Abstract
Estinzione della paura condizionata è stata ampiamente studiata nei roditori maschi. Recentemente, ci sono stati un numero crescente di studi che indicano che i meccanismi neurali per determinati compiti comportamentali e comportamenti di risposta sono diversi in femmine e maschi. Utilizzando femmine in studi di ricerca può rappresentare una sfida a causa della variazione di ormoni gonadici durante il loro ciclo estrale. Questo protocollo descrive le procedure consolidate che sono utili nelle indagini il ruolo degli estrogeni nella paura consolidamento della memoria estinzione nei ratti femmina. Fase del ciclo estrale e somministrazione di estrogeni esogeni prima formazione all'estinzione può influenzare richiamo estinzione 24 ore più tardi. La tecnica swabbing vaginale per l'identificazione fase estrale descritto favorisce l'esame e la manipolazione di ciclismo naturalmente ormoni gonadici. L'utilizzo di questo modello di roditore di base può ulteriormente delineare i meccanismi attraverso i quali gli estrogeni possono modulare paura memoria estinzionefemmine.
Introduction
Differenze di sesso inerenti si osservano in vari comportamenti cognitivi e paradigmi di apprendimento in entrambi gli esseri umani e roditori. Ad esempio, è stato riportato che le donne hanno generalmente abilità verbali e orientato al dettaglio più forti, mentre gli uomini hanno migliori abilità spaziali 1-3. Queste differenze di sesso può essere dovuto in parte l'influenza degli ormoni gonadici. Alti livelli di estradiolo migliorare le prestazioni in compiti in cui le donne sono migliori, ma peggiorano le prestazioni in compiti che gli uomini in genere fanno bene 4-6. Anche se questa prova è convincente, la limitata capacità di controllare completamente gli ambienti sperimentali in studi sull'uomo rende difficile determinare se questi effetti sul comportamento possono essere attribuiti specificamente agli ormoni. Gli studi su animali, al contrario, permettono di circostanze completamente controllate.
Anche se i meccanismi neurali di base della paura dell'estinzione sono stati identificati e sono ben studiata nei maschi, non è chiaro sequesti sistemi sono gli stessi nelle femmine o come cambiano in tutto il ciclo estrale. La paura condizionata ed estinzione sono ampiamente utilizzati paradigmi comportamentali nei roditori e nell'uomo per condurre studi in materia di disturbi d'ansia. Dato che le donne hanno un rischio più elevato per i disturbi d'ansia e maggiore durata dei sintomi e la gravità 7-13, è fondamentale per comprendere le femmine in questi studi. La sottorappresentazione delle donne in questa ricerca può essere attribuita alle sfide del monitoraggio fase estrale e contabile per gli effetti comportamentali degli ormoni sessuali. I laboratori che fanno esaminare le femmine a questo proposito le questioni di incontro che spesso vanno non dichiarata o non sono descritte nei metodi per i loro studi.
Emergenti prove in roditori suggeriscono che le differenze di sesso nella paura di estinzione sono modulati dagli ormoni gonadici 14-18. In condizionamento alla paura, gli animali vengono addestrati a temere uno stimolo particolare. Dopo una serie di presentazioni di non rinforzatilo stimolo, gli animali imparano a non temere la stecca, un processo chiamato di estinzione. Quanto bene apprende l'animale e consolida il ricordo di imparare questa attività si può osservare nel corso di un test di richiamo di estinzione dato qualche tempo dopo la formazione di estinzione. Espressione paura Meno durante il richiamo estinzione dimostra buon consolidamento della memoria estinzione. Recenti scoperte dal nostro laboratorio indicano che gli estrogeni possono modulare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione e migliorare richiamo estinzione. In particolare, i topi femmina che si estinguono proestrus, la fase del ciclo estrale durante il quale livelli circolanti di estrogeni picco, mostra una maggiore ritenzione della memoria estinzione. Al contrario, le donne che sono estinte nel basso-estrogeno visualizzazione della fase metestrus relativamente scarsa memoria di estinzione, che possono essere migliorati con la somministrazione di estradiolo esogeno prima o immediatamente dopo l'estinzione allenamento 15,16. I meccanismi neurali di consolidamento della memoria di estinzione (inclUding il ruolo degli ormoni gonadici) nelle donne non sono chiare.
