Introduction
Granulocyter utgör en komponent i kroppens medfödda immunförsvar, vilket ger den första försvarslinjen mot invaderande antigener. Tidigare metoder för att bedöma granulocyt funktion med fokus på fagocytos kapacitet eller oxidativ burst använder separata metoder, vilket gör det svårt att avgöra kollektivt hur granulocyter har förändrats 1-4. Framsteg inom flödescytometri har resulterat i produktionen av stationär instrument som kan högupplösta, flerfärgade avbildning av celler i en hög genomströmning sätt 5. Möjligheten att kombinera avbildning med traditionell flöde representerar cytometry ett framsteg som ger den tekniska plattformen som behövs för att förnya inom befintlig flödescytometri metoder och extrahera ny information om immunsystemet.
Under de senaste tio åren har vårt laboratorium, bland andra, varit livligt fokuserat på effekten av olika närings- och motionsbehandlingar patterns på medfödda immunfunktion 6-9. Metoden demonstreras i detta manuskript har praktiska konsekvenser inom området klinisk immunologi. Föreliggande metod utnyttjar kraften i bildbaserad flödescytometri för att samtidigt mäta fagocytos av bakteriella partiklar och oxidativ burst. Med hjälp av denna metod, är en möjlighet att skilja aktiverade granulocyter använder variabler tillhandahålls av bildbaserade delen av analysen. Dessa undergrupper var bara identifieras efter att ha bedömt de cellulära bilderna på de individuella granulocyter. Ytterligare analys inkubationstid påverkade övergången mellan de tre aktiveringsgrupper 10. Sålunda är det troligt att användningen av flera inkubationstider kan tillåta en metod för att testa förändringen i granulocyt funktion efter en specifik experimentell behandling. Syftet med detta manuskript var att demonstrera en metod för att bedöma granulocyt funktion genom att använda bildbaserad flödescytometri att samtidigt mäta fagocytos med oxidative brast.
Protocol
OBS: Alla blodprovsförfaranden som beskrivs i denna metod genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkänts av UNT Institutional Review Board (IRB) för människor. Alla försöks gav skriftligt samtycke för blodinsamling, som användes i föreliggande metod för att säkerställa att de var till synes friska, av normal kroppsvikt och sjukdomsfria.
1. Reagens Källa & Förberedelse
- Använd CD66b-APC (klon # G10F5 DF = 1: 50) och CD45-APCeFluor780 (klon # 2D1 DF = 1: 50) för denna analys.
OBS: Innan studien, CD45 och CD66b antikroppar titrerades för att bestämma den optimala utspädningen som tydligt upplösta granulocyter (CD45 + / 66b +) från andra leukocyter (CD45 + / 66b-) 11. Vid tillsats av den utspädda antikroppen för färgning den slutliga spädningen i röret var 875. - Köp och tina lager S. aureus biopartiklar märkt med pHrodo rött färgämne. Suspendera i en koncentration av 1 mg biopartiklar per ml i sterilt PBS. Alikvotera utspädda biopartiklar och lagra fryst vid -20 ° C tills de användes i analysen.
- Lös dihydroethidium (DHE), som omvandlas till fluorescerande etidiumbromid i närvaro av syrefria radikaler (dvs den oxidativa Burst), i DMSO till en slutlig koncentration av 10 g / ml.
- Blanda N-etylmaleimid (används för att förhindra ytterligare fagocytos efter den specificerade analys inkubation varaktighet) med steril PBS i en 2 steg utspädning av 200 mg / ml och 17,5 mg / ml. I analysen använder en slutlig koncentration av 15 mM. När upptining N-etylmaleimid, använd en 37 ° C värmeblock, som N-etylmaleimid inte förblir i lösning.
- Efter det sista fixeringssteget, använd 7AAD att färga nukleär DNA. Före tillsats, späd lager 7AAD 1:10 med steril PBS.
2. Blod Provtagning
- Be ämnen för att komma fram till laboratoriet efter ett O / N snabb (> 8 timmar) och abstentividare från fysisk aktivitet (> 12 timmar).
- Efter rengöring av huden med en sprit prep pad, infoga en steril blodinsamling nål i en perifer armven.
