør den indvendige kant af rørene med en bomuldsklud applikator for at fjerne eventuelle kontaminerende blod.
- Bland blod og reagenser med en elektronisk pipette indstillet til at blande blod og reagenser til tre cykler efter blod tilsætning.
- Placer assayrør i en ice bucket og dækker for at beskytte mod lys.
- Inkuber assayrør 10, 20 og 40 min. Start med 40-min røret for at sikre, at alle assayrør færdig på samme tid.
- Thaw N-ethylmaleimid i 37 ° C perle bad.
- Pipetter 15 L af N-ethylmaleimid (beskrevet ovenfor i 1.4) i hvert assay rør, inkuberes i 30 min.
- Afpipettér 10 L af CD66b-APC og 10 L af CD45-APCeFluor780 fortyndede antistoffer (beskrevet ovenfor i 1.1), der inkuberes i 60 min.
- Pipetter 750 L af WBC fix / RBC lyse løsning i hvert assay rør, inkuberes i 60-min.
- Centrifugeres (10 minutter ved 400 xg) assayreagensglas at indsamle cellepelleten.
- Vacuum sug WBC lyse / RBC fix løsning, efterlader en resterende fluid volumen (100 L) over cellepelleten.
- Pipetter 10 L fortyndet 7AAD opløsning (beskrevet ovenfor i 1.5) og 50 L af PBS i hvert assayrør.
- Tilsæt en dråbe kalibrering perler (~ 25 L) til hvert assayrør, sted hætter på assayrør, wrap rør i folie, og sted i køleskab.
- Læg prøverøret ind i billedet baserede flowcytometer og indsamle mindst 3.000 granulocyt begivenheder ved hjælp af foruddefinerede parametre: Autosampler, blå (488 nm, 60 mW), rød (640 nm; 100 NV), SSC (785 nm; 8,5 MW) lasere (figur 1).
Figur 1. overtagelsesmetoden & Template. Prøver blev erhvervet på et billede baseret flowcytometer (A). Under købet blev dot plots af Bright Field Aspect Ratio vs. CD66b-APC genereret til adskilte granulocytter fra spidse kalibrering perler Brug INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Mindst 5.000 granulocytter blev erhvervet for hver prøver ved hjælp af en Autosampler, blå (488 nm, 60 mW), rød (640 nm; 100 NV), SSC (785 nm 8,5 mW) lasere. Bemærk, at en række histogrammer er til stede under købet til at overvåge laser indstillinger og andre aspekter af data indsamler. Alle disse histogrammer er valgfri og kun behov for, hvis laboratoriet standardprocedurer kræver dem som kvalitetskontrol. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
4. Prøve indsamling og analyse
- Brug det automatiseret software kompensation guiden af ideerne software til at anvende en erstatning matrix til rå billedfiler (RIF) og oprette kompensere afbildes filer (CIF).
- Indlæs individuelle CIF filer i IDEAS software og generere følgende grunde til at identificere de granulocyt delmængder: Etablere indledende porte til at identificere de celler, der blev anset for at være i fokus ved hjælp af et histogram for lyse felt gradient RMS (figur 2A). Gør denne bestemmelse for hver patientprøve ved hjælp af ikke-stimulerede kontrol som referencestandard.
- Brug sekundære plots til separate singlet celler fra snavs og dubletter ved hjælp af en dot-plot af lyse felt skærmformat (forholdet mellem celle højde vs. bredde) vs. lyse markareal (figur 2B). Gør denne bestemmelse for hver patientprøve ved hjælp af ikke-stimulerede kontrol som referencestandard.
- Når en ren population af celler var blevet identificeret, etablere et punktdiagram over CD45 vs. CD66b (figur 2C) til positivt identificere granulocytter (CD45 + / 66b +). Opret en datter plot (Figur 3), i for S. lyse detalje intensitet aureus (x-aksen) versus for oxidativ burst (DHE, y-aksen) lyse detalje intensitet til at identificere undergrupper af aktiverede granulocytter. Saml bright field billeder i kanal 1 og 9, biopartikler i Kanal 2, DHE i Channel 4, 7AAD i Channel 5, CD66b i Kanal 11, og CD45 i Channel 12.
