Introduction
Granulocytter representerer en del av kroppens medfødte immunsystem, som gir den første forsvarslinje mot invaderende antigener. Tidligere metoder for å vurdere granulocytt funksjon fokusert på fagocytose kapasitet eller oksidativ burst bruke separate metoder, noe som gjør det vanskelig å fastslå kollektivt hvordan granulocytter har endret 1-4. Fremskritt innen flowcytometri har resultert i produksjon av stasjonære instrumenter i stand til høy oppløsning, multi-farge avbildning av celler i en høy gjennomstrømning måte 5. Evnen til å kombinere bildebehandling med tradisjonelle flowcytometri representerer en fremgang som gir den teknologiske plattformen som trengs for å skape noe nytt innenfor eksisterende flowcytometri metoder og trekke ut ny informasjon om immunsystemet.
I løpet av de siste ti årene, har vårt laboratorium, blant andre, er intenst fokusert på effekten av ulike ernæringsmessige og mosjon behandlinger patteRNS om medfødte immunforsvar 6-9. Metoden demonstrert i dette manuskriptet har praktiske konsekvenser innenfor feltet klinisk immunologi. Den nåværende metoden utnytter kraften i bildebasert flowcytometri å samtidig måle fagocytose av bakteriepartikler og oksidativ burst. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, er man i stand til å separere aktivert granulocytter ved hjelp av variabler som leveres av bildebasert del av analysen. Disse undergrupper var bare identifiserbare etter vurdering av de cellulære bilder på de enkelte granulocytter. Ytterligere analyse inkubasjonstid påvirket overgangen mellom de tre undergrupper aktiverings 10. Således er det sannsynlig at anvendelse av flere inkubasjonstider kan tillate en fremgangsmåte for å teste endringen i granulocytt funksjon når en bestemt eksperimentell behandling. Hensikten med dette manuskriptet var å demonstrere en metode for å vurdere granulocytt-funksjon ved hjelp av bildebasert strømningscytometri for samtidig å måle fagocytose med oxidative sprekke.
Protocol
MERK: Alle blod samling prosedyrer som er beskrevet i denne metoden ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av UNT Institutional Review Board (IRB) for mennesker. Alle forsøks gav skriftlig samtykke for blodsamling, som ble anvendt i foreliggende fremgangsmåte for å sikre at de var tilsynelatende frisk, normal kroppsvekt og sykdomsfrie.
1. Reagens Source & Forberedelse
- Bruk CD66b-APC (klon # G10F5; DF = 1: 50) og CD45-APCeFluor780 (klon # 2D1; DF = 1: 50) for denne analysen.
MERK: Før studien ble CD45 og CD66b antistoffer titered å bestemme den optimale fortynning som tydelig løst granulocytter (CD45 + / 66b +) fra andre leukocytter (CD45 + / 66b-) 11. Ved tilsetning av fortynnet antistoff til farging den endelige fortynning i røret var 875. - Kjøp og tine lager S. aureus bioparticles merket med pHrodo rødt fargestoff. Suspen ved en konsentrasjon på 1 mg bioparticles per ml i steril PBS. Alikvote fortynnede bioparticles og butikk fryses ved -20 ° C inntil brukt i analysen.
- Oppløs dihydroethidium (DHE), som omdannes til fluoriserende etidiumbromid i nærvær av oksygen-frie radikaler (dvs. den oksydative burst), i DMSO til en sluttkonsentrasjon på 10 g / ml.
- Blande N-etylmaleimid (brukes for å hindre ytterligere fagocytose etter den angitte analysen inkubering varighet) med steril PBS i en 2-trinns fortynning på 200 mg / ml og 17,5 mg / ml. I analysen bruke en sluttkonsentrasjon på 15 mM. Ved tining av N-etylmaleimid, bruke en 37 ° C varmeblokk, som N-etylmaleimid ikke forblir i løsning.
- Etter den siste fiksering trinnet, bruker 7AAD å farge kjerne-DNA. Før tillegg fortynne lager 7AAD 01:10 med steril PBS.
2. Blod Prøvetaking
- Spør fag for å komme frem til laboratoriet etter en O / N rask (> 8 t) og abstentipå fra fysisk aktivitet (> 12 timer).
- Etter rengjøring av huden med en alkohol prep pad, sette inn en steril blod samling nål i en perifer arm vene.
- Samle blod inn evakuert rør som er fylt med kommersielt natriumheparin.