Negli animali da laboratorio, il ruolo degli ormoni può essere indagato utilizzando invasive procedure di rimozione chirurgiche come la castrazione e ovariectomia. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, ormoni gonadici sono spesso esogena manipolati durante l'esecuzione di un compito comportamentale 19. Questo approccio ha fornito informazioni critiche su ormoni sessuali ed è utile perché permette di manipolazioni ben controllati di ormoni gonadici (in termini di tempi e di dose) 20-23. Questo approccio, tuttavia, non valutare l'influenza delle fluttuazioni naturali che si verificano nel corso del ciclo estrale non rappresentano animali "normali", limitando così il potenziale traslazionale per studi sull'uomo. E 'stato ben documentato che i livelli di ormone sessuale femminile picco e il declino a specifiche fasi del ciclo estrale, e cambiamenti di espressione dei recettori degli estrogeni all'interno del ciclo,e dopo ovariectomia 24. Quindi, vi è la necessità di condurre studi su femmine con gonadi intatti e perfezionare progetti sperimentali per studiare in modo affidabile gli effetti che gli stati alti e bassi di estrogeni possono avere su donne in tutta la loro durata di vita.
Questo protocollo concentra sull'effetto degli estrogeni sui sistemi neurobiologici coinvolti nella paura estinzione. Si descrive come: 1) monitorare attentamente il ciclo estrale, 2) preparare le dosi efficaci di estradiolo per somministrazione sistemica, e 3) seguire un paradigma comportamentale che include condizionamento alla paura, l'estinzione, e richiamare in modo naturale in bicicletta ratti femmina. Questo protocollo può essere modificato con altre manipolazioni farmacologiche e strumenti molecolari e cellulari per aiutare gli studi per capire meglio le differenze di sesso che si osservano in condizionato temere comportamento estinzione. Si noti che le procedure descritte qui sotto sono quelli utilizzati nel nostro laboratorio, ed esistono un certo numero di varianti di queste procedure in letteratura.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dalla sottocommissione per la ricerca cura degli animali, che serve come la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) per il Massachusetts General Hospital, e sono in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute.
1. Animal Housing e procedura Handling
- All'arrivo, casa adulti Sprague Dawley femmine circa 8-10 settimane di età (del peso di 200-225 g) in gruppi di bidoni di plastica 3-4 pollici con biancheria da letto di cippato. A mantenere una dieta ad libitum accesso a Chow e acqua e un 12 hr luce / buio ciclo. Lasciare ratti per ambientarsi alla condizioni abitative e animali struttura per un minimo di 1 settimana.
NOTA: Tutte le procedure di questo manoscritto sono condotti durante il ciclo di luce. - In seguito a questo periodo di acclimatazione, di gestire tutti gli animali per 5 minuti ciascuno per 2-3 giorni. Correttamente prendere i topi uno alla volta (sostenuto dal torso e non per la coda),tenerli saldamente, e li animali durante questo tempo. Maneggiare animali che appaiono più stressati, nervosi, ansiosi o per periodi di tempo più lunghi. Fate questo per ridurre al minimo la manipolazione dello stress, che possono incidere sui seguenti operazioni in questo protocollo.
NOTA: Il numero di giorni e la quantità di gestire gli animali può variare tra i diversi laboratori di tempo; tuttavia, questi dovrebbero essere coerenti tra esperimenti all'interno dello stesso laboratorio.
