Abstract
Utrotning av kondition rädsla har studerats hos manliga gnagare. Nyligen har det funnits ett ökande antal studier som pekar på att neurala mekanismer för vissa beteende uppgifter och svars beteenden är olika hos kvinnor och män. Använda honor i forskningsstudier kan utgöra en utmaning på grund av variationen av könshormoner under sin estrous cykeln. Detta protokoll beskriver väletablerade rutiner som är användbar vid undersökning av rollen av östrogen i rädsla utrotning minne konsolidering i honråttor. Fasen av estrous cykeln och exogent östrogen administration före utrotning träning kan påverka utrotning minns 24 tim senare. Den vaginala svabbar teknik för estrous fas identifiering beskrivs här underlättar undersökning och manipulation av naturligt cykla könshormoner. Användandet av denna grundläggande gnagarmodell får ytterligare avgränsa de mekanismer genom vilka östrogen kan modulera rädsla utrotning minne ihonor.
Introduction
Inneboende könsskillnader observeras på olika kognitiva beteenden och inlärningsparadigm i både människor och gnagare. Till exempel har det rapporterats att kvinnor generellt har starkare verbala och detaljorienterad förmågor, medan män har bättre spatiala förmågor 1-3. Dessa könsskillnader kan bero delvis på påverkan av könshormoner. Höga estradiolnivåer förbättra prestanda på arbetsuppgifter där kvinnor är bättre, men sämre prestanda på arbetsuppgifter som män gör oftast väl 4-6. Även om detta bevis är övertygande, gör den begränsade möjligheten att helt styra experimentella miljöer i humanstudier det svårt att avgöra om dessa effekter på beteendet kan hänföras specifikt till hormoner. Djurstudier däremot möjliggöra fullt kontrollerade förhållanden.
Även de grundläggande neurala mekanismerna för rädsla utrotning har identifierats och är väl studerade hos män, är det oklart omdessa system är samma i kvinnor eller hur de förändras över östrogencykel. Rädsla konditionering och utrotning används allmänt beteende paradigm i gnagare och människor att genomföra studier relaterade till ångest. Med tanke på att kvinnor har en högre risk för ångest samt högre symptom duration och svårighetsgrad 7-13, är det viktigt att inkludera kvinnor i dessa studier. Underrepresentationen av kvinnor inom denna forskning kan tillskrivas de utmaningar som estrous övervakningsfasen och redovisning för beteendeeffekter av könshormoner. Laboratorier som gör undersöka honor i detta avseende möter frågor som ofta går orapporterat eller inte beskrivs i de metoder för sina studier.
Emerging bevis i gnagare antyder att könsskillnader i rädsla utrotning moduleras av könshormoner 14-18. I rädsla konditione djuren tränas att frukta en viss stimulans. Efter ett antal oarmerade presentationer avstimulans, djuren lära sig att inte frukta den vita, en process som kallas utrotning. Hur väl djuret lär sig och befäster minnet av att lära denna uppgift kan observeras under en utdöende minns prov ges en tid efter utrotning utbildningen. Mindre rädsla uttryck under utrotning minns visar god utrotning minne konsolidering. Nya rön från vårt laboratorium visar att östrogen kan modulera konsolideringen av rädsla utrotning minne och förbättrar utrotning återkallande. Specifikt honråttor som släcks i proestrus fasen hos estrous cykeln under vilken cirkulerande östrogennivåer topp, uppvisar förbättrad retention av utrotning minne. Däremot honor som släcks i låga östrogen metestrus fasen display relativt dålig utdöende minns, som kan förbättras med exogen estradiol administration före eller omedelbart efter utrotning träning 15,16. De neurala mekanismer för utrotning minneskonsolidering (inkluding roll könshormoner) hos kvinnor är inte klart.