- Etter samling, gjelder en selvklebende bandasje til emnet arm.
- Invertere blod rør for å blande 10 ganger og deretter plassere på en rocker til analyse.
3. Fagocytose Analyseteknikk
- Tine S.aureus bioparticles (RT), DHE (RT), og N-etylmaleimid (37 ° C).
- Legg 20 L av S.aureus bioparticles til fire individuelle 1,2 ml rør mens du arbeider i sterile hette.
- Legg 40 L av DHE til hvert rør inneholdende de bioparticles.
- Banke forsiktig på røret på benkeflaten for å samle reagensene i bunnen av røret.
- Tilsett 100 liter blandet helblod til hvert rør som er fylt med bioparticles og DHE.
- Tørk av innsiden av rørene med en bomulls tippet applikator for å fjerne eventuelle forurensende blod.
- Bland blodet og reagenser med en elektronisk pipette satt til blande blod og reagenser for tre sykluser etter blodtilsetning.
- Plasser analyse rør i en isen bøtte og dekke for å beskytte mot lys.
- Inkuber Analyserørene 10, 20 og 40 min. Starte med 40-min røret for å sikre at alle Analyserørene ferdig på samme tid.
- Thaw N-etylmaleimid i 37 ° C perle bad.
- Pipetter 15 L av N-etylmaleimid (beskrevet ovenfor i 1.4) i hvert prøverør, inkuber i 30 min.
- Pipetter 10 L av CD66b-APC og 10 l av CD45-APCeFluor780 fortynnede antistoffer (beskrevet ovenfor i 1.1), inkuber i 60 min.
- Pipet 750 L av WBC fix / RBC lyse løsning i hvert prøverør, inkuberes i 60-min.
- Sentrifuge (10 minutter ved 400 xg) Analyse-rørene for å samle cellepelleten.
- Vakuum aspirer WBC Lyse / RBC løsning løsning, og etterlater et rest fluid volum (100 L) over cellepelleten.
- Pipetter 10 ml fortynnet 7AAD løsning (som beskrevet ovenfor i 1,5) og 50 L PBS inn i hvert analyserør.
- Tilsett en dråpe perler kalibrerings (~ 25 L) til hvert prøverør, sted caps på analyse rør, vikle rør i folie, og legg i kjøleskap.
- Laste prøverøret inn i bildebasert flowcytometer og samle minst 3000 granulocytter hendelser ved hjelp av forhåndsdefinerte parametere: Autosampler, blå (488 nm; 60 mW), rød (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasere (figur 1).
Figur 1. Oppkjøp Metode & Mal. Prøvene ble kjøpt på en bildebasert flowcytometer (A). Under oppkjøpet, ble prikkplotter av Bright Feltet Aspect Ratio vs. CD66b-APC generert til skilt granulocytter fra piggete kalibrerings perler øg INSPIRE v. 100.2.292.0 programvare (B). Et minimum av 5000 granulocytter ble kjøpt for hver prøver å bruke en autosampler, blå (488 nm; 60 mW), rød (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasere. Vær oppmerksom på at en rekke av histogrammer er til stede under oppkjøpet å overvåke laser innstillinger og andre aspekter av data samler inn. Alle disse histogrammer er valgfrie og bare nødvendig dersom laboratorie standard operasjonsprosedyrer krever dem som kvalitetskontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Prøve Oppkjøp og analyse
- Bruk automatisert programvare kompensasjon veiviseren av IDEER programvare for å bruke en kompensasjon matrise til rå bildefiler (RIF) og skape kompensere avbildes filer (CIF).
- Laste individuelle CIF-filer i IDEER programvare og generere følgende tomter å identifisere granulocyttransfusjoner undergrupper: Etablere innledende porter for å identifisere cellene som ble vurdert til å være i fokus ved hjelp av et histogram for lyse felt gradient RMS (Figur 2A). Gjøre dette forsøket for hver pasientprøve ved hjelp unstimulated kontroll som en referansestandard.
- Bruke sekundære tomter til separate singlet celler fra rusk og dubletter bruker et prikkplott av lyse felt størrelsesforhold (forholdet mellom celle høyde vs bredde) vs. lyse felt område (figur 2B). Gjøre dette forsøket for hver pasientprøve ved hjelp unstimulated kontroll som en referansestandard.