2. Monitoraggio del ciclo estrale: tamponi vaginali sbavature e Procedura di colorazione
- Preparare la soluzione salina allo 0,9% (cloruro di sodio sciolto in acqua distillata). Inumidire un cotton fioc in questa soluzione. Asciugare la punta con un tovagliolo di carta per evitare di sovrasaturazione, che potrebbe portare il campionario inadeguata o la perdita di cellule. Tenendo la coda verso l'alto dalla apertura vaginale, inserire delicatamente la punta di cotone nel canale vaginale e tirare intorno alle mura di catturare le cellule vaginali sciolti.
- Se l'animale urina sul lettinoTip Ton, sostituirlo con uno nuovo, come la contaminazione delle urine sarà difficile per l'identificazione di fase. Fare molta attenzione per non causare disagi all'animale durante questa procedura, perché l'esposizione allo stress sarà interrompere il ciclo estrale. Quando tampone, mirare a raggiungere un inserimento rapido e il ritiro che non sia troppo profonda da ridurre al minimo stimolo in più per la cervice, che può indurre pseudogravidanza.
NOTA: Pseudopregnancy può essere identificato come un ciclo estrale aciclico che in genere dura per circa 12 giorni, cioè giorni consecutivi di diestrus 25. - Rimuovere con attenzione la punta dell'applicatore e rotolare su un vetrino da microscopio pre-etichettati. Evitare premendo troppo duro come troppo liquido sul vetrino può rendere l'identificazione fase difficile, una volta asciutta.
NOTA: Una diapositiva può contenere più giorni per ogni animale, anche se questo può essere fatto in base alle preferenze individuali. - Assicurarsi che i trasferimenti del campione sul vetrino. Raccogliere campioni per severAL giorni consecutivi in una diapositiva per poter meglio traccia e identificare quotidiane fasi estro modifiche.
NOTA: Se possibile, è ideale anche se le persone che raccolgono campioni rimangono le stesse per tutti gli animali. - Una volta che la slitta è asciutto, iniziare il protocollo di colorazione per l'identificazione di fase. Utilizzando il kit di colorazione (vedi Tabella dei Materiali), immergere i vetrini 10 volte in fissativo (azzurro), 10 volte in soluzione colorante (rosa), e 5 volte in soluzione di contrasto (viola). Sciacquare scivola delicatamente con acqua corrente. Lasciate asciugare completamente le diapositive prima visione al microscopio.
NOTA: Il lungo ciclo estrale tipicamente 4-5 giorni è composto da (in questo ordine): estro (E), metestrus (M), diestrus (D), e proestrus (P) 26. Estrus è caratterizzata da blu, cellule corneo, metestrus dai leucociti e una combinazione di cellule nucleate e cornified, diestrus è simile a metestrus in presenza di tipi cellulari eccetto quando sono molto scarse, e proestrus da aggregati viola tintocellule nucleate di (figura 1). Ci sono varie procedure di colorazione, oltre a quelli sopra descritti, che sono ugualmente efficaci per striscio vaginale citologia. - Raccogliere i campioni per almeno due cicli completi (~ 8-10 giorni) al fine di monitorare le fasi accuratamente prima sperimentazione. Essere coerente con l'ora del giorno del prelievo del campione. Raccogliere campioni striscio vaginale giornaliero durante e fino alla fine dell'esperimento.
3. Pre-esposizione
- Prima dell'inizio dell'esperimento, pre-esporre gli animali al condizionamento camere consentono agli animali di acclimatarsi al contesto (camere di condizionamento) prima di ogni prova comportamentale.
- Pre-esporre le femmine alle camere di condizionamento (che si trova in scatole-attenuazione del suono) con le luci di casa avanti per 20-30 minuti al giorno per 3 giorni prima di ogni sperimentazione. Assegnare scatola sono pre-esposta come loro camera per lo studio. Pulire accuratamente tlui scatole (pareti e vassoi) tra le sessioni e gli animali per eliminare gli odori in quanto possono influenzare il comportamento e ciclo estrale.
4. Giorno 1: assuefazione / Paura condizionata
- Una volta che gli animali sono stati verificati per essere nella fase estro dei cicli di estro, inizia la fase di assuefazione / condizionamento dell'esperimento 3 giorni.
