Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Protokol til undersøgelse Extinction af konditioneret Fear i Naturligt Cykling hunrotter

Published: February 23, 2015 doi: 10.3791/52202

Abstract

Udryddelse af konditioneret frygt er blevet grundigt undersøgt i mandlige gnavere. For nylig har der været et stigende antal undersøgelser tyder på, at neurale mekanismer for visse adfærdsmæssige opgaver og respons adfærd er forskellige hos kvinder og mænd. Brug af hunner i forskningsundersøgelser kan udgøre en udfordring på grund af variationen af ​​gonadale hormoner under deres østrale cyklus. Denne protokol beskriver veletablerede procedurer, som er nyttige i at undersøge den rolle, som østrogen i frygt udslettelse hukommelse konsolidering i hunrotter. Fase af østrale cyklus og eksogent østrogen administration før udslettelse uddannelse kan påvirke udslettelse tilbagekaldelse 24 timer senere. Den vaginale pensling teknik til østrus fase identifikation beskrives her hjælper undersøgelse og manipulation af naturligt cykling gonadale hormoner. Brugen af ​​denne grundlæggende gnavermodel kan afgrænse de mekanismer, som østrogen kan modulere frygt udslettelse hukommelse ikvinder.

Introduction

Iboende kønsforskelle observeres på tværs af forskellige kognitive adfærd og læring paradigmer i både mennesker og gnavere. For eksempel er det blevet rapporteret, at kvinder generelt har stærkere verbale og detalje-orienterede evner, mens mænd har bedre rumlige evner 1-3. Disse kønsforskelle kan skyldes til dels indflydelse gonadale hormoner. Høje estradiolniveauer forbedre ydeevnen på opgaver, hvor kvinder er bedre, men forværre præstationer på opgaver, som mænd typisk gør godt 4-6. Selv om denne dokumentation er overbevisende, den begrænsede evne til helt at kontrollere eksperimentelle miljøer i humane studier gør det vanskeligt at afgøre, om disse effekter på adfærd kan tilskrives specifikt til hormoner. Dyreforsøg derimod give mulighed for fuldt kontrollerede forhold.

Selv om de grundlæggende neurale mekanismer frygt udslettelse er blevet identificeret og er godt undersøgt hos mænd, er det uklart, omdisse systemer er de samme hos kvinder, eller hvordan de ændrer hele østrale cyklus. Frygt condition og udslettelse er meget udbredt adfærdsmæssige paradigmer hos gnavere og mennesker til at foretage undersøgelser i forbindelse med angst. Da kvinder har en højere risiko for angst, samt højere symptom varighed og sværhedsgrad 7-13, er det afgørende at inddrage kvinder i disse undersøgelser. Underrepræsentationen af ​​kvinder i denne forskning kan tilskrives de udfordringer, østrus fase overvågning og bogføring for de adfærdsmæssige effekter af kønshormoner. Laboratorier, der gør undersøge kvinder i den forbindelse oplever problemer, der ofte går urapporteret eller ikke er beskrevet i metoderne til deres studier.

Nye beviser i gnavere tyder på, at kønsforskelle i frygt udslettelse moduleres af gonadale hormoner 14-18. I frygt conditioning dyrene trænes til at frygte en bestemt stimulus. Efter en række uarmerede præsentationer afstimulus, lære dyrene ikke at frygte cue, en proces, der kaldes udryddelse. Hvor godt dyret lærer og konsoliderer mindet om at lære denne opgave kan observeres under en udslettelse tilbagekaldelse test givet nogen tid efter slukning træning. Mindre frygt udtryk under udslettelse tilbagekaldelse demonstrerer god udslettelse hukommelse konsolidering. Nylige resultater fra vores laboratorium tyder på, at østrogen kan modulere konsolideringen af ​​frygt udslettelse hukommelse og forbedre udslettelse tilbagekaldelse. Konkret hunrotter, der slukkes i proøstrus, den fase af østrale cyklus, i hvilken cirkulerende østrogenniveau peak, udviser forbedret fastholdelse af udryddelse hukommelse. Derimod hunner, der slukkes i lav-østrogen metestrus fase display den relativt dårlige udslettelse tilbagekaldelse, som kan forbedres med eksogen estradiol administration før eller umiddelbart efter udslettelse træning 15,16. De neurale mekanismer udslettelse hukommelse konsolidering (inkluding rolle gonadale hormoner) hos kvinder er ikke klare.