- Når en ren populasjon av celler hadde blitt identifisert, etablere et prikkplott av CD45 vs. CD66b (figur 2C) å positivt identifisere granulocytter (CD45 + / 66b +). Lag en datter plot (figur 3) av lyse detalj intensitet for S. aureus (x-aksen) mot lys detalj intensitet for oksidative utbrudd (DHE, y-aksen) for å identifisere undergrupper av aktiverte granulocytter. Samle brIght bilder felt i Kanal 1 og 9, bioparticles i Kanal 2, DHE i Channel 4, 7AAD i Kanal 5, CD66b i Kanal 11, og CD45 i Kanal 12.
Figur 2. Analyse mal. Denne figuren rekke avsetninger som ble generert for å identifisere celler som var i fokus (A) enkeltceller (B), granulocytter (C). Andre tomter ble brukt til å identifisere de tre undergrupper av aktiverte granulocytter vs. inaktive granulocytter. All analyse av oppkjøpte bildefiler ble gjennomført ved hjelp av IDEER v.6 programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Ved hjelp av bildebasert flowcytometri tillatt oss å skille en homogen befolkning på aktiverte granulocytter i tre forskjellige aktiverings undergrupper (figur 3). I denne fremgangsmåte er den mest effektive måten å løse de tre aktiverings undergrupper er ved å plotte lyse detalj intensitet for fagocytose (S. aureus) vs. oksidative utbrudd (DHE) (figur 3, figur 4). Dessuten vil bruk av samlokalisering veiviser i IDEER programvare gir mulighet for kvantifisering av tilstedeværelsen av samtidige fagocytose og oksidativ burst, som er et kjennetegn tegn på høyt aktiverte granulocytter.
Figur 3. Identifikasjon av Aktivert Granulocyttnivåene delsettene. Etter identifisering av granulocytter ved bruk av celleoverflatemarkører CD45 (+ / +) 66b, ble en datter plottet genereres med lyse detalj Intensity for fagocytose vs. lyse detalj intensitet for oksidativ burst. Ved hjelp av denne tilnærmingen, andelen inaktive (lilla), lav-aktiv (rød, A), moderat aktiv (blå, B), og høy-aktiv (gul, C) granulocytter ble bestemt. Denne portstyringsteknikk ble også brukt til å evaluere effekten av analysen inkubasjonstid på den relative mengde av de forskjellige aktiverte granulocytt undergrupper. Den høyeste andelen av "høy-aktiv" granulocytter var til stede etter 40 min inkubasjon. All analyse av oppkjøpte bildefiler ble gjennomført ved hjelp av IDEER v.6 programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I tillegg til å demonstrere tilstedeværelse av tre distinkte undergrupper av aktiverte granulocytter, ble det demonstrert at analysen inkubasjonstiden påvirket av den relative mengde av hver aktivert granulocytter delsett. Spesifikt, 40 min incubation resulterte i den største andelen av "høy-aktiv" granulocytter. Ved å inkludere i det minste tre analyserugevarigheter kan det være mulig å finne ut hvordan en gitt klinisk behandling endrer den temporale aktiveringsstatusen til granulocytter. Dette er den første publiserte metode med bildebasert flowcytometri for å identifisere ulike aktiverte granulocytter undergrupper som en funksjon av samtidige målinger av fagocytose og oksidativ burst.
Figur 4. Representative Bilder av Cellular Markers. Et bilde galleri av celler som er klassifisert som høy-aktiv (A), moderat aktiv (svart), og lav-aktiv (C) er presentert i denne figuren. S.aureus bioparticles er i CH03 , er oksidativ burst i Ch04, 7AAD for kjernen er i Ch05, side scatter er i Ch06, CD66b er iCH11, og CD45 er i CH12. Dessuten er en samlokalisert flettebilde av fagocytose (CH03) vs. oksidativ burst (Ch04) vises. Områder i gult i flettebildet betegne at fagocytose og oksidativ burst er forekommende i samme anatomiske plass på samme tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den nåværende metoden representerer en videreutvikling av eksisterende metoder for vurdering av granulocytt funksjon ved hjelp av flowcytometri 1,3,4,12-14. De kritiske trinn av denne analysen har en tendens til å være relatert til riktig blanding av blodprøven med bioparticles og DHE. Ufullstendig blanding vil føre til unøyaktige resultater. Mens fullstendig blanding er kritisk, bør blandingsmetoden være forsiktig i naturen. Det er foreslått at blandingen utføres ved hjelp av en elektronisk pipette med en blandefunksjon i stedet for en vortex-blander. En annen kritisk trinn i analysen er alltid å sikre at det ikke er blod forurenser den øvre halvdel av prøverør. Denne blodrester kan fjernes med en steril bomull-tipped applikator. Fullstendig fjerning er viktig fordi unnlatelse av å gjøre dette kan forurense den endelige analysen forberedelse med un-lysert røde blodceller.
