Abstract
Utryddelse av betinget frykt har blitt grundig studert i mannlige gnagere. Nylig har det vært et økende antall studier som indikerer at nevrale mekanismer for visse atferds oppgaver og svar atferd er annerledes hos kvinner og menn. Ved hjelp av kvinner i forskningsstudier kan representere en utfordring på grunn av variasjonen av gonadale hormoner under brunst. Denne protokollen beskriver veletablerte prosedyrer som er nyttige i å undersøke rollen som østrogen i frykt utryddelse minne konsolidering i hunnrotter. Fase av brunst og eksogene østrogen administrasjon før utryddelse trening kan påvirke utryddelse tilbakekalling 24 timer senere. Vaginal swabbing teknikk for estrous fase identifikasjon beskrevet her hjelpemidler til eksamen og manipulering av naturlig sykling gonadale hormoner. Bruken av denne grunnleggende gnager modellen kan ytterligere avgrense mekanismer som østrogen kan modulere frykt utryddelse minne ihunner.
Introduction
Iboende kjønnsforskjeller er observert på tvers av ulike kognitive atferd og lærings paradigmer i både mennesker og gnagere. For eksempel har det vært rapportert at kvinner generelt har sterkere verbale og detalj-orientert evner, mens menn har bedre romlige evner 1-3. Disse kjønnsforskjellene kan skyldes delvis til påvirkning av gonadale hormoner. Høye østradiolnivåer forbedre ytelsen på oppgaver der kvinner er bedre, men forverres ytelse på oppgaver som menn vanligvis gjør det bra 4-6. Selv om dette beviset er overbevisende, den begrensede evne til å fullstendig kontrollere eksperimentelle miljøer i studier på mennesker gjør det vanskelig å avgjøre om disse effektene på atferd kan tilskrives spesifikt til hormoner. Dyreforsøk, i motsetning, tillate fullstendig kontrollerte forhold.
Selv om de grunnleggende nevrale mekanismer for utryddelse frykt har blitt identifisert og er godt studert hos menn, er det uklart omDisse systemene er de samme i kvinner eller hvordan de endres over brunst. Frykt condition og utryddelse er mye brukt atferds paradigmer i gnagere og mennesker for å gjennomføre studier knyttet til angstlidelser. Gitt at kvinner har en høyere risiko for angstlidelser samt høyere symptom varighet og alvorlighetsgrad 7-13, er det avgjørende å inkludere kvinner i disse studiene. Underrepresentasjonen av kvinner i denne forskningen kan tilskrives utfordringene i estrous fase overvåking og regnskap for de atferdsmessige effekter av kjønnshormoner. Laboratorier som gjør undersøke kvinner i denne forbindelse møte problemer som ofte ikke blir rapportert eller ikke er beskrevet i metodene for sine studier.
Emerging bevis i gnagere tyder på at kjønnsforskjeller i utryddelse frykt er modulert av gonadale hormoner 14-18. I frykt conditioning, blir dyrene opplært til å frykte en bestemt stimulus. Etter en rekke uarmerte presentasjoner avstimulans, dyrene lære ikke å frykte køen, en prosess som kalles utryddelse. Hvor godt dyret lærer og konsoliderer minnet om å lære denne oppgaven kan observeres under en utryddelse tilbakekalling test gitt noen tid etter utryddelse trening. Mindre frykt uttrykk under utryddelse tilbakekalling demonstrerer god utryddelse minne konsolidering. Nye funn fra vårt laboratorium tyder på at østrogen kan modulere konsolideringen av frykt utryddelse hukommelse og forbedre utryddelse tilbakekalling. Spesifikt hunnrotter som er slukket i proestrus, fasen til brunst under hvilken sirkulerende østrogennivåer topp, viser forbedret retensjon av utryddelse minne. I kontrast, kvinner som er slukket i lav-østrogen metestrus fase skjerm relativt dårlig utryddelse tilbakekalling, noe som kan forbedres med eksogen østradiol administrasjon før eller umiddelbart etter utryddelse trening 15,16. Nevrale mekanismer for utryddelse minne konsolidering (inkluding rolle gonadale hormoner) hos kvinner er ikke klar.