Hos försöksdjur kan undersökas roll hormoner använder invasiva kirurgiska borttagning förfaranden såsom kastrering och ovariektomi. Efter återhämtning från kirurgi, är könshormoner ofta exogent manipuleras under utförandet av en beteendevetenskaplig uppgift 19. Detta tillvägagångssätt har gett viktig information om könshormoner och är användbar eftersom den möjliggör välkontrollerade manipulationer av könshormoner (i termer av timing och dos) 20-23. Detta tillvägagångssätt, dock inte bedöma inverkan av de naturligt förekommande svängningar som uppstår över estrous cykeln och inte heller representerar "normala" djur, vilket begränsar translationell potential att humanstudier. Det har väl dokumenterat att kvinnliga könshormonnivåer topp och nedgång vid specifika faser av estrous cykeln, och östrogenreceptoruttryck förändringar inom cykeln,och efter ovariektomi 24. Således finns det ett behov av att genomföra studier på kvinnor med intakta gonaderna och förfina experimentell design för att på ett tillförlitligt sätt studera de effekter som höga och låga östrogen stater kan ha för honor hela deras livslängd.
Detta protokoll fokuserar på effekten av östrogen på neurobiologiska system involverade i rädsla utrotning. Det beskriver hur man: 1) noga följa estrous cykeln, 2) förbereda effektiva doser av östradiol för systemisk administration, och 3) följa en beteende paradigm som innehåller rädsla konditione, utplåning, och minns i naturligt cykling honråttor. Detta protokoll kan modifieras med andra farmakologiska manipulationer och cellulära och molekylära verktyg för att hjälpa studier för att bättre förstå könsskillnader som observerats i kondition fruktar utrotning beteende. Observera att de förfaranden som beskrivs nedan är de utnyttjas inom vårt laboratorium, och det finns ett antal varianter av dessa förfaranden in litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla Metoderna i det här protokollet har godkänts av underutskottet för forskning Djurvård, som fungerar som Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) för Massachusetts General Hospital, och är i överensstämmelse med National Institutes of Health riktlinjer.
1. djurstallar och hantering Tillvägagångssätt
- Vid ankomsten, hus vuxna Sprague Dawley honråttor ca 8-10 veckor gamla (som väger 200-225 g) i grupper om 3-4 tums plastbackar med flis sängar. Behåll dem på en diet av ad libitum tillgång till chow och vatten och en 12 timmar ljus / mörker-cykel. Lämna råttor för att acklimatisera sig till den bostadsförhållanden och djuranläggning för minst 1 vecka.
OBS: Alla förfaranden detta manuskript bedrivs under ljuscykeln. - Efter denna acklimatiseringsperiod hantera alla djur för 5 min vardera för 2-3 dagar. Korrekt plocka upp råttorna en i taget (med stöd av bålen och inte av svansen),hålla dem säkert, och klappa dem under denna tid. Handtag djur som visas mer stressade, hoppigt, eller orolig för längre tidsperioder. Gör detta för att minimera hantera stress, vilket kan påverka följande steg i detta protokoll.
OBS: Antalet dagar och tid att hantera djuren kan variera mellan olika labb; dock bör dessa vara konsekvent mellan experiment inom samma lab.
2. Övervakning Östrogencykeln: vaginala pinn Utsmetning och Färgningsprocedur
- Gör 0,9% koksaltlösning (natriumklorid löst i destillerat vatten). Fukta en bomullspinne i denna lösning. Blot spetsen med hjälp av en pappershandduk för att undvika övermättnad, vilket kan leda till otillräcklig provtagning eller förlust av celler. Håll svansen uppåt bort från slidöppningen, försiktigt in bomullsspetsen in i slidan och rulla runt väggarna för att fånga lösa vaginala celler.
- Om djuret urinerar på spjälsängton spets, byt mot en ny, som förorening urin kommer att göra det svårt för fas identifiering. Var ytterst försiktig så att inte orsaka lidande för djuret under denna procedur eftersom exponering för stress kommer att störa estrous cykeln. När badda, syftar till att uppnå en snabb insättning och uttag som inte är för djupt för att minimera extra stimulans till livmoderhalsen, vilket kan framkalla pseudodräktighet.
OBS: pseudodräktighet kan identifieras som en acyklisk estrous cykel som normalt varar i cirka 12 dagar, dvs dagarna i diestrus 25. - Försiktigt bort applikatorspetsen och rulla den på en pre-märkt objektglas. Undvik att trycka för hårt så för mycket vätska på bilden kan göra fas identifiering svårt när torrt.