- Samla in blod i evakuerade rör som kommersiellt är fyllda med natrium heparin.
- Efter uppsamling, applicera ett häftplåster till ämnet arm.
- Vänd blodrören att blanda 10 gånger och sedan placera på en rocker fram till analys.
3. Fagocytos Assay Teknik
- Thaw S.aureus biopartiklar (RT), DHE (RT), och N-etylmaleimid (37 ° C).
- Lägg 20 liter S. aureus biopartiklar till 4 individuella 1,2 ml rör medan du arbetar i den sterila huven.
- Lägg 40 liter DHE till varje rör innehåller biopartiklar.
- Knacka försiktigt rören på bänken ytan för att samla reagensen i botten av röret.
- Tillsätt 100 L av blandat helblod till varje rör som har fyllts med biopartiklar och DHE.
- Torka insidan av rören med en bomullspinne för att avlägsna eventuella kontamine blod.
- Blanda blodet och reagenser med en elektronisk pipett inställd på att blanda blod och reagens för tre cykler efter blod tillsats.
- Placera analys rör i en ishink och täcka för att skydda mot ljus.
- Inkubera analysrören för 10, 20, och 40 minuter. Börja med 40-min röret för att säkerställa alla analysrören avslutas samtidigt.
- Tina N-etylmaleimid i 37 ° C pärla bad.
- Pipet 15 L N-etylmaleimid (beskriven ovan i 1.4) i varje analysröret, inkubera i 30-min.
- Pipet 10 liter CD66b-APC och 10 L av CD45-APCeFluor780 utspädda antikroppar (beskrivs ovan i 1.1), inkubera i 60 min.
- Pipet 750 liter WBC fix / RBC lyse lösningen i varje analysröret, inkubera i 60-min.
- Centrifugera (10 min vid 400 xg) analysrören för att samla cellpelleten.
- Vakuum aspirera WBC lyserar / RBC fix-lösning, som lämnar en rest fluid volym (100 L) ovanför cellpelleten.
- Pipettera 10 L av utspädd 7AAD lösning (beskriven ovan i 1,5) och 50 L av PBS i varje analysrör.
- Lägg en droppe kalibreringspärlor (~ 25 L) till varje analysröret, placera lock på analysrören, wrap-rör i folie, och placera i kylskåp.
- Ladda provröret i bildbaserade flödescytometer och samla minst 3000 granulocyter händelser med hjälp av fördefinierade parametrar: Autosampler, blå (488 nm, 60 mW), röd (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lasrar (Figur 1).
Figur 1. Förvärv Method & Mall. Prover har förvärvats på en bildbaserad flödescytometer (A). Under förvärv, var punktdiagram av Bright Field Bildförhållande vs. CD66b-APC som genereras till separerade granulocyter från spetsade kalibreringspärlor usin100.2.292.0 programvara (B) g INSPIRE v.. Minst 5.000 granulocyter förvärvades för varje prov med hjälp av en Autosampler, blå (488 nm, 60 mW), röd (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm, 8,5 mW) lasrar. Observera att ett antal histogram är närvarande under förvärvet att övervaka laserinställningar och andra aspekter av uppgifter samlar. Alla dessa histogram är valfria och endast behövs om de standardrutiner laboratorie kräver dem som kvalitetskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Prov Förvärv och analys
- Använd den automatiska kompensationsprogramvaru guiden av de idéer programvara för att tillämpa en kompensationsmatris till råa bildfiler (RIF) och skapa kompensera avbildade filer (CIF).
- Ladda individuella CIF filer i IDÉER mjukvara och generera följande tomter att identifiera de granulocyter undergrupper: Upprätta inledande grindar för att identifiera de celler som ansågs vara i fokus med ett histogram för ljusa fält lutning RMS (Figur 2A). Gör denna bestämning för varje patientprov med hjälp av ostimulerade kontrollen som referensstandard.
- Använd sekundära tomter till separata sing celler från skräp och dubbletter med hjälp av en punktdiagram av ljusa förhållande fältbild (förhållandet mellan cellhöjd kontra bredd) vs ljusa fält område (Figur 2B). Gör denna bestämning för varje patientprov med hjälp av ostimulerade kontrollen som referensstandard.