- Prendere pre-tone misure basali di congelamento precedenti allo stimolo primo tono condizionata (CS) presentazioni ogni giorno dell'esperimento. A tale scopo, l'acquisizione di punteggi per cento di congelamento (calcolato dividendo i secondi trascorsi immobile per la durata della prova, moltiplicato per 100) durante l'intervallo di tempo stimolo assente all'inizio della prima prova CS-alone prima dell'inizio CS.
NOTA: Queste misure possono essere utilizzati per valutare e confrontare i livelli di congelamento basali con quelli durante assuefazione, condizionata, l'estinzione, e richiamo. - Per condurre la formazione di estinzione durante la fase metestrus,condizionare i topi nel loro ultimo giorno di estro. Tampone e identificare fase estrale (step 2) ogni giorno prima di iniziare il protocollo sperimentale (condizionata / estinzione / richiamo). Poiché la fase di estro può durare più a lungo di un giorno, la storia del ciclo uso per predire la lunghezza delle fasi per determinare quando gli animali sono pronti per iniziare l'allenamento.
- Prendere pre-tone misure basali di congelamento precedenti allo stimolo primo tono condizionata (CS) presentazioni ogni giorno dell'esperimento. A tale scopo, l'acquisizione di punteggi per cento di congelamento (calcolato dividendo i secondi trascorsi immobile per la durata della prova, moltiplicato per 100) durante l'intervallo di tempo stimolo assente all'inizio della prima prova CS-alone prima dell'inizio CS.
- Nelle camere di condizionamento, collegare il piano rete foot-shock per un generatore di stimolazione elettrica. Usare un livello di stimolazione di 0,5-0,6 mA come stimolo incondizionato (US). Utilizzare un 4 kHz, 80 dB tono come stimolo condizionato (CS).
NOTA: Questi parametri possono variare tra i laboratori e possono essere modificati per il condizionamento ottimale.- Se il programma di analisi congelamento richiede segnali visivi (a differenza temporale), co-attivare una luce LED con il tono. Posizionare la luce all'esterno della camera operante, all'interno del fotogramma video. All'inizio di ogni prova, attivare la luce LED e tenerlo accesa finché l'estremità di The di prova.
NOTA: Questa luce non è visibile da animali e serve solo come marcatore per l'inizio e la fine del processo entro i file video registrati (da utilizzare per misurare il comportamento di congelamento).
- Se il programma di analisi congelamento richiede segnali visivi (a differenza temporale), co-attivare una luce LED con il tono. Posizionare la luce all'esterno della camera operante, all'interno del fotogramma video. All'inizio di ogni prova, attivare la luce LED e tenerlo accesa finché l'estremità di The di prova.
- Mettere gli animali nelle camere di condizionamento per 5 studi CS-alone di assuefazione. Subito dopo la sessione di assuefazione, eseguire 7 coppie prove CS-USA del condizionamento alla paura. Assicurarsi che il tono CS dura 30 secondi e coterminates con il 0,5 sec Uniti shock. Eseguire le prove in tutte le sessioni (assuefazione, condizionata, l'estinzione, e richiamo) con un intervallo tra le prove variabile in media 3 minuti.
- Alla fine della sessione di condizionamento, rispedire gli animali loro gabbie a casa e al stabulario fino al giorno successivo.
5. Giorno 2: Estradiolo Preparazione
- Tampone e identificare la fase estrale per tutti gli animali sottoposti Day 1 di questo protocollo. Preparare estradiolo (noto anche come E2, 17-beta-estradiolo, obeta-estradiolo) per una dose di 15 mcg kg / iniezione sottocutanea con olio di sesamo o 0,9% soluzione salina come veicolo.
- Per calcolare la quantità di estradiolo per prepararsi per le iniezioni, usare i pesi del corpo di tutti gli animali, che sono stati misurati e registrati quando sono stati condizionati al Day 1 del presente protocollo.