OBS: En bild kan innehålla flera dagar för varje djur, även om det kan ske efter individuella önskemål. - Se till att prov överföringar till bilden. Samla prover för several dagar i följd på en bild för att bättre kunna spåra och identifiera dagliga brunst faser förändringar.
OBS: Om möjligt, är det också perfekt om folket samla in prover förblir desamma för alla djur. - När bilden är torr, börja färgningsprotokollet för fas identifiering. Använda färgningssats (se tabell för material), sänk diabilder 10 gånger i fixativ (ljusblå), 10 gånger i fläcklösning (rosa), och 5 gånger i kontrastlösning (lila). Skölj glider försiktigt under rinnande vatten. Låt diabilder helt lufttorka innan du visar under mikroskop.
OBS: Den vanligtvis 4-5 dagar långa Östrogencykeln består av (i denna ordning): brunst (E), metestrus (M), diestrus (D), och proestrus (P) 26. Brunst präglas av blå, cornified celler, metestrus av leukocyter och en kombination av cornified och kärnförsedda celler, är diestrus liknar metestrus i närvaro av celltyper utom de är mycket glesa och proöstrus med lila-färgade aggregatav celler med kärnor (Figur 1). Det finns olika färgningsförfaranden, utöver de som beskrivs ovan, som är lika effektiv för vaginal smear cytologi. - Samla prover för minst två kompletta cykler (~ 8-10 dagar) för att övervaka faserna noggrant före experiment. Var konsekvent med tid på dagen de prover tas. Samla vaginala smear prover dagligen hela och fram till slutet av försöket.
3. Pre-exponering
- Före initiering av experimentet, pre-utsätta djuren för konditionekamrarna att djuren acklimatisera till sammanhanget (konditionekammare) innan någon beteendetester.
- Pre-exponera honorna till kamrarna konditione (belägna i ljuddämpande lådor) med husets belysning i 20-30 min per dag i 3 dagar före varje experiment. Tilldela lådan de är förexponerades till som deras kammare för studien. Ordentligt ren than lådor (väggar och brickor) mellan sessioner och djur för att ta bort lukter eftersom de kan påverka beteende och estrous cykeln.
4. Dag 1: Tillvänjning / rädsla Conditioning
- När djuren har kontrollerats vara i brunst fasen av deras estruscyklerna, börja tillvänjning / konditione fasen av 3-dagars experiment.
- Ta pre-tonen baslinjen åtgärder för frysning före den första tonen rade stimulus (CS) presentationer på varje dag av experimentet. Gör detta genom att förvärva procent frysning poäng (beräknas genom att sekunderna bringade orörlig med varaktighet rättegången, multiplicerat med 100) under stimulus-frånvarande tidsintervall vid början av den första CS-alone rättegång innan CS debut.
OBS: Dessa åtgärder kan användas för att bedöma och jämföra baslinjen frysnings med dem under tillvänjning, konditionering, utplåning, och minns. - Att bedriva utrotning utbildning under metestrus fasen,konditionera råttorna i deras sista brunst. Svabb och identifiera estrous fas (steg 2) varje dag innan försöksprotokollet (conditioning / utdöende / recall). Som brunst fasen kan pågå längre än en dag, för att använda cykelhistoria förutse längd faser för att avgöra när djuren är redo att börja träna.
- Ta pre-tonen baslinjen åtgärder för frysning före den första tonen rade stimulus (CS) presentationer på varje dag av experimentet. Gör detta genom att förvärva procent frysning poäng (beräknas genom att sekunderna bringade orörlig med varaktighet rättegången, multiplicerat med 100) under stimulus-frånvarande tidsintervall vid början av den första CS-alone rättegång innan CS debut.
- I kamrarna konditione ansluter mul- chockgallergolv till en elektrisk stimulering generator. Använd en stimulering nivån 0,5-0,6 mA som den obetingat stimulus (US). Använd en 4 kHz, 80 dB ton som betingade stimulus (CS).