I forsøgsdyr, kan den rolle, hormoner undersøges ved hjælp af invasive kirurgiske fjernelse procedurer såsom kastration og ovariektomi. Efter genopretning fra kirurgi, er gonadale hormoner ofte eksogent manipuleres under udførelsen af en adfærdsmæssig opgave 19. Denne fremgangsmåde har givet vigtige oplysninger om kønshormoner og er nyttigt, fordi det giver mulighed for velkontrollerede manipulationer af gonadale hormoner (med hensyn til timing og dosering) 20-23. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke vurdere indflydelsen af ​​de naturligt forekommende udsving, der opstår på tværs af østrale cyklus heller ikke de repræsenterer "normale" dyr, hvilket begrænser den translationelle potentiale til humane studier. Det har været veldokumenteret, at kvindelige kønshormon niveauer peak og nedgang på bestemte faser af østrale cyklus, og østrogen-receptor udtryk ændringer i cyklus,og efter ovariektomi 24. Således er der et behov for at gennemføre undersøgelser på kvinder med intakte gonader og forfine forsøgsdesign til pålideligt studere de virkninger, høje og lave østrogen stater kan have på kvinder i hele deres levetid.

Denne protokol fokuserer på effekten af ​​østrogen på neurobiologiske systemer involveret i frygt udryddelse. Den beskriver, hvordan du: 1) nøje overvåge østrale cyklus, 2) udarbejde effektive doser af østradiol til systemisk administration, og 3) at følge en adfærdsmæssig paradigme, der omfatter frygt conditioning, udslettelse, og huske på naturligt cykle hunrotter. Denne protokol kan ændres med andre farmakologiske manipulationer og cellulære og molekylære værktøjer til at hjælpe undersøgelser for bedre at forstå kønsforskelle, som observeres i konditioneret frygter udslettelse adfærd. Bemærk, at de procedurer, der er beskrevet nedenfor, er dem anvendt i vores laboratorium, og der findes en række variationer af disse procedurer in litteraturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer denne protokol er blevet godkendt af Underudvalget om Research Animal Care, der tjener som Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) til Massachusetts General Hospital, og er i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer.

1. Animalske Boliger og Håndtering Procedure

  1. Ved ankomsten, hus voksen Sprague Dawley hunrotter omkring 8-10 uger gamle (vejer 200-225 g) i grupper på 3-4 tommer plast spande med træflis sengetøj. Bevar dem på en diæt af ad libitum adgang til chow og vand og en 12 timers lys / mørke cyklus. Lad rotter at akklimatisere til boligforhold og dyr facilitet i minimum 1 uge.
    BEMÆRK: Alle procedurer på dette manuskript er gennemført i lyset cyklus.
  2. Efter denne akklimatiseringsperiode håndtere alle dyr i 5 minutter hver 2-3 dage. Korrekt afhente rotter én ad gangen (støttet af torso og ikke af halen)holde dem sikkert, og selskabsdyr dem i denne periode. Håndtag dyr, der vises mere stresset, nervøs eller ængstelig for længere perioder. Gør dette for at minimere håndtering stress, som kan påvirke de følgende skridt i denne protokol.
    BEMÆRK: Antallet af dage, og mængden af ​​tid at håndtere dyrene kan variere mellem forskellige laboratorier; Imidlertid bør disse være i overensstemmelse mellem eksperimenter inden for samme laboratorium.