I forsøksdyr, kan rollen av hormoner bli undersøkt ved hjelp av invasive kirurgiske fjerning prosedyrer som kastrering og ovariektomi. I etterkant utvinning fra kirurgi, gonadale hormoner ofte eksogent manipulert under utførelsen av en atferds oppgave 19. Denne tilnærmingen har gitt viktig informasjon om kjønnshormoner og er nyttig fordi det gir mulighet for godt kontrollerte manipulasjoner av gonadale hormoner (i form av timing og dose) 20-23. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke vurdere innvirkningen av de naturlig forekommende svingninger som opptrer på tvers av brunst heller ikke representerer de "normale" dyr, for derved å begrense den translasjonelle potensial til humane studier. Det har blitt godt dokumentert at kvinnelige kjønnshormonet nivåer topp og nedgang på bestemte faser av brunst, og østrogen reseptor uttrykk endringer i syklusen,og etter ovariektomi 24. Dermed er det behov for å gjennomføre studier på kvinner med intakte gonader og avgrense eksperimentelle design for pålitelig å studere effekter som høye og lave østrogen stater kan ha på kvinner i hele livsløpet.
Denne protokollen fokuserer på effekten av østrogen på de nevrobiologiske systemer som er involvert i utryddelse frykt. Den beskriver hvordan du: 1) nøye overvåke brunst, 2) utarbeide effektive doser av østradiol for systemisk administrasjon, og 3) følger en atferds paradigme som omfatter frykt condition, utryddelse, og hente inn naturlig sykling hunnrotter. Denne protokollen kan endres med andre farmakologiske manipulasjoner og cellulære og molekylære verktøy for å hjelpe studier for å bedre forstå kjønnsforskjeller som er observert i kondisjonert frykter utryddelse oppførsel. Merk at prosedyrene som er beskrevet nedenfor er de som brukes innenfor vårt laboratorium, og det finnes en rekke varianter av disse prosedyrene in litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Subcommittee på Forsknings Animal Care, som fungerer som Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) for Massachusetts General Hospital, og er i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer.
1. Animal Bolig og håndteringsprosedyre
- Ved ankomst huset voksen Sprague Dawley hunnrotter ca 8-10 ukers alder (som veier 200-225 g) i grupper på 3-4 tommer plastbøtter med trespon sengetøy. Holde dem på en diett av ad libitum adgang til Chow og vann og en 12 timers lys / mørke syklus. La rotter å akklimatisere til boforhold og dyr anlegget i minst en uke.
MERK: Alle prosedyrer i dette manuskriptet blir gjennomført i løpet av lys syklus. - Etter dette akklimatiseringsperiode, håndtere alle dyr for 5 min hver i 2-3 dager. Riktig plukke opp rotter en av gangen (støttes av torso og ikke av halen),holde dem sikkert, og pet dem i løpet av denne tiden. Håndtere dyr som vises mer stresset, nervøs eller engstelig for lengre perioder av gangen. Gjør dette for å minimere å håndtere stress, noe som kan påvirke følgende trinnene i denne protokollen.
MERK: antall dager og tid håndtere dyrene kan variere mellom ulike laboratorier; Men, bør disse være konsekvent mellom eksperimenter innenfor samme lab.
2. Overvåking brunst: Vaginal Swab Søl og Farging Prosedyre
- Gjør 0,9% saltoppløsning (natriumklorid ble oppløst i destillert vann). Fukt en bomulls-tipped applikator i denne løsningen. Blot spissen ved hjelp av en papirhåndkle for å unngå oversaturation, noe som kan føre til mangelfull prøvetaking eller tap av celler. Holder halen oppover bort fra skjedeåpningen, forsiktig sette bomull tuppen inn i vaginal kanalen og rulle rundt veggene for å fange opp løse vaginale celler.
- Hvis dyret urinerer på barnesengton spissen, erstatte med en ny en, som urin forurensning vil gjøre det vanskelig for fase identifikasjon. Vær veldig forsiktig for å ikke forårsake ubehag for dyret under denne prosedyren fordi eksponering for stress vil forstyrre brunst. Når swabbing, tar sikte på å oppnå en rask innsetting og uttak som ikke er for dypt som å minimere ekstra stimulering til livmorhalsen, som kan indusere pseudopregnancy.
MERK: Pseudopregnancy kan identifiseres som en asyklisk brunst som vanligvis varer i ca 12 dager, dvs. sammenhengende dager med diestrus 25. - Ta forsiktig tips applikatoren og rull den til en pre-merket objektglass. Unngå å trykke for hardt ned så altfor mye væske på lysbildet kan gjøre fase identifikasjon vanskelig når tørr.