- När en ren population av celler hade identifierats, upprätta ett punktdiagram över CD45 vs. CD66b (figur 2C) att positivt identifiera granulocyter (CD45 + / 66b +). Skapa en dotter plot (Figur 3) av ljusa detaljintensitet för S. aureus (x-axel) kontra ljus detalj intensitet för oxidativt utbrott (DHE, y-axeln) för att identifiera undergrupper av aktiverade granulocyter. Samla bright fält bilder i kanal 1 och 9, biopartiklar i Kanal 2, DHE i Channel 4, 7AAD i Kanal 5, CD66b i Kanal 11, och CD45 i Kanal 12.
Figur 2. Analys Mall. Denna siffra den serie av tomter som genere att identifiera celler som var i fokus (A), enstaka celler (B), granulocyter (C). Ytterligare tomter användes för att identifiera de tre undergrupper av aktiverade granulocyter vs. inaktiva granulocyter. All analys av förvärvade bildfiler fördes med hjälp av IDÉER v.6 mjukvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Använda bildbaserad flödescytometri tillät oss att skilja en homogen population av aktiverade granulocyter i tre olika aktiveringsgrupper (Figur 3). I denna metod för att det mest effektiva sättet att lösa de tre aktiveringsgrupper är genom att plotta ljusa detaljnivån för fagocytos (S. aureus) vs. oxidativ burst (DHE) (Figur 3; Figur 4). Dessutom kommer användningen av samlokaliseringen guiden i IDÉER mjukvaran tillåta för kvantifiering av närvaron av samtidig fagocytos och oxidativt utbrott, vilket är ett kännetecken tecken på starkt aktiverade granulocyter.
Figur 3. Identifiering av aktiverade granulocyter Subsets. Efter identifiering av granulocyter använder cellytan markörer (CD45 + / 66b +), var en dotter tomt genereras med ljusa detaljer intenfald för fagocytos vs. ljusa detaljintensitet för oxidativ burst. Med hjälp av denna metod, andelen inaktiva (lila), lågaktivt (röd, A), måttlig aktiv (blå, B), och hög aktiv (gul, C) granulocyter bestämdes. Denna gating teknik användes också för att utvärdera effekten av analys inkubationstid på den relativa förekomsten av de olika aktiverade granulocyter delmängder. Den högsta andelen "hög-aktiv" granulocyter var närvarande efter 40 min inkubation. All analys av förvärvade bildfiler fördes med hjälp av IDÉER v.6 mjukvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förutom att påvisa närvaron av tre distinkta undergrupper av aktiverade granulocyter, visades det att analys inkubationstiden påverkade den relativa förekomsten av varje aktiverade granulocyter delmängd. Specifikt 40 min inklubation ledde den största andelen "hög-aktiv" granulocyter. Genom att inkludera minst tre analys inkubation löptider kan det vara möjligt att avgöra hur en given klinisk behandling förändrar tidsaktiveringsstatus granulocyter. Detta är den första publicerade metoden använder bildbaserad flödescytometri att identifiera olika aktiverade granulocyter undergrupper som en funktion av samtidiga mätningar av fagocytos och oxidativ burst.
Figur 4. Representativa Images of Cellular Markers. En bild galleri av celler betecknas som hög-aktiv (A), måttlig aktiv (B), och låg aktiv (C) presenteras i denna siffra. S.aureus biopartiklar är i Ch03 är oxidativt utbrott i Ch04, 7AAD för kärnan är i Ch05, sidospridning är i Ch06, CD66b är iCh11, och CD45 är i CH12. Dessutom är en samlokaliserade merge bild av fagocytos (Ch03) vs oxidativ burst (Ch04) visas. Områden av gult i merge bilden beteckna att fagocytos och oxidativ burst förekommer i samma anatomiska utrymmet samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den nuvarande metoden innebär en förfining av befintliga metoder för bedömning av granulocyt funktion med hjälp flödescytometri 1,3,4,12-14. De kritiska stegen i denna analys tenderar att vara relaterade till korrekt blandning av blodprovet med biopartiklar och DHE. Ofullständig blandning kommer att resultera i felaktiga resultat. Medan fullständig blandning är kritisk, bör blandningsmetoden vara varsam i naturen. Det föreslås att blandning åstadkommas med användning av en elektronisk pipett med en blandningsfunktion snarare än en virvelblandare. Ett annat kritiskt steg i analysen är att alltid se till att det inte finns något blod förorena den övre halvan av analysröret. Denna resterande blod kan tas bort med en steril bomullspinne. Fullständigt avlägsnande är viktigt eftersom underlåtenhet att göra detta kan kontaminera det slutliga analys beredningen med un-lyserade röda blodkroppar.