Figur 2. Analyse skabelon. Dette tal rækken af grunde, der er genereret til at identificere celler, der var i fokus (A), enkelte celler (B), granulocytter (C). Yderligere plots blev anvendt til at identificere de tre undergrupper af aktiverede granulocytter vs. inaktive granulocytter. Alle analyser af erhvervede billedfiler blev gennemført med IDEAS V.6 software. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Representative Results
Brug billedbaseret flowcytometri tilladt os at adskille en homogen population af aktiverede granulocytter i tre forskellige aktiverings- delmængder (Figur 3). Ved denne fremgangsmåde er den mest effektive måde at løse de tre aktivering delmængder er ved at plotte lyse detalje intensitet for fagocytose (S. aureus) vs. oxidative burst (DHE) (figur 3, figur 4). Desuden vil brug af co-lokalisering guiden i IDEAS softwaren giver mulighed for kvantificering af tilstedeværelsen af samtidig fagocytose og oxidative burst, som er kendetegnende tegn på stærkt aktiverede granulocytter.
Figur 3. Identifikation af aktiverede Granulocytniveauerne Delmængder. Efter identificering af granulocytter ved hjælp af celle-overflade markører (CD45 + / 66b +), blev en datter plot genereret med lyse detalje Intenfoldighed for fagocytose vs. for oxidativ burst lyse detalje intensitet. Ved hjælp af denne metode, procentdel af inaktiv (lilla), lav-aktiv (rød, A), moderat-aktiv (blå, B), og høj-aktiv (gul, C) granulocytter blev bestemt. Denne gating teknik blev også anvendt til at vurdere effekten af assay inkubationstid på den relative forekomst af de forskellige aktiverede granulocyt delmængder. Den højeste andel af "høj-aktiv" granulocytter var til stede efter 40 minutters inkubation. Alle analyser af erhvervede billedfiler blev gennemført med IDEAS V.6 software. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Ud over at påvise tilstedeværelsen af tre forskellige undergrupper af aktiverede granulocytter, blev det påvist, at assayet inkubationstid påvirket den relative forekomst af hver aktiverede granulocytter delmængde. Specifikt 40 min incubation resulterede i den største procentdel af "høj-aktiv" granulocytter. Ved at inkludere mindst tre assay inkuberingsbetingelser varigheder kan det være muligt at bestemme, hvordan en given klinisk behandling ændrer den tidsmæssige aktiveringsstatus af granulocytter. Dette er den første offentliggjorte fremgangsmåde under anvendelse billedbaseret flowcytometri for at identificere forskellige aktiverede granulocyt undergrupper som en funktion af samtidige målinger af fagocytose og oxidative burst.
Figur 4. Repræsentative billeder af Cellular Markers. Et billede galleri af celler, der er klassificeret som high-aktiv (A), moderat-aktiv (sort), og lav-aktiv (C) er præsenteret i denne figur. S. aureus biopartikler er i Ch03 oxidativ burst er i Ch04, 7AAD for kernen er i Ch05, sidespredning i Ch06, CD66b er iCH11, og CD45 er i CH12. Desuden er en co-lokaliseret merge billede af fagocytose (Ch03) vs. oxidative burst (Ch04) vises. Områder af gul i fletningen billedet betegne at fagocytose og oxidative burst finder sted i det samme anatomiske rum på samme tid. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Den foreliggende fremgangsmåde repræsenterer en videreudvikling af eksisterende metoder til vurdering af granulocyt funktion ved hjælp af flowcytometri 1,3,4,12-14. De kritiske trin i dette assay har tendens til at være relateret til korrekt blanding af blodprøven med biopartikler og DHE. Ufuldstændig blanding vil resultere i unøjagtige resultater. Mens fuldstændig blanding er kritisk, bør blanding metode være blid i naturen. Det foreslås, at blandingen opnås ved anvendelse af en elektronisk pipette med en blanding funktion snarere end en vortex mixer. En anden kritisk trin i assayet er at altid sikre, at der er ingen blod forurener den øverste halvdel af assayrør. Denne overskydende blod kan fjernes med en steril bomuld spids applikator. Fuldstændig fjernelse er vigtigt, fordi hvis det ikke sker, kan forurene den endelige forberedelse assay med un-lyserede røde blodlegemer.