MERK: En side kan inneholde flere dager for hvert dyr, selv om dette kan gjøres i henhold til individuelle preferanser. - Sørg for at prøven overføringer over på lysbildet. Samle inn prøver for several sammenhengende dager på ett lysbilde for å kunne bedre spor og identifisere daglige estrous faser endringer.
MERK: Hvis det er mulig, er det også ideelt hvis folk samle prøvene er de samme for alle dyr. - Når dekselet er tørr, begynner fargingen protokoll for fase identifikasjon. Bruke fargesett (se tabell of Materials), fordype lysbilder 10 ganger i fiksativ (lys blå), 10 ganger i flekken løsning (rosa), og fem ganger i counterstain løsning (lilla). Skyll glir forsiktig under rennende vann. La lysbilder helt lufttørke før du ser etter mikroskop.
MERK: Den typisk 4-5 dagen lang Østrussyklus består av (i denne rekkefølgen): estrus (E), metestrus (M), diestrus (D), og proestrus (P) 26. Estrus er karakterisert ved blå, forhornede celler, metestrus av leukocytter, og en kombinasjon av forhornede og kjerneinneholdende celler, er diestrus lik metestrus i nærvær av celletypene bortsett fra at de er svært tynt, og proestrus av purpur-fargede aggregaternukleerte celler (figur 1). Det finnes forskjellige fargingsprosedyrer, i tillegg til de som er beskrevet ovenfor, som er like effektive for vaginal cytologi utstryk. - Samle inn prøver i minst to komplette sykluser (~ 8 til 10 dager) for å overvåke fasene nøyaktig før eksperimentering. Vær konsekvent med tiden på dagen prøvene er tatt. Samle vaginal smøre prøver daglig gjennom og frem til slutten av forsøket.
3. Pre-eksponering
- Før initiering av eksperimentet, pre-utsette dyrene for kondisjoneringskamrene tillater dyrene å akklimatisere seg til rammen (kondisjoneringskamre) før adferdstesting.
- Pre-eksponere hunnene til condition kamre (ligger i lyd dempende bokser) med huset lysene på i 20-30 min per dag i 3 dager før noen eksperimentering. Tildel esken de er pre-eksponert for som sitt kammer for studien. Grundig ren than bokser (vegger og skuffer) mellom øktene og dyr for å fjerne lukt siden de kan påvirke atferd og brunst.
4. Dag 1: Tilvenning / Fear Conditioning
- Når dyrene har blitt verifisert til å være i estrus fase av deres Østerussykluser, begynner tilvenning / kondisjoneringsfasen av 3-dagers eksperimentet.
- Ta pre-tone baseline tiltak av frysing før første tone betinget stimulus (CS) presentasjoner på hver dag av forsøket. Gjør dette ved å kjøpe prosent frysing score (beregnet ved å dele sekunder tilbrakt immobile med varigheten av rettssaken, multiplisert med 100) i løpet av stimulus-fraværende tidsintervall ved begynnelsen av den første CS stående rettssaken før CS utbruddet.
MERK: kan brukes Disse tiltakene for å vurdere og sammenligne baseline frysing nivåer med dem under tilvenning, condition, utryddelse, og tilbakekalling. - For å gjennomføre utryddelse trening under metestrus fasen,tilstand rottene i sin siste dag av estrus. Pinne og identifisere estrous fase (trinn 2) hver dag før du starter den eksperimentelle protokollen (condition / utryddelse / tilbakekalling). Som estrus fasen kan vare lenger enn én dag, til bruk syklus historie forutsi lengden på fasene for å avgjøre når dyrene er klar til å begynne å trene.
- Ta pre-tone baseline tiltak av frysing før første tone betinget stimulus (CS) presentasjoner på hver dag av forsøket. Gjør dette ved å kjøpe prosent frysing score (beregnet ved å dele sekunder tilbrakt immobile med varigheten av rettssaken, multiplisert med 100) i løpet av stimulus-fraværende tidsintervall ved begynnelsen av den første CS stående rettssaken før CS utbruddet.