2. Overvågning af estrale periode: vaginal podning og udtværing Farvningsprocedure

  1. Lav 0,9% saltopløsning (natriumchlorid opløst i destilleret vand). Fugt en bomuld spids applikator i denne opløsning. Dup spidsen ved hjælp af en papirserviet for at undgå overmætning, hvilket kunne føre til utilstrækkelig prøvetagning eller tab af celler. Hold halen opad væk fra skedeåbningen, forsigtigt indsætte vatpinden ind i skeden og rulle rundt på væggene for at fange løse vaginale celler.
  2. Hvis dyret tisser på tremmesengton tip, udskiftes med en ny, som urin forurening vil gøre det vanskeligt for identifikation fase. Vær meget forsigtig for ikke at forårsage nød til dyret under denne procedure, fordi udsættelse for stress vil forstyrre østrale cyklus. Når pensling, sigter mod at nå en hurtig indføring og tilbagetrækning, der ikke er for dybt for at minimere ekstra stimulation på livmoderhalsen, som kan fremkalde pseudodrægtighed.
    BEMÆRK: pseudodrægtighed kan identificeres som en acyklisk estrale periode, der typisk varer omkring 12 dage, dvs. på hinanden følgende dage i diøstrus 25.
  3. Fjern forsigtigt applikatorspidsen og rul det på en pre-mærket objektglas. Undgå at trykke for hårdt ned som for meget væske på diaset kan gøre identifikation fase vanskelig gang tør.
    BEMÆRK: En side kan indeholde flere dage for hvert dyr, selv om dette kan ske i overensstemmelse med individuelle ønsker.
  4. Sørg for, at prøven overførsler på objektglasset. Saml prøver til several på hinanden følgende dage på et dias for at kunne bedre styr og identificere daglige østrus faser ændringer.
    BEMÆRK: Hvis det er muligt, er det også ideelt, hvis de mennesker, indsamling af prøver forbliver de samme for alle dyr.
  5. Når slæden er tør, begynder det farvningsprotokol til identifikation fase. Brug af farvning kit (se tabel Materialer), fordybe dias 10 gange i fiksativ (lyseblå), 10 gange i plet løsning (pink) og 5 gange i kontrastfarve opløsning (lilla). Skyl glider forsigtigt under rindende vand. Lad slides helt lufttørre før visning under mikroskop.
    BEMÆRK: typisk 4-5 dagen lang østrale cyklus består af (i nævnte rækkefølge): estrus (E), metestrus (M), diøstrus (D), og proøstrus (P) 26. Estrus er kendetegnet ved blå, forhornede celler, metestrus af leukocytter og en kombination af forhornede og celler med kerne, diøstrus ligner metestrus i nærvær af celletyper undtagen de er meget sparsomme, og proøstrus af lilla-farvet aggregateraf kerneholdige celler (figur 1). Der er forskellige farvningsprocedurer, ud over dem, der er beskrevet ovenfor, der er lige så effektive til vaginal smear cytologi.
  6. Indsamle prøver i mindst to komplette cyklusser (~ 8-10 dage) for at overvåge faserne præcist forud for eksperimenter. Være i overensstemmelse med tidspunktet på dagen prøveudtagningen. Saml vaginale smear prøver dagligt under og indtil slutningen af ​​eksperimentet.

3. Pre-eksponering

  1. Før start af forsøget, før udsætte dyrene til konditionering kamre, at dyrene kan akklimatisere sig til den kontekst (conditioning kamre), før nogen adfærdsmæssig testning.
    1. Pre-udsætte hunnerne til conditioning kamre (i lyddæmpende bokse) med huset lysene i 20-30 min per dag i 3 dage forud for enhver eksperimenteren. Tildel feltet de er præ-eksponeret for deres kammer for undersøgelsen. Rengør than kasser (vægge og bakker) mellem sessioner og dyr at fjerne lugt, da de kan påvirke adfærd og østrale cyklus.