Før anvendelse af denne metode passende kontroller kompensation bør tilføjes at styre for spectral overlapning blandt de reagenser, der anvendes til at identificere de forskellige aspekter af granulocyt funktion. For denne fremgangsmåde, kontrol erstatning involverer indsamle blodprøver, der er blevet foreslået i 40 min assay inkubation og derefter mærkning med en enkelt markør (dvs. E. coli, DHE, etc.). Efter mærkning, er enkelt positive begivenheder indsamlet og kompensation matrix genereres ved hjælp af en automatiseret guiden i IDEAS analysesoftware. Det er afgørende, at hvis der anvendes denne analyse er passende kontroller kompensation afsluttet for at sikre korrekt analysepræstation.
Analyse udføres ved hjælp af funktionen finder og co-lokalisering guider til at identificere, at lyse detalje intensitet er den bedste variabel til at adskille befolkningerne og også identificere, hvor meget overlap eksisterer mellem oxidativ burst og fagocytose signaler. Specifikt er anvendelsen af billedet baseret cytometri billede evnen til at adskille aktiverede granulocytter i tre undergrupper. Thans delmængde opdeling blev bestemt ved anvendelse lyse detalje intensitet fagocytose vs. oxidative burst. Ud over at undersøge disse ental cellefunktioner, blev celler, som udviste begge begivenheder på samme tid i samme anatomiske placering (co-lokalisering) identificeret. Granulocytter, der faldt ind i "high-aktivt" delmængde var de eneste fænotype, der demonstrerede konsekvent co-lokalisering mellem fagocytose og oxidative burst. Denne identifikation af aktiverede granulocyt delmængder er det største område, hvor der er behov for fejlfinding. Det er meget vigtigt for en ny bruger at tage tid til at forstå arbejdsgangen prøve proces ideer og til at forstå mekanikken i slusning af cellepopulationer ved hjælp af billedbehandling komponent. Andre ændringer, som en bruger kan forventes at gøre omfatte valg af alternative eller supplerende assay inkubationstider. Den nuværende metode foreslår anvendelsen af en varighed på 10-40 minutter; Men afhængigt af den eksperimentelle model, hvor denne metode erder skal anvendes, kan det være nødvendigt at vælge længere assay varigheder. En sådan ændring vil skulle vurderes individuelt.
Endvidere blev det besluttet, at varigheden af analysen inkubation har en signifikant effekt på forekomsten af de tre aktiverede delmængder. Den er beskrevet i denne rapport tilgang repræsenterer en udvidelse af, hvilke oplysninger der kan tidligere opnåede hensyn granulocyt funktion 3,4,13,15. Andre laboratorier har vist betydningen af at vurdere ændringer i granulocyt funktion som en del af en samlet vurdering af immunitet og sygdom 15-17. Trods potentialet af dette assay er det ikke uden begrænsninger. En af de største begrænsninger er omkostninger og tid, som er forbundet med høj produktivitet forarbejdning. Når en undersøgelse design kræver et stort antal prøver i en given dag, kan disse være vanskelige at forarbejde. Behandling er strømlinet ved brug af elektroniske pipetter og dispensere,men disse har tendens til at være dyrt og er ikke nødvendigvis tilgængelige i alle laboratorier.
Vores forskningsområde fokuserer på en undersøgelse af, hvordan motion og kostvaner påvirke immunsystemet sundhed og funktion 6,8-10,18-20. Disse målsætninger har betydelige praktiske konsekvenser for en lang række områder af menneskers sundhed. Ud over studiet af motion og ernæringsmæssige virkninger af fagocytose metode demonstreret i dette manuskript kunne være nyttige i andre områder af klinisk immunologi, hvis overvågningen af fagocytose funktion er afgørende for behandlingsresultater. Nærværende analyse er den første af mange, immunologiske assays med potentiale til at blive genopfundet ved at tage fordele af den unikke imaging oplysninger, som kan være kan fra et billede baseret flowcytometer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| S. aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