OBS: Dessa parametrar kan variera mellan laboratorier och kan ändras för optimal konditionering.- Om frysanalysprogrammet kräver visuella ledtrådar (i motsats till temporal), co-aktivera en LED-ljus med tonen. Placera ljuset på utsidan av operant kammare, inom videoramen. I början av varje försök, aktivera LED-ljus och hålla den belysta fram till slutet av the försöket.
OBS: Detta ljus syns inte av djuret och endast fungerar som en markör för initiering och slutet av studien inom de inspelade videofiler (som ska användas för att mäta frysbeteende).
- Om frysanalysprogrammet kräver visuella ledtrådar (i motsats till temporal), co-aktivera en LED-ljus med tonen. Placera ljuset på utsidan av operant kammare, inom videoramen. I början av varje försök, aktivera LED-ljus och hålla den belysta fram till slutet av the försöket.
- Placera djuren in i konditione kammare för 5 CS-ensam prövningar av tillvänjning. Omedelbart efter tillvänjning sessionen, utför 7 parade CS-amerikanska prövningar av rädsla konditione. Se till att CS tonen varar i 30 sekunder och coterminates med 0,5 sek amerikanska chock. Genomför försök i alla sessioner (tillvänjning, konditionering, utplåning, och minns) med rörlig intertrial intervall genomsnitt 3 minuter.
- Vid slutet av konditioneringssessionen tillbaka djuren till sina hemburar och till djurfaciliteten förrän nästa dag.
5. Dag 2: Estradiol Förberedelse
- Svabb och identifiera estrous fasen för alla djur som genomgick Dag 1 i detta protokoll. Förbered östradiol (även känd som E2, 17beta-östradiol, ellerbeta-östradiol) för en 15 ng / kg dos subkutan injektion med användning av sesamolja eller 0,9% koksaltlösning som vehikel.
- För att beräkna hur mycket östradiol att förbereda för injektioner, använd kroppsvikten av alla djur, som mättes och inspelade när de rade på dag 1 i detta protokoll.
- Gör beräkningar för att standardisera den administrerade volymen av estradiol (dvs 0,2 ml) per råtta. Eftersom estradiol är svårt att lösa på grund av dess vattenolöslighet och kräver en stor volym av lösningsmedel för liten dos, bereda en stamlösning genom att blanda östradiol i sesamolja över värme tills upplöst. Lösningen kan sedan ledas genom ett 0,22 | im filter för att avlägsna föroreningar. Till exempel lägga till en beräknad volym av en 3000 mikrogram estradiol / 1 ml sesamolja stamlösning till den totala behövs volymen sesamolja i syfte att uppnå en 15 ug / kg dos i en 0,2 ml injektionsvolym per djur.
OBS: Du kan också använda andra former av östrogen tha t är vattenlösliga och lättare att lösa upp.
6. Dag 2: Estradiol Administration / Extinction Utbildning
- Administrera östradiol subkutant. Lyft den lösa huden mellan skulderbladet i nacken i en mild nypa och för in injektionsnålen i triangeln som bildas av vecken huden.
- 30 minuter efter subkutana injektioner av östradiol, placera djuren i kamrarna konditione igen och börja utrotning träning. I denna utrotning session, utför 20 CS-ensam prövningar, med varje prövning bestående av en 30 sek, 4 kHz, 80 dB tonen, presenterades vid en variabel intertrial intervall genomsnitt 3 min.
OBS: Effekten av estradiol på återkallande uppstår när estradiol administreras före utrotning utbildning eller omedelbart efter utrotning. Effekten är inte observerats 4 h efter utrotning, så det rekommenderas att injicera nära i tiden till början eller slutet av träningspasset 15.
- 24 timmar efter utplåningen träning, svabba djuren som avslutade Dag 1 och 2 i detta protokoll.
- Placera djuren i sina tilldelade kamrar konditione (samma som dag 1 och 2). Börja utrotning minns sessionen genom att presentera tre CS-enbart studier (de tre prövningar av utrotning minns), som består av endast 3,80 dB CS-ensam försök med intertrial intervaller som liknar de 20 försök som administreras för utrotning utbildning såsom beskrivs i steg 6.2.