- Fare i calcoli di standardizzare il volume somministrato di estradiolo (cioè 0,2 ml) per ratto. Poiché estradiolo è difficile da sciogliere per la sua insolubilità in acqua e richiede un grande volume di solvente per la piccola dose, preparare una soluzione madre mescolando estradiolo in olio di sesamo a fuoco fino a dissoluzione. La soluzione può quindi essere fatto passare attraverso un filtro di 0,22 micron per rimuovere i contaminanti. Ad esempio, aggiungere un volume calcolato di un / 1 ml di soluzione di olio di sesamo magazzino 3.000 mg estradiolo al volume totale di olio di sesamo necessaria per ottenere una dose di 15 mg / kg in un volume di 0,2 ml di iniezione per animale.
NOTA: In alternativa, utilizzare altre forme di estrogeni tha t è solubile in acqua e più facile da dissolvere.
6. Giorno 2: Estradiolo Amministrazione / Estinzione Training
- Amministrare il sottocutanea estradiolo. Sollevare la pelle flaccida tra la scapola per il collo in una presa dolce e inserire l'ago della siringa nel triangolo che si forma dalle pieghe cutanee.
- 30 minuti dopo iniezioni sottocutanee di estradiolo, mettono gli animali nelle camere di condizionamento di nuovo e iniziano la formazione di estinzione. In questa sessione di estinzione, effettuare 20 prove CS-alone, con ogni prova consistente in un 30 secondi, 4 kHz, 80 dB tono, presentato in un intervallo tra le prove variabile in media 3 min.
NOTA: L'effetto dell'estradiolo sul richiamo si verifica quando l'estradiolo viene somministrato prima formazione estinzione o immediatamente dopo l'estinzione. L'effetto non è stato osservato 4 ore post-estinzione, per cui si consiglia di iniettare vicino in tempo per l'inizio o alla fine della sessione di allenamento 15.
- 24 ore dopo l'allenamento di estinzione, tampone gli animali che hanno completato giorno 1 e 2 del presente protocollo.
- Mettere gli animali nelle loro camere di condizionamento assegnati (stessi come giorno 1 e 2). Iniziare la sessione di richiamo di estinzione con la presentazione di 3 studi CS-alone (le tre prove di richiamo di estinzione), che consiste di soli 3,80 dB prove CS-alone con intervalli tra le prove simili a 20 prove somministrate per la formazione di estinzione come descritto al punto 6.2.
- Al termine della sessione di richiamo, rispedire gli animali loro gabbie a casa.
Analisi 8. Dati
- Acquisire dati comportamentali attraverso il video e analizzarli utilizzando il software del computer.
NOTA: Congelamento punteggi possono anche essere contati manualmente uno sperimentatore che è cieco al trattamento farmacologico cronometrando attacchi congelamento durante la presentazione CS di ogni prova, espresso come percentuale del tempo speso congelamento durante il tono. Congelamento èdefinita dalla completa mancanza di movimento con l'eccezione di respirazione durante le prove 30 sec CS-USA. Calcolare cento congelamento dividendo i secondi trascorsi congelamento (immobile) per 30 secondi (durata della prova) moltiplicato per 100.
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Representative Results
In questo protocollo richiamo paura dell'estinzione, per cento di congelamento è stata misurata come indicatore della paura. Gli animali che estinte bene e conservate la memoria della formazione dell'estinzione esposte basso paura l'ultimo giorno di test comportamentali durante il richiamo di estinzione. Ratti maschi e femmine non presentano differenze significative nell'espressione paura condizionata durante il condizionamento, l'estinzione, e ricordano le fasi (Figura 2). Tuttavia, una differenza di sesso diventa evidente quando gli animali vengono analizzati separatamente come gruppi di fase estro ad alta e bassa estrogeni. Ratti femmina che subiscono formazione estinzione durante la fase bassa estrogeni metestrus del ciclo estrale non ricordano la memoria estinzione il giorno 3, nonché quelli formati in proestrus (Figura 3). Questi metestrus femmine mostrano anche significativamente maggiore recupero paura durante il richiamo di estinzione (scarsa memoria estinzione) rispetto ai maschi. Tuttavia, quando metestrus femmine sono 'iniezione sottocutaneata con una dose di 15 mg / kg di estradiolo prima all'apprendimento estinzione, il consolidamento della memoria paura dell'estinzione sembra essere aumentata, come dimostrato dai bassi congelamento durante il richiamo estinzione (Figura 4). Pertanto, questi dati indicano che gli ormoni gonadici possono modulare richiamo paura estinzione e anche mediare le differenze di sesso nei comportamenti paura estinzione condizionati.