- I condition kamre, koble foten-sjokk rutenett gulv til en elektrisk stimulering generator. Bruk en stimulering nivå på 0,5-0,6 mA som ubetinget stimulus (US). Bruk en 4 kHz, 80 dB tone som betinget stimulus (CS).
MERK: Disse parametrene kan variere mellom laboratorier og kan endres for optimal condition.- Hvis det iskalde analyseprogram krever visuelle signaler (i motsetning til timelig), co-aktivere en LED-lys med tonen. Plassere lyset på utsiden av operant kammer, innenfor videorammen. Ved starten av hver studie aktivere LED lys og holde det opplyst til slutten av the rettssaken.
MERK: Dette lyset er ikke synlig av dyr og bare fungerer som en markør for initiering og slutten av rettssaken innenfor de innspilte videofiler (som skal brukes til å måle fryse atferd).
- Hvis det iskalde analyseprogram krever visuelle signaler (i motsetning til timelig), co-aktivere en LED-lys med tonen. Plassere lyset på utsiden av operant kammer, innenfor videorammen. Ved starten av hver studie aktivere LED lys og holde det opplyst til slutten av the rettssaken.
- Plassere dyrene i condition kamre for 5 CS stående forsøk med tilvenning. Umiddelbart etter tilvenning sesjon, utføre 7 sammenkoblede CS-amerikanske studier av frykt condition. Kontroller at CS tone varer i 30 sek og coterminates med 0,5 sek amerikanske sjokk. Kjøre forsøk i alle økter (habituering, condition, utryddelse, og huske) med en variabel intertrial intervall gjennomsnitt tre minutter.
- Ved slutten av kondisjonerings økt, returnere dyrene til oppholdskassen og til dyret anlegget før neste dag.
5. Dag 2: Østradiol Forberedelse
- Pinne og identifisere estrous fase for alle dyr som gjennomgikk dag 1 av denne protokollen. Forbered østradiol (også kjent som E2, 17beta-østradiol, ellerbeta-østradiol) for en 15 ug / kg dose subkutan injeksjon ved å bruke sesamolje eller 0,9% saltvann som kjøretøyet.
- Å beregne mengden av østradiol å forberede injeksjoner, bruker kroppsvekten hos alle dyr, som ble målt og registrert da de ble betinget på dag 1 av denne protokollen.
- Gjøre beregninger for å standardisere administrert volum av østradiol (dvs. 0,2 ml) per rotte. Siden østradiol er vanskelig å oppløse på grunn av sin vannuoppløselighet og krever et stort volum av løsningsmiddel for liten dose, fremstille en stamoppløsning ved å blande østradiol i sesamolje over varme til det er oppløst. Oppløsningen kan deretter føres gjennom et 0,22 um filter for å fjerne forurensninger. For eksempel legge et beregnet volum av en 3000 ug østradiol / 1 ml sesamolje stamoppløsning til det totale behov for volum av sesamolje for å oppnå en 15 ug / kg dose i en 0,2 ml injeksjonsvolum per dyr.
MERK: Du kan også bruke andre former for østrogen tha t er vannløselige og lettere å oppløse.
6. Dag 2: Østradiol Administrasjon / Extinction Training
- Administrere estradiol subkutant. Løft den løse huden mellom skulderblad av halsen på en skånsom klype og stikk kanylen inn i trekanten som dannes av hudfolder.
- 30 minutter etter subkutane injeksjoner av østradiol, plassere dyrene i condition kamre igjen og begynne utryddelse trening. I denne utryddelse sesjon, utføre 20 CS stående studier med hvert forsøk som består av en 30 sek, 4 kHz, 80 dB tone, presentert på en variabel intertrial intervall gjennomsnitt 3 min.
MERK: Effekten av østradiol på tilbakekalling oppstår når østradiol administreres før utryddelse trening eller umiddelbart etter utryddelse. Effekten er ikke observert fire timer etter utryddelse, så det anbefales å injisere nær i tid til begynnelsen eller slutten av treningsøkten 15.
- 24 timer etter at utryddelse trening, vattpinne dyrene som fullførte Dag 1 og 2 i denne protokollen.
- Plassere dyrene i deres tilordnede kondisjoneringskamrene (samme som dag 1 og 2). Begynn utryddelse tilbakekalling sesjon ved å presentere tre CS stående studier (tre studier av utryddelse tilbakekalling), som består av kun 3,80 dB CS stående studier med intertrial intervaller som ligner på de 20 studiene som administreres for utryddelse opplæring som beskrevet i trinn 6.2.