- Efter avslutad återkallelsen sessionen tillbaka djuren till sina hem burar.
8. Data Analysis
- Förvärva beteendedata via video och analysera dem med hjälp av datorprogram.
NOT: Frysning poängen kan också manuellt räknas av en försöksledaren som är blind för läkemedelsbehandling genom att tajma frysning skjutningarna under CS presentationen av varje försök, uttryckt i procent av den tid som används frysning under tonen. Frysning ärdefinieras av fullständig brist på rörelse med undantag för andningen under de 30 sek CS-amerikanska studier. Beräkna procent frysning genom att dividera sekunder bringade frysning (orörlig) med 30 sekunder (varaktighet av rättegången) multiplicerat med 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna rädsla utrotning minns protokoll, var procent frysning mätt som en indikator på rädsla. Djur som släckas väl och behållit minnet av utrotning utbildningen uppvisade låg rädsla på den sista dagen av beteendetester under utrotning minns. Manliga och kvinnliga råttor skiljer sig inte väsentligt i kondition rädsla uttryck under konditioneringen, utplåning, och minns faser (Figur 2). Dock blir en könsskillnad uppenbart när djuren analyseras separat som hög och låg östrogenbrunst fas grupper. Honråttor som genomgår utrotning träning under låg östrogen metestrus fasen av estrous cykeln inte minns utrotning minnet på dag 3 samt de utbildade i proestrus (Figur 3). Dessa metestrus honor uppvisar också signifikant större rädsla återhämtning under utrotning recall (dåligt utrotning minne) jämfört med män. Men när metestrus honor är subkutant injected med 15 mikrogram / kg dos av östradiol före utrotning lärande, verkar konsolidering av rädslan utrotning minnet förbättras vilket framgår av låg frys under utrotning recall (Figur 4). Därför är dessa data indikerar att könshormoner kan modulera rädsla utrotning återkallande och även förmedla könsskillnader i betingade rädsla utrotning beteenden.
Figur 1: Bilderna av celltyper över brunstcykelfaser (förstoring 20X) proestrus kännetecknas av massor av runda, lila-färgade kärn epitelceller.. Brunst kan identifieras genom aggregat av blåfärgade, skiv cornified celler. Metestrus och diestrus uttrycker en kombination av celltyper (leukocyter, kärn och cornified celler) men visa färre celler. Östrogennivåer fluktuera hela brunstfaser, Med en topp under proestrus. (Met = metestrus;.. Diest = diestrus;. Proest = proöstrus). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Jämförelse mellan män och kvinnor över de tre faserna i försöket Det finns inga signifikanta könsskillnader som observerats i tillvänjning (. Hab), luftkonditionering (. Cond), utplåning, eller hämta faser av försöket 15.
Figur 3: beteendemässiga skillnader mellan proestrus (högt östrogen) och metestrus (lågt östrogen) honor Honor i hög östrogen proöstrus fasen o.f estrous cykeln uppvisar mindre rädsla än de i låg östrogen metestrus. Dessa data tyder på att östrogennivåerna i naturligt cykling honor kan påverka konsolideringen av rädsla utrotning minne, moduler minns 24 tim senare 15.
Figur 4: Östrogen behandling i metestrus honor. Administration av östradiol 30 min innan utrotning träning (pil) underlättar utrotning minns jämfört med fordon 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rädsla utrotning har studerats ingående hos hanråttor med de neurala mekanismerna förmedlar kondition rädsla utrotning identifieras och bedömas under olika manipulationer. Relativt få studier har undersökt honråttor eller roll könshormoner i rädsla utrotning. För att specifikt studera effekterna av östrogen på rädsla utdöende, är naturligt cykling honråttor utsätts för en tredagars beteende paradigm. Detta förfarande består av tillvänjning / konditione, utplåning, och utrotning minns faserna. Med hjälp av detta protokoll, har det visats att honråttor tränade med utrotning under låg östrogen metestrus fasen uppvisar högre frysning (eller nedsatt utdöende recall) jämfört med kvinnor som är släckta i hög östrogen proöstrus 15. Administration av östradiol före utrotning utbildning under metestrus fasen modulerar konsolideringen av utrotning minne 16. Detta framgår av en minskning i freezing under utrotning minns. Tillsammans utgör dessa resultat belyser vikten av att genomföra kvinnliga studier med hänsyn till påverkan av äggstockshormoner och estrous cykeln på beteendet. Även kontrollexperiment inte har beskrivits här, kommer det att bli nödvändigt att ta med lämpliga kontroller, det vill säga inga utrotning grupper, för att ytterligare utvärdera inverkan av östrogen på processer som ingår i utrotning minne konsolidering.