4. Dag 1: Tilvænning / Fear Conditioning

  1. Når dyrene er blevet verificeret at være i brunst fase af deres Østralperioder, begynde tilvænning / konditionering fase af 3-dages eksperiment.
    1. Tag pre-tone baseline foranstaltninger af frysning før den første tone betinget stimulus (CS) præsentationer på hver dag i forsøget. Gør dette ved at erhverve procent indefrysning score (beregnet ved at dividere sekunderne brugt ubevægelig med varigheden af ​​retssagen, multipliceret med 100) i løbet af stimulus-fraværende tidsinterval ved begyndelsen af ​​den første CS-alone forsøg før CS debut.
      BEMÆRK: kan bruges Disse foranstaltninger til at vurdere og sammenligne baseline frysning niveauer med dem i løbet af tilvænning, konditionering, udslettelse, og tilbagekaldelse.
    2. At gennemføre udslettelse uddannelse under metestrus fasebetingelse rotterne i deres sidste brunst. Swab og identificere østrus fase (trin 2) hver dag, før du starter den eksperimentelle protokol (conditioning / ekstinktion / tilbagekaldelse). Som brunst fase kan vare længere end en dag, så brug cyklus historie forudsige længde faser for at bestemme hvor dyrene er klar til at begynde træningen.
  2. I conditioning kamre, tilslutte mund- chok grid gulv til en elektrisk stimulation generator. Brug en stimulering niveau 0,5-0,6 mA som ubetinget stimulus (US). Brug en 4 kHz, 80 dB tone som betinget stimulus (CS).
    BEMÆRK: Disse parametre kan variere fra laboratorier og kan ændres for optimal konditionering.
    1. Hvis indefrysning analyseprogram kræver visuelle signaler (i modsætning til tidsmæssig), co-aktivere en LED lys med tonen. Placer lys på ydersiden af ​​operant kammer inden videobilledet. Ved starten af ​​hvert forsøg, aktivere LED-lyset og holde det belyst indtil udgangen af ​​the retssag.
      BEMÆRK: Dette lys er ikke synligt ved dyret, og tjener kun som en markør for initiering og afslutning af forsøget inden de optagede videofiler (anvendes til at måle frysning adfærd).
  3. Placer dyrene i conditioning kamre til 5 CS-alone forsøg på tilvænning. Umiddelbart efter tilvænning session, udføre 7 parrede CS-amerikanske forsøg med frygt condition. Sørg for, at CS tonen varer 30 sek og coterminates med 0,5 sek amerikanske stød. Kør forsøg i alle sessioner (tilvænning, konditionering, udslettelse, og husker) med en variabel interforsøgsinterval gennemsnit 3 minutter.
  4. Ved udgangen af ​​conditioning session vende dyrene til deres bure og dyreanlægget indtil den næste dag.

5. Dag 2: Estradiol Forberedelse

  1. Swab og identificere estrale fase for alle dyr, der undergik Dag 1 i denne protokol. Forbered estradiol (også kendt som E2, 17beta-estradiol, ellerbeta-østradiol) til 15 ug / kg dosis subkutan injektion ved hjælp af sesamolie eller 0,9% saltvand som bærer.
  2. For at beregne mængden af ​​estradiol at forberede injektioner, skal du bruge kropsvægt alle dyr, som blev målt og registreret, når de blev konditioneret på dag 1 i denne protokol.
  3. Foretag beregninger at standardisere den administrerede mængde estradiol (dvs. 0,2 ml) pr rotte. Da estradiol er vanskeligt at opløse grund af sin vanduopløselighed og kræver en stor mængde opløsningsmiddel for lille dosis, fremstilles en stamopløsning ved at blande østradiol i sesamolie over varme indtil opløsning. Opløsningen kan derefter ledes gennem et 0,22 um filter til fjernelse af forurenende stoffer. For eksempel tilsættes en beregnet mængde af en 3.000 ug estradiol / 1 ml sesamolie stamopløsning til den samlede nødvendige mængde af sesamolie med henblik på at opnå en 15 ug / kg dosis i 0,2 ml injektionsvolumen pr dyr.
    BEMÆRK: Du kan også bruge andre former for østrogen tha t er vandopløselige og lettere at opløse.