Figura 1: Immagini rappresentative di tipi di cellule in tutta le fasi del ciclo di estro (ingrandimento 20X) proestrus è caratterizzata da masse di cellule epiteliali, nucleate viola macchiato di turno.. Estro può essere identificato da aggregati di cellule squamose, cornified blu-macchiato. Metestrus e diestrus esprimono una combinazione di tipi di cellule (leucociti, cellule nucleate e cornified), ma mostrano un minor numero di cellule. Livelli di estrogeni fluttuano in tutte le fasi di estro, Con un picco durante proestrus. (Met = metestrus,.. Diest = diestrus;. Proest = proestrus). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Confronto tra maschi e femmine nelle tre fasi della sperimentazione ci sono significative differenze tra i sessi osservati nel assuefazione (. Hab), condizionata (Cond.), L'estinzione, o ricordare le fasi dell'esperimento 15.
Figura 3: differenze comportamentali tra proestrus (alto estrogeni) e metestrus (basso estrogeni) femmine Femmine in fase proestrus high-estrogeni o.f mostra ciclo estrale meno paura di quelli in metestrus bassa estrogeni. Questi dati suggeriscono che i livelli di estrogeni nelle femmine, naturalmente in bicicletta possono influenzare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione, modulando richiamo 24 ore più tardi 15.
Figura 4: trattamento estrogeni nelle femmine metestrus. La somministrazione di estradiolo 30 minuti prima dell'allenamento di estinzione (freccia) facilita il richiamo di estinzione rispetto al veicolo 16.
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Discussion
La paura di estinzione è stata ampiamente studiata in ratti maschi con i meccanismi neurali che mediano condizionato estinzione paura individuati e valutati in diverse manipolazioni. Relativamente pochi studi hanno esaminato topi di sesso femminile o il ruolo degli ormoni gonadici nella paura di estinzione. Per studiare specificamente gli effetti degli estrogeni sulla paura estinzione, naturalmente ciclismo ratti femmine sono sottoposti ad un paradigma comportamentale di tre giorni. Questa procedura si compone di fasi assuefazione / condizionamento, estinzione, e richiamare l'estinzione. Usando questo protocollo, è stato dimostrato che i ratti femmine addestrati con l'estinzione durante la bassa-estrogeno mostra fase metestrus superiore di congelamento (o alterata richiamo estinzione) rispetto alle femmine che sono estinte in proestrus high-estrogeni 15. La somministrazione di estradiolo prima formazione all'estinzione durante la fase di metestrus modula il consolidamento della memoria dell'estinzione 16. Questo è dimostrato da una diminuzione freezing durante il richiamo di estinzione. Insieme, questi risultati sottolineano l'importanza di condurre studi femminili con attenzione l'influenza degli ormoni ovarici e il ciclo estrale sul comportamento. Sebbene esperimenti di controllo non sono stati descritti qui, sarà necessario includere i controlli appropriati, cioè gruppi estinzione, per valutare ulteriormente l'influenza degli estrogeni su processi di consolidamento della memoria estinzione.