Syftet med detta protokoll är tvåfaldigt: 1) för att undersöka effekterna av östrogen på rade rädsla utrotning under specifika faser av Östrogencykeln hos intakta djur, och 2) att undersöka hur akut estradiol ersättare under honan är normalt låg östrogen staten kan modulera dess beteende. Genom den vaginala svabbar procedur som beskrivs här, kan de fyra faserna i Östrogencykeln identifieras: brunst, metestrus, diestrus och proöstrus. Detta ger oss möjlighet att bedöma beteende när äggstockshormoner such som östrogen är naturligt vid låga och höga koncentrationer. Till exempel, östrogennivåerna är låga under estrus (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), och diestrus (25-40 pg / ml) faser, men hög under proöstrus (~ 75 pg / ml) fasen av estrous cykeln 27,28. Dessa faser inte bara skiljer sig i hormonell miljö men också i längd. Även variabel har proöstrus varit normalt observeras att pågå i 12 till 14 timmar; brunst för 25 och 27 timmar; metestrus för 6-8 h; och diestrus för 55-57 tim. Tiden för varje fas kan vara längre eller kortare än en dag (beroende på djur), vilket leder till 5-dagarscykler som inkluderar två dagar av antingen diestrus eller brunst. Som nämnts, proestrus och metestrus är kortare faser (12-14 och 6-8 h, respektive) och kan missas. I detta protokoll är det därför viktigt att noggrant övervaka estrous cykeln när djurets naturligt cykling hormoner för att undersöka inter fas skillnader i förmågan att minnas utrotning utbildningfrån dagen innan. Östrogencykeln i honråttor, ungefär som det mänskliga menstruationscykeln, är också känslig för många externa faktorer, såsom ålder, stress, tid på dygnet, bostadsförhållanden, temperatur, etc., och bör beaktas när man planerar experiment. Ett djur kan bli acyklisk (förlängd brunst / diestrus) eller visa en oregelbunden cykel (kortare än 4 dagar eller längre än 5 dagar) före eller under studien. I detta fall skulle dessa djur undantas från de experimentella analyser, som är strikt testning under vissa faser av estrous cykeln. Viktigt att notera är övergångsstadier under vilka proverna blandas med slem, vilket gör det lite svårt att tydligt identifiera de specifika celltyper som kännetecknar varje fas. Detta kan också bero på tidpunkten på dagen pinnen tas. Om det finns en överdriven mängd av slem-liknande urladdning under smeta samling som ett resultat av daglig svabbning, vilket gör att flera hanterings dagar att passera utan swabbingkan lösa problemet.
Förutom estrous fasen identifieringsmetod som beskrivs här, kan andra metodologiska verktyg användas för att få mått på cirkulerande serumäggstockhormonkoncentrationerna. Exempelvis kan östrogen koncentrationen kvantifieras i blodprov med användning av en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). I detta förfarande, östrogener inom serum / plasma prover binda till en specifik anti-östrogen antikropp, som är kopplad till ett enzym. Enzymets substrat producerar en reaktion som resulterar i en synlig signal, såsom en färgförändring som kan mätas med användning av en spektrofotometer. Detta verktyg beräknar absorbans och ger en kvantifiering av östrogennivåer i provet. Denna metod kan vara användbar vid bedömningen naturligt fluktuerande östradiolnivåer över estrous cykeln, och ännu viktigare, vid specifika tidpunkter under experimentet. Den kan också användas för att bestämma hur exogen administrering av östrogen kan förändra normenal fysiologiska koncentrationer. Mätning av östrogenkoncentrationer från blod kan förebygga problem med fas identifiering under övergångsstadier, eller när utstryk är svåra att läsa på grund av slem i proverna. Tyvärr kan denna metod bli ganska dyrt och erbjuder fördröjda resultat jämfört med vaginal smear samling.