- Ved ferdigstillelse av tilbakekall økt, returnere dyrene til hjem bur.
8. Data Analysis
- Erverve atferdsdata gjennom video og analysere dem ved hjelp av dataprogrammer.
MERK: Frysing score kan også stilles manuelt telles av en eksperimentator som er blind for medikamentell behandling av timingen frysing anfall i løpet av CS presentasjon av hvert forsøk, uttrykt som prosentandel av tiden brukt frysing under tone. Frysing erdefinert ved fullstendig mangel på bevegelse med unntak av pusting i løpet av 30 sek CS-amerikanske forsøk. Beregne prosent frysing ved å dele sekunder tilbrakt frysing (immobile) med 30 sekunder (varighet av prøve) multiplisert med 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne utryddelse frykt tilbakekalling protokollen, ble prosent frysing målt som en indikator på frykt. Dyr som slukkes godt og beholdt minnet om utryddelse trening utstilt lav frykt på den siste dagen av atferds testing i løpet av utryddelse tilbakekalling. Hann- og hunnrotter ikke vesentlig forskjellig i kondisjonert frykt uttrykk under condition, utryddelse, og husker faser (figur 2). Men blir en kjønnsforskjellen tydelig når dyrene blir analysert separat som høye og lave østrogen estrous fase grupper. Hunnrotter som gjennomgår utryddelse trening i løpet av lav-østrogen metestrus fase av brunst ikke huske utryddelse minne på dag 3, så vel som de som trente i proestrus (figur 3). Disse metestrus hunner også vise betydelig større frykt utvinning under utryddelse tilbakekalling (dårlig utryddelse minne) i forhold til menn. Men når metestrus kvinner er subkutant injected med en 15 ug / kg dose av østradiol forut for utryddelse læring, vises konsolidering av utryddelse frykt minne for å bli forsterket som vist ved lavt fryse under utryddelse tilbakekalling (figur 4). Derfor er disse dataene indikerer at gonadale hormoner kan modulere utryddelse frykt tilbakekalling og også megle kjønnsforskjeller i betingede utryddelse frykt atferd.
Figur 1: Representative bilder av celletyper på tvers estrous faser (forstørrelse 20X) proestrus er preget av masser av runde, lilla-farget nukleerte epitelceller.. Estrus kan identifiseres ved aggregater av blå-farget, plateepitel forhornede celler. Metestrus og diestrus uttrykker en kombinasjon av celletyper (leukocytter, med kjerne og forhornede celler), men viser færre celler. Østrogennivået svinge gjennom estrous faser, Med en topp i løpet proestrus. (Met = metestrus;.. Diest = diestrus;. Proest = proestrus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Sammenligning mellom menn og kvinner på tvers av de tre fasene av eksperimentet Det er ingen signifikante kjønnsforskjeller observert i habituering (. Hab), condition (. Cond), utryddelse, eller husker faser av forsøket 15.
Figur 3: Behavioral forskjeller mellom proestrus (høy østrogen) og metestrus (lav østrogen) kvinner Kvinner i high-østrogen proestrus fase o.f brunst utstillings mindre frykt enn de i lav-østrogen metestrus. Disse data tyder på at østrogennivået i naturlig sykling hunner kan påvirke konsolideringen av utryddelse frykt minne, moduler tilbakekalling 24 timer senere 15.
Figur 4: Østrogen behandling i metestrus hunner. Administrasjon av østradiol 30 min før utryddelse trening (pil) letter utryddelse tilbakekalling i forhold til kjøretøy 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utryddelse frykten har blitt studert hos hannrotter med nevrale mekanismer som medierer betinget frykt utryddelse identifiseres og vurderes under forskjellige manipulasjoner. Relativt få studier har undersøkt hunnrotter eller rollen gonadale hormoner i utryddelse frykt. Spesifikt studere effekten av østrogen på utryddelse frykt, er naturlig sykling hunnrotter utsatt for en tre-dagers atferds paradigme. Denne prosedyren består av tilvenning / condition, utryddelse, og utryddelse tilbakekalling faser. Ved hjelp av denne protokollen, har det blitt vist at hunnrotter trent med utryddelse i løpet av lav-østrogen metestrus fase utstillings høyere frysing (eller svekket utryddelse tilbakekalling) sammenlignet med kvinner som er slukket i høy østrogen proestrus 15. Administrasjon av østradiol før utryddelse trening under metestrus fase modulerer konsolidering av utryddelse minne 16. Dette blir vist ved en reduksjon i freezing under utryddelse tilbakekalling. Sammen utgjør disse resultatene markere viktigheten av å gjennomføre kvinnelige studier med hensyn til påvirkning av eggstokkhormonene og brunst på atferd. Selv om kontrollforsøk ikke har blitt beskrevet her, vil det være nødvendig å inkludere de passende kontroller, det vil si ingen utryddelse grupper, for ytterligere å evaluere innvirkningen av østrogen på prosesser som er involvert i utryddelse minne konsolidering.