Innan du använder den här metoden lämpliga kontroller ersättning bör läggas att kontrollera för spectral överlappning mellan de reagens som används för att identifiera de olika aspekterna av granulocyt funktion. För denna metod, kontroller ersättnings involverar samla blodprov som har föreslagits i 40 min analys inkubation och därefter märkning med en enda markör (dvs, E. coli, DHE, etc.). Efter märkning, är enstaka positiva händelser samlas in och en kompensationsmatris genereras med hjälp av en automatiserad guiden i IDÉER analysprogram. Det är viktigt att om denna analys används är lämpliga kontroller ersättning kompletteras för att säkerställa att analysen fungerar.
Analys sker med hjälp av funktionen finder och co-lokalisering guider för att identifiera att ljusa detaljnivån är den bästa variabeln att separera befolkningen och även identifiera hur mycket överlappning finns mellan oxidativ brast och fagocytos signaler. Det är särskilt användningen av bildbaserad cytometri förutsatt förmågan att segregera aktiverade granulocyter i tre undergrupper. Thans delmängd fördelning bestämdes med hjälp ljusa detaljintensitet fagocytos vs oxidativ burst. Förutom att undersöka dessa singular cellfunktioner, celler som uppvisade båda händelserna samtidigt i samma anatomiska läge (samlokalisering) identifieras. Granulocyter som föll in i "high-aktiv" delmängd var den enda fenotyp som visade konsekvent samlokalisering mellan fagocytos och oxidativ burst. Denna identifiering av aktiverade granulocyter delmängder är det största området där felsökning behövs. Det är mycket viktigt för en ny användare att ta tid att förstå provprocessen arbetsflödet i idéer och att förstå mekaniken i grinda cellpopulationer med hjälp av bildkomponent. Andra ändringar som en användare kan försöka göra inkluderar val av alternativa eller kompletterande analys inkubationstider. Den nuvarande metoden föreslår användningen av varaktigheter av 10 till 40 min; dock beroende på den experimentella modellen där denna metod ärsom skall användas, kan det vara nödvändigt att välja längre analys löptider. En sådan ändring skulle behöva utvärderas på individuell basis.
Vidare bestämdes att varaktigheten av analys inkubation har en betydande inverkan på utseendet på de tre aktiverade delmängder. Den strategi som beskrivs i denna rapport utgör en förlängning av vilken information kunde tidigare erhållna beträffande granulocyt funktion 3,4,13,15. Andra laboratorier har visat på vikten av att bedöma förändringar i granulocyt funktion som en del av en övergripande bedömning av immunitet och sjukdom 15-17. Trots potentialen i denna analys är det inte utan begränsningar. En av de största begränsningarna är kostnad och tid efterfrågan förknippad med hög provgenomströmning. När en studiedesign kräver ett stort antal prov i en viss dag, kan dessa vara svåra att bearbeta. Bearbetning rationaliseras genom användning av elektroniska pipetter och automater,men dessa tenderar att vara dyra och är inte alltid tillgängliga på alla laboratorium.
Vår forskningsområde fokuserar på en studie av hur motion och kostvanor påverkar immunsystemet hälsa och fungera 6,8-10,18-20. Sådana mål har betydande praktiska konsekvenser för en rad olika områden av människors hälsa. Bortom studiet av motion och näringsmässiga effekter av fagocytos metoden demonstreras i detta manuskript kan vara användbar i andra områden av klinisk immunologi där övervakningen av fagocytos funktionen är avgörande för behandlingsresultat. Föreliggande analys är den första av många att immunologiska analyser med potential att vara re-uppfunnen av att fördelarna med den unika bildinformation som kan vara kan från en bildbaserad flödescytometer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| S. aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