Rutiner för att erhålla tillräckliga blodprov, t.ex.., Via svansvenen, orbitalsinus, svans klipp och saphenusven 29, kan orsaka onödig stress för djuret. Detta kan påverka hormonnivåer vid kritiska tidpunkter i försöket, vilket leder till felaktiga eller skeva mätningar. Använda trunk blod för att mäta östradiolnivåer är terminal och därför ger mycket begränsad information om hormonella svängningar inom faserna. Bedöma vaginal cell cytologi tycks erbjuda ett bättre alternativ. Även om denna metod endast kan ge en grov uppskattning av äggstockhormonprofiler tvärs brunstfaser, kan detminimera stress och är därefter mindre störande för beteendeexperiment.
Det finns olika former av östrogena steroider som naturligt cirkulerar i människor och icke-humana djur, såsom östriol, östradiol, och östron. I detta protokoll är östradiol akut administreras via subkutana injektioner. Estradiol (synonymt med E2, 17beta-östradiol eller beta-estradiol) används i detta protokoll, eftersom det är den mest potenta formen av naturligt förekommande östrogen i icke-dräktiga honor 30. I motsats till akuta injektioner av östradiol, har andra laboratorier användes metoder för kronisk östrogenadministrering. Till exempel, subkutana implantat av långsam frisättning pellets eller silastiska kapslar möjliggöra stadig, kontinuerlig tillförsel av östrogen eller fordonslösning 19. Detta förfarande används vanligtvis i kombination med ovariectomies som eliminerar djurets normala reproduktionstillstånd.
Den manipuningar diskuteras här fokuserar på naturliga hormonella stater för att underlätta den kliniska tillämpningen av laboratorieresultat. Personer med posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) är allmänt försämras i sin förmåga att släcka rädsla för ett stimulus som rör deras traumatiska erfarenheter och för att komma ihåg detta utrotning. Detta tillstånd kvarstår ofta långt efter händelsen har passerat. Långvarig exponering terapi är en vanlig behandlingsalternativ för PTSD som bygger på utrotning baserade processer som studerats i gnagarmodeller som den som beskrivs här. Intressant, kvinnor är ungefär dubbelt så stor risk som män att utveckla stress och ångestrelaterade psykiatriska sjukdomar 31. Denna könsskillnad i förekomst kan kopplas till könsskillnader i rädsla utrotning processer och ligger till grund för den potentiella kliniska betydelsen av dessa laboratoriefynd. Trots den högre förekomsten av PTSD hos kvinnor, relativt få fruktar utdöende studier på gnagare har utförts hos kvinnor. Kvinnliga studier fokuserarende på den roll som könshormoner bör inte förbises när man undersöker könsskillnader i beteende. Karakterisera beteendeeffekter av naturligt fluktuerande hormonnivåerna över Östrogencykeln ger värdefull insikt i de grundläggande skillnaderna i beteende mellan män och kvinnor. Protokollet ger en grundläggande modell för att underlätta framtida studier av äggstockshormoner och deras inflytande på, men inte begränsat till, kognitiva och beteendemässiga processer såsom rädsla utrotning. Detta protokoll är inriktat på en specifik gonadal hormon, östrogen, dock effekterna av andra hormoner såsom progesteron och testosteron kan också utvärderas. Använda beteende paradigm presenteras här tillsammans med andra farmakologiska, cellulära och molekylära tekniker (dvs, lokaliserade drog infusioner, immunohistokemi, western blot), framtida forskning kan identifiera specifika platser / mål av östrogen åtgärder i hjärnan som kan öka beteendeterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna till detta manuskript har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