6. Dag 2: Estradiol Administration / Extinction Træning

  1. Indgiv estradiol subkutant. Løft det løse skind mellem skulderbladet ved halsen i en blid knivspids og indsæt kanylen ind i trekanten, der dannes af hudfolder.
  2. 30 minutter efter subkutane injektioner af estradiol, placere dyrene i conditioning kamre igen og begynde udslettelse uddannelse. I denne udslettelse session, udføre 20 CS-alone forsøg, hvor hvert forsøg, der består af en 30 sek, 4 kHz, 80 dB tone, præsenteret på en variabel interforsøgsinterval gennemsnitligt 3 min.
    BEMÆRK: Effekten af ​​estradiol på tilbagekaldelse opstår, når estradiol administreres før udslettelse uddannelse eller umiddelbart efter udryddelse. Effekten er ikke observeret 4 timer efter slukning, så det anbefales at injicere tæt i tid til begyndelsen eller slutningen af træningen 15.
. le "> 7 Dag 3: Extinction Recall

  1. 24 timer efter uddøen træning, svaber de dyr, der afsluttede dag 1 og 2 i denne protokol.
  2. Placer dyrene i deres tildelte conditioning kamre (samme som dag 1 og 2). Begynd udslettelse tilbagekaldelse session ved at præsentere 3 CS-alone forsøg (tre forsøg med udslettelse husker), som består af kun 3,80 dB CS-alone forsøg med interforsøgsinterval intervaller svarende til 20 forsøg administreret til udslettelse uddannelse, som beskrevet i trin 6.2.
  3. Ved afslutningen af ​​tilbagekaldelsen session returnere dyrene til deres hjem bure.

8. Data Analysis

  1. Anskaf adfærdsmæssige data gennem video og analysere dem ved hjælp af computersoftware.
    BEMÆRK: Frysning scoringer kan også manuelt tælles af en eksperimentator, der er blind for lægemiddelbehandling ved timing indefrysning anfald under CS præsentationen af ​​hvert forsøg, udtrykt i procent af den tid, frysning under tone. Nedfrysning erdefineret ved fuldstændig mangel på bevægelse med undtagelse af vejrtrækning under de 30 sek CS-amerikanske forsøg. Beregn procent frysning ved at dividere sekunderne brugt frysning (immobile) med 30 sekunder (varighed af forsøget) ganget med 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne frygt udslettelse tilbagekaldelse protokol blev procent frysning målt som en indikator for frygt. Dyr, der slukkes godt og tilbageholdes mindet om udslettelse uddannelse udviste lav frygt på den sidste dag i den adfærdsmæssige test under udslettelse tilbagekaldelse. Han- og hunrotter ikke afviger væsentligt i konditioneret frygt udtryk under conditioning, udslettelse, og huske faser (figur 2). Imidlertid bliver en kønsforskel tydeligt, når dyrene analyseres separat som højt og lavt østrogen østrus fase grupper. Hunrotter, som undergår udslettelse uddannelse under den lave østrogen metestrus fase af østrale cyklus ikke husker udslettelse hukommelse på dag 3, samt de trænet i proøstrus (figur 3). Disse metestrus hunner udviser også signifikant større frygt opsving under udslettelse tilbagekaldelse (dårlig udslettelse hukommelse) i forhold til mænd. Men når metestrus hunner er subkutant injecTed med a / kg dosis estradiol før udslettelse læring 15 ug, vises konsolidering af frygt udslettelse hukommelse, der skal styrkes, hvilket fremgår af lav frysning under udslettelse tilbagekaldelse (figur 4). Derfor er disse data indikerer, at gonadale hormoner kan modulere frygt udslettelse tilbagekaldelse og også medierer kønsforskelle i konditioneret frygt ekstinktion adfærd.