Hensikten med denne protokollen er todelt: 1) å undersøke effektene av østrogen på aircondition utryddelse frykt under bestemte faser av brunst hos intakte dyr, og 2) å undersøke hvordan akutt østradiol erstatning under den kvinnelige er normalt lavt østrogen staten kan modulere sin oppførsel. Gjennom vaginal swabbing prosedyren beskrevet her, kan de fire fasene i brunst identifiseres: estrus, metestrus, diestrus, og proestrus. Dette gir oss muligheten til å vurdere atferd når eggstokkene hormoner sulm som østrogen er naturlig ved lave og høye konsentrasjoner. For eksempel, østrogennivået er lavt under løpetid (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), og diestrus (25-40 pg / ml) faser, men høyt under proestrus (~ 75 pg / ml) fase av brunst 27,28. Disse fasene ikke bare forskjellig i hormonelle miljøet, men også i varighet. Selv om det variable har proestrus er vanligvis observert å vare i 12 til 14 timer; løpetid for 25. til 27. time; metestrus for 6 til 8 timer; og diestrus for 55-57 hr. Varigheten av hver fase kan være lengre eller kortere enn ett døgn (avhengig av dyret), som fører til 5-dagers sykluser som omfatter to dager med enten diestrus eller estrus. Som nevnt, proestrus og metestrus er kortere faser (12-14 og 6-8 time, henholdsvis) og kan gå glipp av. I denne protokollen, er det derfor viktig å nøye overvåke brunst når du bruker dyrets naturlig sykling hormoner for å undersøke inter-fase forskjeller i evnen til å huske utryddelse treningfra dagen før. Brunst hos hunnrotter, mye som den menneskelige menstruasjonssyklusen, er også følsom for mange ytre faktorer, som alder, stress, tid på dagen, boforhold, temperatur, etc., og bør vurderes ved planlegging eksperimenter. Et dyr kan bli asyklisk (utvidet løpetid / diestrus) eller vise en uregelmessig syklus (kortere enn 4 dager eller lengre enn 5 dager) før eller i løpet av studien. I dette tilfelle ville disse dyrene utelukkes fra de eksperimentelle analysene, å være strenge til testing under bestemte faser av brunst. Viktig å merke seg er overgangsfasen der prøvene er blandet med slim, noe som gjør det litt vanskelig å identifisere de spesifikke celletyper som preger hver fase. Dette kan også være på grunn av den tid på dagen vattpinnen er tatt. Hvis det er en overdreven mengde slim-aktig utflod under smøre samling som følge av daglig swabbing, slik at flere håndterings dager å passere uten penslingkan løse dette problemet.
I tillegg til den estrous faseidentifikasjonsmetode som er beskrevet her, kan andre metodiske verktøy anvendes for å oppnå målinger av sirkulerende serum ovarian hormone-konsentrasjoner. For eksempel, kan østrogen-konsentrasjonen bli kvantifisert i blodprøver ved bruk av en enzym-bundet immunosorbant analyse (ELISA). I denne prosedyren, østrogener i serum / plasma-prøver bindes til et spesifikt anti-østrogen-antistoff som er bundet til et enzym. Enzymets substrat frembringer en reaksjon som resulterer i en synlig signal slik som det som kan måles ved hjelp av et spektrofotometer en fargeendring. Dette verktøyet beregner absorbans og gir en tallfesting av østrogennivået i utvalget. Denne fremgangsmåte kan være nyttig for å vurdere naturlig varierende østradiolnivåer på tvers av brunst, og enda viktigere, ved bestemte tidspunkter i løpet av eksperimentet. Den kan også brukes til å bestemme hvor eksogen administrering av østrogen kan endre normenal fysiologiske konsentrasjoner. Måling av østrogen konsentrasjoner fra blodet kan hindre problemer med fase identifikasjon i overgangsfasen, eller når flekker er vanskelig å lese på grunn av slim i prøvene. Dessverre kan denne metoden bli ganske kostbart og tilbud forsinket resultater sammenlignet med vaginal smøre samling.