Lo scopo di questo protocollo è duplice: 1) per studiare gli effetti degli estrogeni sul condizionata estinzione paura durante specifiche fasi del ciclo estrale in animali intatti, e 2) per esaminare come acuta estradiolo sostituzione durante la femmina è normalmente stato basso di estrogeni può modulare il suo comportamento. Attraverso la procedura swabbing vaginale qui descritto, le quattro fasi del ciclo estrale possono essere identificati: estro, metestrus, diestrus, e proestrus. Questo ci permette di valutare il comportamento quando ovarica ormoni such come estrogeni sono naturalmente a concentrazioni basse e alte. Ad esempio, i livelli di estrogeni sono bassi durante la estro (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), e diestrus (25-40 pg / ml) fasi, ma elevati durante la proestrus (~ 75 pg / ml) fase del ciclo estrale 27,28. Queste fasi differiscono non solo in ambiente ormonale, ma anche nella durata. Anche se variabile, proestrus è stato tipicamente osservato per durare da 12 a 14 ore; estro per 25 a 27 ore; metestrus da 6 a 8 ore; e diestrus per 55 a 57 ore. La durata di ciascuna fase può essere più lungo o più breve di un giorno (secondo l'animale), portando a cicli di 5 giorni che comprendono 2 giorni di uno o diestrus estro. Come accennato, proestrus e metestrus sono le fasi più brevi (12-14 e 6-8 ora) e possono perdere. In questo protocollo, è quindi fondamentale per monitorare attentamente il ciclo estrale quando si utilizza ormoni naturalmente in bicicletta dell'animale di esaminare le differenze tra fase nella capacità di ricordare la formazione di estinzionedal giorno prima. Il ciclo estrale nei ratti femmina, proprio come il ciclo mestruale umano, è anche sensibile a numerosi fattori esterni, quali l'età, lo stress, l'ora del giorno, condizioni abitative, la temperatura, ecc, e dovrebbe essere considerato al momento di pianificare gli esperimenti. Un animale potrebbe diventare aciclico (esteso estro / diestrus) o visualizzare un ciclo irregolare (meno di 4 giorni o più di 5 giorni) prima o durante lo studio. In questo caso, questi animali sarebbero esclusi dalle analisi sperimentali, essendo rigoroso di test durante le fasi specifiche del ciclo estrale. Importante notare sono le fasi di transizione, durante il quale i campioni vengono mescolati con muco, rendendo un po 'difficile individuare chiaramente i tipi di cellule specifiche che caratterizzano ogni fase. Questo può anche essere dovuto al momento della giornata il tampone è presa. Se è presente una quantità eccessiva di scarico di muco-come durante la raccolta striscio come risultato di swabbing quotidiana, permettendo diversi giorni di trattamento per passare senza swabbingpuò risolvere il problema.
In aggiunta al metodo di identificazione di fase estrale qui descritto, altri strumenti metodologici possono essere impiegati per ottenere misure circolanti concentrazioni sieriche ormonali ovarici. Ad esempio, la concentrazione di estrogeni può essere quantificato in campioni di sangue con un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). In questa procedura, estrogeni nel siero / plasma campioni si legano ad un anticorpo anti-estrogeno specifica, che è collegato ad un enzima. Substrato del enzima produce una reazione che si traduce in un segnale visibile, come un cambiamento di colore che può essere misurato con uno spettrofotometro. Questo strumento calcola assorbanza e fornisce una quantificazione dei livelli di estrogeni nel campione. Questo metodo può essere utile per valutare naturalmente fluttuanti livelli di estradiolo in tutto il ciclo estrale, e ancora più importante, in momenti specifici durante l'esperimento. Può anche essere usato per determinare la somministrazione esogena di come estrogeni possono alterare normaAL concentrazioni fisiologiche. Misurazione delle concentrazioni di estrogeni da sangue può prevenire difficoltà con l'identificazione di fase durante le fasi di transizione, o quando strisci sono difficili da leggere a causa di muco nei campioni. Purtroppo, questo metodo può diventare molto costoso e offerte ritardata risultati rispetto alla collezione striscio vaginale.