Figur 1
Figur 1: Repræsentative billeder af celletyper tværs brunst cyklus faser (forstørrelse 20X) proøstrus er kendetegnet ved masser af runde, lilla-farvede kerneholdige epitelceller.. Brunst kan identificeres ved aggregater af blåfarvede, skællede forhornede celler. Metestrus og diøstrus udtrykke en kombination af celletyper (leukocytter, kerneholdige og forhornede celler), men viser færre celler. Østrogen niveauer svinger hele østrus faserOg toppede under proøstrus. (Met = metestrus;.. Diest = diøstrus;. Proest = proøstrus). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Sammenligning mellem mænd og kvinder på tværs af de tre faser i forsøget Der er ingen signifikante kønsforskelle observeret i tilvænning (. Hab), konditionering (. Cond), udslettelse, eller huske faser i forsøget 15.

Figur 3
Figur 3: Behavioral forskelle mellem proestrus (høj østrogen) og metestrus (lav østrogen) Hundyr i high-østrogen proøstrus fase o.f den østrale cyklus udviser mindre frygt end i lav-østrogen metestrus. Disse data tyder på, at østrogen niveauer i naturligt cykling hunner kan påvirke konsolideringen af frygt udslettelse hukommelse, modulerende tilbagekaldelse 24 timer senere 15.

Figur 4
Figur 4: østrogenbehandling i metestrus hunner. Administration af estradiol 30 min før udslettelse uddannelse (pil) letter udslettelse tilbagekaldelse i forhold til køretøjet 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frygt udslettelse er blevet nøje undersøgt i hanrotter med de neurale mekanismer medierende betinget frygt udslettelse identificeres og vurderes under forskellige manipulationer. Relativt få studier har undersøgt hunrotter eller rolle gonadale hormoner i frygt udryddelse. Til specifikt at undersøge virkningerne af østrogen på frygt udryddelse, er naturligt cykler hunrotter udsat for en tre-dages adfærdsmæssige paradigme. Denne procedure består af tilvænning / condition, udryddelse, og udslettelse tilbagekaldelse faser. Ved hjælp af denne protokol, er det blevet påvist, at hunrotter trænet med udslettelse under den lave østrogen metestrus fase udviser højere frysning (eller forringet udslettelse tilbagekaldelse) sammenlignet med kvinder, der er slukkes i høj østrogen proøstrus 15. Administration af estradiol inden udslettelse uddannelse under metestrus fase modulerer konsolidering af udryddelse hukommelse 16. Det viser et fald i freezing under udslettelse tilbagekaldelse. Sammen fremhæve disse resultater vigtigheden af ​​at gennemføre kvindelige undersøgelser med vægt på den indflydelse æggestokkene hormoner og østrale cyklus på adfærd. Selv kontrolforsøg ikke er blevet beskrevet her, vil det være nødvendigt at medtage passende kontrol, dvs. ingen ekstinktions grupper yderligere at vurdere indflydelsen af østrogen på processer, der er involveret i udryddelse hukommelse konsolidering.