Handlinger for å innhente tilstrekkelig blodprøver, f.eks., Via halevenen, orbital sinus, hale klipp, og saphenavene 29, kan føre til unødvendig stress for dyret. Dette kan påvirke hormonnivåer på kritiske tidspunkt i eksperimentet, som fører til unøyaktige målinger eller skjeve. Ved hjelp av trunk blod for å måle østradiolnivåer er terminal og gir derfor svært begrenset informasjon om hormonelle svingninger innenfor fasene. Vurdere vaginal celle cytologi ser ut til å gi et bedre alternativ. Selv om denne metoden kan bare gi et grovt anslag på eggstokkene hormonprofiler tvers estrous faser, kan detredusere stress og er senere mindre forstyrrende for atferdseksperiment.
Det finnes forskjellige former av østrogene steroider som sirkulerer naturlig i mennesker og ikke-humane dyr, som for eksempel østriol, østradiol, østron og. I denne protokollen, er østradiol akutt administrert via subkutan injeksjon. Østradiol (synonymt med E2, 17beta-østradiol eller beta-østradiol) anvendes i denne protokollen, fordi det er den mest potente form av naturlig forekommende østrogen i ikke-gravide kvinner 30. I motsetning til akutte injeksjoner av østradiol, har andre laboratorier anvendes metoder for østrogen kronisk administrering. For eksempel subkutane implantater for sakte frigivelse pellets eller kapsler silastiske tillate jevn, kontinuerlig avgivelse av østrogen eller bæreroppløsning 19. Denne fremgangsmåten blir vanligvis brukt i forbindelse med ovariectomies, som eliminerer dyrets naturlige forplantnings tilstand.
Den manipusjoner diskutert her fokusere på naturlige hormonelle stater til å legge til rette for klinisk anvendelse av laboratoriefunn. Personer med post-traumatisk stresslidelse (PTSD) er ofte svekket i deres evne til å slukke frykten for en stimulans relatert til deres traumatiske opplevelsen og å huske dette utryddelse. Denne tilstanden vedvarer ofte lenge etter at arrangementet har gått. Langvarig eksponering terapi er et vanlig alternativ behandling for PTSD som er avhengig av utryddelse baserte prosesser som studeres i gnagermodeller slik som den er beskrevet her. Interessant, kvinner er omtrent dobbelt så stor risiko som menn for å utvikle stress og angstrelaterte psykiske lidelser 31. Denne kjønnsforskjellen i utbredelsen kan være knyttet til kjønnsforskjeller i frykt utryddelse prosesser og ligger til grunn for den potensielle kliniske betydningen av disse laboratoriefunn. Til tross for høyere prevalens av PTSD hos kvinner, relativt få frykter utryddelse studier i gnagere er utført på kvinner. Kvinnelige studier fokuserering på seg rollen gonadale hormoner bør ikke bli oversett når undersøke kjønnsforskjeller i atferd. Karakterisere de atferdsmessige effekter av naturlig varierende hormonnivåer over brunst gir verdifull innsikt i de grunnleggende forskjeller i atferd mellom menn og kvinner. Denne protokollen gir en grunnleggende modell til rette for fremtidige studier av eggstokkene hormoner og deres innflytelse på, men ikke begrenset til, kognitive og atferdsmessige prosesser som utryddelse frykt. Denne protokollen fokuserer på et bestemt gonadal hormonet østrogen, men virkningene av andre hormoner som progesteron og testosteron kan også bli vurdert. Bruke atferds paradigmet presenteres her sammen med andre farmakologiske, cellulære og molekylære teknikker (dvs. lokaliserte narkotika infusjoner, immunhistokjemi, western blot), fremtidig forskning kan identifisere spesifikke nettsteder / mål av østrogen handling i hjernen som kan forsterke atferdsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne av dette manuskriptet har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