Før du bruker denne metoden passende kompensasjon kontroller bør legges til kontrollere for spectral overlapping blant reagenser som brukes for å identifisere de ulike aspekter av granulocytt funksjon. For denne fremgangsmåten, kompensasjons kontroller innebære samle blodprøver som har blitt foreslått i 40 min assay inkubasjon og deretter merking med en enkel markør (det vil si E. coli, DHE, etc.). Etter merking, er enkle positive hendelser innsamlet og en kompensasjon matrise er generert ved hjelp av en automatisert veiviser i IDEER analyseprogramvare. Det er viktig at hvis denne analysen blir brukt, blir passende kompensasjon kontroller gjennomført for å sikre riktig analyse ytelse.
Analysen er utført ved hjelp av funksjonen finder og samlokalisering veivisere for å identifisere at lyse detalj intensitet er den beste variabel for å skille populasjoner og også identifisere hvor mye overlapping mellom oksidativt burst og fagocytose signaler. Nærmere bestemt, ved bruk av bildebasert cytometri gitt evnen til å segregere aktiverte granulocytter i tre undergrupper. Thans undergruppe sammenbrudd ble bestemt ved hjelp av lys detalj intensiteten av fagocytose vs. oksidativ burst. I tillegg til å undersøke disse enkeltcellefunksjoner, ble cellene som viste begge hendelser på samme tid i samme anatomiske plassering (samlokalisering) identifisert. Granulocytter som falt inn i "high-aktiv" undergruppe var den eneste fenotype som demonstrerte konsistent samlokalisering mellom fagocytose og oksidativ burst. Denne identifikasjonen av aktiverte granulocytter undergrupper er det største området der er nødvendig med feilsøking. Det er svært viktig for en ny bruker å ta tid å forstå prøven prosessen arbeidsflyt i IDEER og å forstå mekanikken i gating cellepopulasjoner med bildebehandling komponent. Andre modifikasjoner at en bruker kan søke å gjøre omfatte valg av alternative eller supplerende analyse inkubasjonstidene. Den nåværende metode foreslår anvendelse av varigheten av 10 til 40 min; men avhengig av den eksperimentelle modell hvor denne metoden ersom skal brukes, kan det være nødvendig å velge lenger analysevarigheter. En slik endring ville trenge å bli vurdert på individuelt grunnlag.
Videre ble det fastslått at varigheten av analysen inkubasjon har en betydelig effekt på utseendet av de tre aktiverte undergrupper. Tilnærmingen er beskrevet i denne rapporten representerer en utvidelse av hvilke opplysninger som kan være tidligere opparbeidet av granulocytt funksjon 3,4,13,15. Andre laboratorier har vist betydningen av å vurdere endringer i granulocytt funksjon som en del av en helhetlig vurdering av immunitet og sykdom 15-17. Til tross for potensialet av denne analysen er det ikke uten begrensninger. En av de store begrensningene er kostnads- og tids etterspørsel forbundet med høyt prøvegjennomløp behandling. Ved en studie utforming krever et stort antall prøver i en gitt dag, disse kan være vanskelig å behandle. Processing er strømlinjeformet ved bruk av elektroniske pipetter og dispensere,men disse har en tendens til å være dyrt og er ikke nødvendigvis tilgjengelig i alle laboratorier.
Vårt område av forskning fokuserer på en studie av hvordan trening og kostvaner påvirker immunsystemet helse og fungere 6,8-10,18-20. Slike mål har betydelige praktiske konsekvenser for en rekke områder av menneskers helse. Utover studiet av trening og ernæringsmessige effekter fagocytose metoden demonstrert i dette manuskriptet kan være nyttig i andre områder av klinisk immunologi hvor overvåkningen av fagocytose funksjon er avgjørende for behandlingsresultatene. Den foreliggende assay er den første av mange som immunologiske analyser med mulighet for å bli re-oppfunnet ved å ta fordel av de unike bildeinformasjon som kan være mulig fra en bildebasert strømningscytometer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| S. aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