Formålet med denne protokol er dobbelt: 1) at undersøge virkningerne af østrogen på betinget frygt udslettelse under bestemte faser af østrale cyklus i intakte dyr, og 2) at undersøge, hvordan akut estradiol udskiftning i hunnens normalt lav østrogen tilstand kan modulere sin opførsel. Gennem vaginal pensling procedure der er beskrevet her, kan identificeres fire faser af østrale cyklus: brunst, metestrus, diøstrus og proøstrus. Dette giver os mulighed for at vurdere adfærd, når æggestokkene hormoner suCH østrogen er naturligvis ved lave og høje koncentrationer. For eksempel østrogen niveauer er lave i løbet af estrus (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), og diøstrus (25-40 pg / ml) faser, men høj i proøstrus (~ 75 pg / ml) fase af estrale periode 27,28. Disse faser ikke kun adskiller sig hormonale miljø, men også i varighed. Selvom variable er proøstrus været typisk observeret at vare i 12 til 14 timer; brunst for 25.-27 timer; metestrus i 6 til 8 timer; og diøstrus for 55-57 timer. Varigheden af ​​hver fase kan være længere eller kortere end en dag (afhængig af dyret), hvilket fører til 5-dages perioder, der omfatter 2 dages enten diøstrus eller brunst. Som nævnt, proøstrus og metestrus er kortere faser (12-14 og 6-8 time, henholdsvis) og kan gå glip af. I denne protokol, er det derfor afgørende for nøje at overvåge østrale cyklus ved brug af dyrets naturlige cykler hormoner til at undersøge forskelle mellem fase i evnen til at huske udslettelse uddannelsefra dagen før. Den østrale cyklus i hunrotter, ligesom den menneskelige menstruationscyklus, er også følsomme over for en lang række eksterne faktorer, såsom alder, stress, tid på dagen, boligforhold, temperatur, etc., og bør overvejes, når man planlægger eksperimenter. Et dyr kan blive acycliske (udvidet estrus / diøstrus) eller vise en uregelmæssig cyklus (kortere end 4 dage eller længere end 5 dage) før eller i løbet af undersøgelsen. I dette tilfælde ville disse dyr udelukkes fra de eksperimentelle analyser, er streng til afprøvning i bestemte faser af østrale cyklus. Vigtigt at bemærke er stadier overgangen hvorunder prøverne er blandet med slim, hvilket gør det lidt vanskeligt klart at identificere de specifikke celletyper, der karakteriserer hver fase. Dette kan også være på grund af tidspunktet på dagen vatpinden træffes. Hvis der er en stor mængde af slim-lignende udledning under smear samling som følge af daglig pensling, så flere behandlinger dage at passere uden penslingkan løse dette problem.

Ud over den østrus identifikationsfasen her beskrevne fremgangsmåde, kan andre metodologiske værktøjer anvendes til opnåelse af foranstaltninger af cirkulerende serum æggestokkene hormonkoncentrationer. For eksempel kan østrogen koncentrationen kvantificeres i blodprøver under anvendelse af et enzymbundet immunsorbentassay (ELISA). I denne procedure, østrogener i serum / plasma prøver at binde til et specifikt anti-østrogen antistof, der er bundet til et enzym. Enzymets substrat frembringer en reaktion, der resulterer i et synligt signal, såsom en farveændring, der kan måles ved anvendelse af et spektrofotometer. Dette værktøj beregner absorbans og giver en kvantificering af østrogen niveauer i prøven. Denne metode kan være nyttige ved vurderingen naturligt svingende østradiolniveauer over østrale cyklus, og endnu vigtigere, på bestemte tidspunkter i løbet af forsøget. Det kan også anvendes til at bestemme, hvordan exogen administration af østrogen kan ændre normAL fysiologiske koncentrationer. Måling af østrogen koncentrationer fra blod kan forhindre problemer med identifikation fase under etaper overgangseffekter, eller når udstrygninger er vanskelige at læse på grund af slim i prøverne. Desværre kan denne metode blive ganske dyrt og tilbyder forsinkede resultater i forhold til vaginal smear samling.

Procedurer for at få prøver tilstrækkeligt blod, fx. Via halevenen, orbital sinus, hale klip, og saphenavene 29, kan forårsage unødig stress til dyret. Dette kan påvirke hormonniveauer på kritiske tidspunkter i forsøget, hvilket fører til unøjagtige eller skæve målinger. Brug trunk blod til at måle østradiolniveauer er terminal og giver derfor meget begrænsede oplysninger om hormonelle udsving inden faserne. Vurdering vaginal celle cytologi synes at tilbyde et bedre alternativ. Selv om denne metode kun kan give et groft skøn over æggestokkene hormon profiler på tværs af brunst faser, kan detminimere stress og efterfølgende mindre forstyrrende for den adfærdsmæssige eksperiment.