Le procedure per ottenere campioni di sangue sufficiente, ad esempio., Via vena della coda, seno orbitale, coda snip, e vena safena 29, può causare inutili stress per l'animale. Questo può influire livelli ormonali in momenti critici nell'esperimento, portando a misurazioni imprecise o distorta. Utilizzando il sangue tronco per misurare i livelli di estradiolo è terminale e quindi fornisce informazioni molto limitate su fluttuazioni ormonali all'interno delle fasi. Valutare citologia vaginale cellulare sembra offrire un'alternativa migliore. Se tale metodo può fornire solo una stima approssimativa dei profili ormonali ovarici attraverso fasi di estro, si puòridurre al minimo lo stress ed è quindi meno dannoso per l'esperimento comportamentale.
Ci sono diverse forme di steroidi estrogeni che sono naturalmente circolano negli esseri umani e animali non umani, come l'estriolo, estradiolo, estrone e. In questo protocollo, l'estradiolo è acutamente somministrato tramite iniezioni sottocutanee. Estradiolo (sinonimo di E2, 17-beta-estradiolo o beta-estradiolo) è utilizzato in questo protocollo, perché è la forma più potente di naturale estrogeni nelle donne non gravide 30. In contrasto con iniezioni acute di estradiolo, altri laboratori hanno impiegato metodi di somministrazione di estrogeni cronica. Ad esempio, gli impianti sottocutanei di pellets a lento rilascio o capsule silastic consentono costante, erogazione continua di estrogeni o del veicolo soluzione 19. Questa procedura è in genere utilizzato in combinazione con ovariectomie, che eliminano lo stato naturale di riproduzione dell'animale.
L'alla manipolazioneregola- discusse qui si concentrano sugli stati ormonali naturali per facilitare l'applicazione clinica dei risultati di laboratorio. Gli individui con disturbo da stress post-traumatico (PTSD) sono comunemente alterate nella loro capacità di estinguere la paura di uno stimolo legate alla loro esperienza traumatica e per ricordare questa estinzione. Questa condizione persiste spesso molto tempo dopo l'evento è passato. La terapia prolungata esposizione è un'opzione di trattamento comune per PTSD che si basa su processi basati estinzione studiate in modelli di roditori come quello descritto qui. È interessante notare che le donne sono circa il doppio delle probabilità, come gli uomini di sviluppare stress e disturbi psichiatrici legati all'ansia 31. Questa differenza di sesso in prevalenza può essere collegato a differenze di sesso nei processi di estinzione paura e alla base della potenziale rilevanza clinica di questi risultati di laboratorio. Nonostante la maggiore prevalenza di PTSD nelle donne, relativamente pochi temono sono stati condotti studi di estinzione nei roditori nelle femmine. Studi femmina fuocozione sul ruolo degli ormoni gonadici non deve essere trascurato in sede di esame differenze di sesso e comportamento. Caratterizzare gli effetti comportamentali della fluttuazione dei livelli di ormone naturalmente tutto il ciclo estrale fornisce informazioni preziose sulle differenze fondamentali nel comportamento tra maschi e femmine. Questo protocollo fornisce un modello di base per facilitare studi futuri di ormoni ovarici e la loro influenza su, ma non limitati a, i processi cognitivi e comportamentali, come la paura di estinzione. Questo protocollo concentra su una specifica ormonale gonadica, estrogeni, tuttavia, l'effetto di altri ormoni quali il progesterone e testosterone può anche essere valutato. Utilizzando il paradigma comportamentale qui presentata in combinazione con altre tecniche farmacologiche, cellulari e molecolari (cioè, infusioni di farmaci localizzate, immunoistochimica, macchia occidentale), la ricerca futura può identificare specifici siti / obiettivi dell'azione degli estrogeni nel cervello che possono aumentare la terapia comportamentale.
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Disclosures
Gli autori di questo manoscritto non hanno interessi finanziari in competizione o altri conflitti di interesse da dichiarare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
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