Der er forskellige former for østrogene steroider, som er naturligt cirkulerer i mennesker og ikke-humane dyr, såsom estriol, estradiol og estron. I denne protokol, er østradiol akut administreret via subkutan injektion. Estradiol (synonymt med E2, 17beta-estradiol eller beta-østradiol) anvendes i denne protokol, fordi det er den mest potente form af naturligt forekommende østrogen i ikke-drægtige hunner 30. I modsætning til akut injektioner af estradiol har andre laboratorier, metoder til kronisk administration af østrogen. For eksempel subkutane implantater med langsom frigivelse pellets eller silastikkapsler mulighed for stabil, kontinuerlig levering af østrogen eller vehikelopløsning 19. Denne procedure anvendes typisk i forbindelse med ovariectomies, der fjerner dyrets naturlige reproduktive tilstand.

Den manipuninger diskuteres her fokuserer på naturlige hormonelle stater til at lette den kliniske anvendelse af laboratoriefund. Personer med post-traumatisk stress disorder (PTSD) er almindeligt svækket i deres evne til at slukke frygt for en stimulus relateret til deres traumatiske erfaringer og at huske denne udryddelse. Denne betingelse ofte fortsætter længe efter begivenheden er gået. Langvarig eksponering terapi er en fælles behandlingsmulighed for PTSD, der er afhængig af læste i gnavermodeller som den her beskrevne extinction-baserede processer. Interessant, er nogenlunde dobbelt så stor sandsynlighed som mænd til at udvikle stress og angst-relaterede psykiatriske lidelser 31 kvinder. Denne kønsforskel i forekomsten kan være forbundet med kønsforskelle i frygt extinction processer og ligger til grund for potentielle kliniske betydning af disse laboratoriefund. På trods af den højere forekomst af PTSD hos kvinder, relativt få frygter extinction studier i gnavere er blevet udført hos kvinder. Kvindelige undersøgelser fokuserergigt af den rolle, gonadale hormoner ikke bør overses ved undersøgelsen kønsforskelle i adfærd. Karakterisere de adfærdsmæssige virkninger af naturligt svingende hormon niveauer på tværs af østrale cyklus giver værdifuld indsigt i de grundlæggende forskelle i adfærd mellem hanner og hunner. Denne protokol giver en grundlæggende model til at lette fremtidige studier af æggestokkene hormoner og deres indflydelse på, men ikke begrænset til, kognitive og adfærdsmæssige processer såsom frygt udryddelse. Denne protokol fokuserer på en specifik gonadal hormon, østrogen, men virkningerne af andre hormoner såsom progesteron og testosteron kan også evalueres. Brug af adfærdsmæssige paradigme præsenteres her sammen med andre farmakologiske, cellulære og molekylære teknikker (dvs. lokaliserede lægemiddelinfusioner, immunhistokemi, Western blot), fremtidig forskning kan identificere specifikke sites / mål for østrogen handling i hjernen, der kan forstærke adfærdsterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne af dette manuskript har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fear conditioning chamber Coulbourn Instruments
Graphic State Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box Med Associates, Inc. NIR-022MD
Estradiol Sigma-Aldrich E1024 In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-250ML
Freezescan Cleversys, Inc.
Dip quick stain Jorgensen Laboratories, Inc. J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-114 6-inch, sterile
0.9% saline LabChem, Inc. LC23460-2 Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-003
Virex II 256 Diversey, Inc. 5019317 Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes Becton Dickinson 309628
Hypodermic disposable needles Exelint International, Co. 26402 26-gauge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
  2. Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
  3. Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
  4. Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
  5. Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
  6. Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
  7. Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
  8. Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
  9. Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
  10. Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
  11. Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
  12. Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
  13. Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
  14. Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
  15. Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
  16. Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
  17. Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
  18. Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
  19. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
  20. Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
  21. Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
  22. Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
  23. Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
  24. Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
  25. Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
  26. Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
  29. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
  30. Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
  31. Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).

Tags

Behavior østrogen frygter udslettelse kønsforskelle estradiol proøstrus metestrus kvindelig PTSD angst
Protokol til undersøgelse Extinction af konditioneret Fear i Naturligt Cykling hunrotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeng, L. Y., Cover, K. K., Landau,More

Maeng, L. Y., Cover, K. K., Landau, A. J., Milad, M. R., Lebron-Milad, K. Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats. J. Vis. Exp. (96), e52202, doi:10.3791/52202 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter