Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/52203
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Stuttgart University

Abstract

يسين مثيلة هو التعديل بعد الترجمة الناشئة وتم التعرف على العديد من هيستون وغير هيستون-البروتينات، حيث أنه يلعب دورا حاسما في تطوير خلية والعديد من الأمراض. وقد تم تحديد مواقع 5،000 مثيلة ليسين تقريبا على البروتينات المختلفة، وهي تحدد من قبل عدد قليل العشرات من ميثيل البروتين ليسين. وهذا يشير إلى أن كل PKMT methylates بروتينات متعددة، ولكن حتى الآن تم التعرف على واحد أو اثنين فقط ركائز للعديد من هذه الإنزيمات. تحليلات لنهج هذه المشكلة، أدخلنا مجموعة الببتيد تستند الركيزة خصوصية PKMTs. صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف خصوصية PKMTs بسبب مثيلة من عدة ركائز مع سلاسل مختلفة يمكن اختبارها على مجموعة واحدة. نحن توليفها صفائف الببتيد على غشاء السليلوز باستخدام المزج Intavis SPOT وتحليلها خصوصية مختلف PKMTs. وبناء على هذه النتائج، بالنسبة للعديد من هذه الإنزيمات، رواية الصورةيمكن تحديد ubstrates. على سبيل المثال، لNSD1 من خلال توظيف صفائف الببتيد، أظهرنا أنه methylates K44 من H4 بدلا من H4K20 ذكرت وبالإضافة H1.5K168 هو الركيزة يفضل بدرجة كبيرة خلال H3K36 المعروفة سابقا. وبالتالي، صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف كيميائيا وPKMTs.

Introduction

في العقدين الأخيرين، أظهرت عدة تقارير على أهمية التعديلات بعد متعدية (PTM) في التنمية الخلوية والعديد من الأمراض مثل السرطان، ولكن في الآونة الأخيرة البروتين يسين مثيلة قد ظهرت كعامل حيوي PTM آخر. في حين تم العثور على هيستون في البداية مثيلة ليسين ليكون علامة لونين الأساسية، وأظهر العمل في وقت لاحق أيضا يسين مثيلة من عدة بروتينات غير بسيطة 1-4. يتم تحفيز نقل متتابعة من مجموعات الميثيل من S-adenosyl-L-ميثيونين إلى مجموعة-ε الأمينية من بقايا يسين من قبل عائلة من الإنزيمات يسمى البروتين ليسين ميثيل (PKMTs) الذي يحتوي على أكثر من 60 البروتينات في الجينوم البشري. وقد اكتشفت في البداية PKMTs كما هيستون تعديل الانزيمات التي ميثيل بقايا يسين محددة ولكن أظهرت تقارير لاحقة أنها يمكن أيضا ميثيل البروتينات غير بسيطة 5. حتى الآن، تم تحديد ما يقرب من 5،000 مواقع مثيلة ليسين على البروتينات المختلفة 6

وتستخدم على نطاق واسع صفائف الببتيد أدوات لتحليل الكيمياء الحيوية من الأجسام المضادة، الببتيد الانزيمات تعديل ورسم خرائط لمواقع التفاعل البروتين البروتين (الضد مستضد، مستقبلات يجند) 7-9. وهناك حاجة إلى عدة مئات من الببتيدات لSUCح التطبيقات. وطرق المختلفة المتاحة لتخليق الببتيد، الببتيد التوليف بينها على الراتنج يستخدم عادة للغاية، ولكن له حدود في الإنتاجية وأنها مكلفة نسبيا. تم حل هذه القضايا مع إدخال طريقة تركيب SPOT فرانك وزملاؤه 10. يسمح للطريقة التوليف SPOT تجميع لعدة مئات من الببتيدات بالتوازي وفي المتوسط ​​أنها غير مكلفة مقارنة توليف الراتنج. الببتيدات توليفها على غشاء السليولوز يمكن استخدام إما مباشرة لمختلف التطبيقات أو الببتيدات يمكن المشقوق من الغشاء واستخدامها كأداة الببتيدات المجانية للفي المقايسات حل أو لإعداد ميكروأرس الببتيد 10-13.

SPOT التوليف هو البديل من الببتيد مرحلة التوليف الصلبة، والذي يستخدم غشاء السليلوز كدعم قوي وتوظف القياسية Fmoc الكيمياء 10-13. وبالتالي، فإن تركيب سلاسل الببتيد يبدأ في نهاية-C محطة ويمضي نحونهاية-N محطة على النقيض من التوليف البيولوجي في ريبوسوم. وبين functionalized أغشية السليلوز لإلحاق أول الأحماض الأمينية تنشيط (الشكل 1). وتستند هذه الطريقة SPOT على تسليم متتابعة من الأحماض الأمينية تفعيلها في بقطرة من المذيب إلى مناطق محددة على الغشاء باستخدام نظام pipetting لالآلي. والاستغناء عن قطرة من السائل على غشاء مسامي حيث أنها تشكل بقعة دائرية الرطب، الذي يعمل في وقت لاحق كما مفاعل مفتوحا لتفاعلات كيميائية في التوليف الببتيد. يتم تحديد حجم بقعة على حجم الاستغناء والقدرة الاستيعابية للغشاء، يتم ترتيب مضاعفات مثل هذه البقع كما المصفوفات. حجم التوليف يرتبط حجم البقعة وقدرة التحميل من الغشاء. المسافة بين البقع وكثافة صفائف تدار من قبل متفاوتة الأحجام الفور. غشاء السليلوز لديها العديد من المزايا على النحو المرحلة الصلبة في التوليف الببتيد، أنها غير مكلفة، متسامح إلى كيميائياعتلال الأعصاب الحركية المستخدمة في تركيب الببتيد، مستقرة في المحاليل المائية وسهلة في التعامل معها. وبالإضافة إلى ذلك، طبيعته المحبة للماء يجعلها مناسبة لعدة أنظمة الفحص البيولوجية. يمكن أن يتم تركيب SPOT يدويا أو آليا (ل1000s من الببتيدات) اعتمادا على العدد المطلوب من الببتيدات. ويستخدم مركب SPOT مؤتمتة بالكامل من Intavis (كولن، ألمانيا) لطلباتنا. ويسمح تركيب الببتيدات في كميات مختلفة وطول مختلف. وقد تم تجميع الببتيدات الخطية بانتظام مع 15 إلى 20 الأمينية طول حامض، في الببتيدات إضافة ما يصل إلى 42 من الأحماض الأمينية يمكن أيضا أن تكون خطوة حكيمة التوليف 14،15 إعدادها. ومع ذلك، زيادة عدد الأحماض الأمينية يؤدي إلى تخفيضات في العوائد اقتران الشاملة، مما يؤثر على نوعية من الببتيدات. ونظرا لكمية قليلة من الببتيدات في بقعة، والمنتجات وغالبا ما تكون صعبة لتنقية ونوعية الببتيدات الفردية لا يمكن تقييمها بسهولة. ولذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من SPOT peptلا بد من تأكيد صفائف بيئة تطوير متكاملة سواء مع الببتيدات توليفها من قبل الأساليب القياسية في نطاق أوسع، والتي يمكن تنقيتها وتحليلها وفقا للمعايير في التوليف الببتيد أو عن طريق تجميع البروتينات التي تحتوي على سلاسل الببتيد المطلوب. ومع ذلك، وجدنا التوليف SPOT أن تكون موثوق بها للغاية ويؤدي عموما أن يكون استنساخه. لا يقتصر التوليف SPOT لproteinogenic الأحماض الأمينية، والعديد من الأحماض الأمينية تعديل المتاحة تجاريا كما يمكن استخدامها لتخليق، مما يسمح الببتيدات إلى أن يتم تعديل قبل وبعد الانقسام النهائي للمجموعة حماية الجانب السلسلة، وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح أيضا إدماج فسفرته، مميثل أو الأسيتيل الأحماض الأمينية 11.

مكتبات الببتيد ثبتوا توليفها من خلال طريقة SPOT يمكن استخدامها مباشرة للعديد من المقايسات البيولوجية والبيوكيميائية. نحن العاملين صفائف الببتيد تضم 300-400 الببتيدات للتحقيق في خصوصية ركيزة من PKMTs. لmodifi الأنزيميالموجبة، يتم تحضين صفائف الببتيد مع PKMT منها وصفت [ميثيل 3 H] -AdoMet في العازلة المناسبة. ويتم تحليل الحامض الركيزة منها باتباع نقل الأنزيمية للمجموعات الميثيل المسمى بالإشعاع من AdoMet إلى الركيزة الببتيد عبر تصوير الإشعاع الذاتي (الشكل 3). بواسطة هذا الإجراء، صفائف الببتيد تسمح دراسة مثيلة من ركائز الببتيد مختلفة في نفس الوقت. أحد المزايا المهمة لهذا الأسلوب هو أن جميع الببتيدات وميثليته في المنافسة، هذا إلى أنه خلال المرحلة خطية من حركية مثيلة، ومثيلة النسبي لكل الببتيد يتناسب مع معدل ثابت الحفاز مقسوما على ثابت التفكك (ك القط / K D) من انزيم لالببتيد الركيزة منها. ولذلك، يرتبط مقدار النشاط الإشعاعي إدراجها في كل بقعة مباشرة مع النشاط الأنزيمي نحو الببتيد معين. باستخدامنتائج تجربة مثيلة مجموعة الببتيد، والوضع خصوصية PKMT يمكن تعريف وبناء على هذه الرواية ركائز يمكن أن يستند. صفائف الببتيد تسمح التحقق من صحة كفاءة السريع وتكلفة مثيلة من ركائز جديدة على مستوى الببتيد. لهذا، يتم إعداد المصفوفات التي تحتوي على ركائز جديدة توقع مع الببتيدات المعدلة تحتوي على علاء بدلا من ليز في المواقع المستهدفة وكذلك الببتيدات الإيجابية والسلبية السيطرة. وأخيرا، فإن ركائز الرواية يمكن أن تكون على استعداد كما البروتينات مع المسوخ، والتي يتم تبديل اليس هدف لعلاء ويمكن التأكد من مثيلة في مستوى البروتين. اعتمادا على نتائج، وهذا هو ثم تليها الدراسات البيولوجية معالجة الأدوار المحتملة للمثيلة من ركائز البروتين وصفها حديثا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الببتيد صفائف

  1. البرمجة من الببتيد المتتاليات
    1. تصميم سلاسل الببتيد لتركيب باستخدام برنامج MultiPep نصاب. أدخل تسلسل الببتيد في رموز حرف واحد.
      الببتيد 1: TARKSTGGKA
    2. توليد ألانين أو أرجينين مسافة المكتبات مع أمر معين (.replace، A) لفحص الأحماض الأمينية الهامة اللازمة للاعتراف ركيزة محددة. على سبيل المثال في المثال التالي السطر الأول هو تسلسل النوع البري من وإلى السطر الثاني يتم تبديل كل الأحماض الأمينية في الببتيد إلى بالتتابع ألانين.
      استبدال، A
      TARKSTG
      و-ARKSTG
      T- A -RKSTG
      TA- و-KSTG
      التشخم و-STG
      TARK- و-TG
      TARKS- و-G
      TARKST- A
    3. استخدام أوامر مشابهة (.replace R،.استبدال N الخ) كما هو موضح في 1.1.2 مع جميع المتوفرة طبيعيا بقايا الأحماض الأمينية (النهاية حذف السيستين، ميثيونين والتربتوفان، لأن هذه البقايا هي عرضة للأكسدة وانخفاض العائد أحيانا التوليف) لتجميع مجموعة الببتيد لتحديد التوافق الركيزة عزر تسلسل للإنزيم.
      ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 4A، المحور الأفقي يمثل تسلسل الببتيد معين ويمثل المحور الرأسي الأحماض الأمينية التي تم تحديدها للقيادة. وعلى غرار تسلسل هو مبين في 1.1.2، وعلى المحور الرأسي يعني أن بالتتابع علاء يستبدل كل موقف من تسلسل معين في الصف الأول في الشكل. 4A. وبالمثل بالتتابع أرجينين يستبدل كل الأحماض الأمينية في الصف الثاني وهلم جرا مع الأحماض الأمينية الأخرى. وقد تم تجميع كاملة المكتبات مجموعة الببتيد عن طريق استبدال منهجي كل بقايا في الببتيد تسلسل الركيزة المقدمة مع كل من الالبريد الأخرى المتوفرة طبيعيا بقايا الأحماض الأمينية، وهذا يساعد على فهم تأثير كل بقايا في كل موقف من تسلسل معين.
    4. بدلا من ذلك، مثيلة من ركائز الببتيد المعروفة أو توقع يمكن التحقق منها بسهولة تجميع المكتبات الببتيد مع الببتيدات المستهدفة من PKMT جنبا إلى جنب مع الضوابط مثيلة الإيجابية والسلبية (أي الببتيدات المعروفة لمميثل أو لا يعرف أن يكون مميثل). توليف الببتيدات خلال تبادل ليسين الهدف المفترض لألانين لتأكيد مثيلة ليسين الهدف كما هو مبين أدناه عن طريق البرمجة اليدوية.
      النوع البري الببتيد: STGG K PRQFL
      الببتيد متحولة: STGG وPRQFL
      ملاحظة: يحتوي البرنامج أيضا مخطوطات الملازمة لإنشاء مكتبات مختلفة، مثل رسم الخرائط حاتمة مع تحول الإطار المطلوب من تسلسل لرسم خريطة الأحماض الأمينية الهامة اللازمة للتفاعل.
  2. إعداد غشاء، الأحماض الأمينية لالكواشف د
    1. قبل تضخم الغشاء SPOT في DMF (N، N -Dimethylformamide) لمدة 10 دقيقة ثم ضع الغشاء الرطب على الإطار SPOT المزج دون فقاعات الهواء أو التجاعيد.
    2. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع الإيثانول بنسبة 100٪. تجف الأغشية تماما لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل بدء برنامج تركيب.
    3. في موازاة ذلك، يعد حديثا 0.5 M تركيزات العمل من الأحماض الأمينية Fmoc المحمية المتاحة تجاريا عن طريق تذويب لهم في NMP وأيضا إعداد المنشط وقاعدة كما هو موضح في الجدول 1.
    4. تأكد من أن جميع الحاويات حل النفايات من المزج SPOT تم تفريغ وإعادة ملء خزانات المذيبات مع DMF، والإيثانول وتأكسد.
      ملاحظة: الآن آلة جاهزة للتركيب.
  3. الإكتشاف من الأحماض الأمينية الأولى
    1. لتوليد السندات أميد مع المجموعة الأمينية الحرة على الغشاء، وتفعيل مجموعة كربوكسي من الأحماض الأمينية واردة من خلال الإعلاندينغ المنشط (N، N '-Diisopropylcarbodiimide) والحل قاعدة (الأثيل cyanoacetate hydroxyimino) إلى مشتقات الأحماض الأمينية.
    2. بقعة حجم المطلوب من الأحماض الأمينية تفعيلها على الغشاء بين functionalized الأمينية-PEG باستخدام الروبوت للبرمجة.
      ملاحظة: وبالتالي، يقترن C-محطة من الأحماض الأمينية إلى المجموعة الأمينية من الغشاء.
    3. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لضمان اقتران أفضل من الأول من الأحماض الأمينية تفعيلها. احتضان الغشاء لمدة 20 دقيقة ثم يغسل مع DMF لإزالة الأحماض الأمينية وفكت.
  4. حجب مساحات مجانية للمناطق غير بقعة
    ملاحظة: بعد اقتران أول-C محطة الأحماض الأمينية جميع الببتيدات إلى المجموعة الأمينية من الغشاء، المجموعات الأمينية بين البقع وأيضا بعض المجموعات الأمينية داخل المناطق بقعة لا تشكل السندات مع الأحماض الأمينية.
    1. منع هذه المجموعات الأمينية الحرة التي يحتضنها مع الحل السد (أنهيدريد الخليك 20٪ في DMF)لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا يتجنب اقتران من الأحماض الأمينية في دورات أخرى مع غشاء بدلا من سلسلة الببتيد المتنامية.
  5. إزالة Fmoc المجموعة
    1. بعد حجب، وغسل غشاء مع DMF 4 مرات ثم احتضان مع 20٪ تأكسد في DMF لمدة 20 دقيقة لإزالة مجموعة حماية Fmoc.
      ملاحظة: هذه الخطوة يؤدي إلى إزالة مجموعات Fmoc-حماية الأمينية ويسمى ذلك deprotection.
    2. بعد ذلك، ويغسل الغشاء مرتين مع DMF ومرتين مع الإيثانول واتركه حتى يجف.
      ملاحظة: الآن الغشاء هو على استعداد للاقتران من الأحماض الأمينية القادمة.
  6. سلسلة الاستطالة
    وتسمى إضافة كل من الأحماض الأمينية دورة: ملاحظة. وبصرف النظر عن اقتران الأول الأحماض الأمينية، وتبدأ الدورة مع deprotection من مجموعة Fmoc من الأحماض الأمينية إلى جانب واتبعت من قبل اقتران مجموعة الكربوكسيل تفعيلها من الأحماض الأمينية واردة إلى المجموعة الأمينية من الحماسي متزايدسلسلة المد والجزر.
    1. كرر الخطوات من 1.3 و 1.5 حتى يتحقق طول الببتيد المطلوب.
  7. تلطيخ
    ملاحظة: بعد دورة النهائية، ملطخة صفائف الببتيد مع برموفينول الأزرق لتأكيد التوليف الناجح للالببتيدات. برموفينول الأزرق يربط مع المجموعات الأمينية الحرة من الببتيدات. البقع الببتيد تظهر اللون الأزرق الفاتح بعد تلطيخ ولكن لشدة البقع تختلف تبعا لتسلسل الببتيد. هذا يسمح تلطيخ تأكيد الإزالة الكاملة للتأكسد، لأنه في وجود تأكسد برموفينول الأزرق لا وصمة عار على الببتيدات. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا يساعد أيضا للاحتفال صفائف الببتيد لمزيد من الاستخدام.
    1. بعد deprotection مجموعة Fmoc في دورة التوليف الماضية، وغسل غشاء مع DMF والإيثانول بنسبة 100٪. ثم، علاج الغشاء مع برموفينول الأزرق (0.02٪ برموفينول الأزرق في DMF) مدة لا تقل عن 5 دقائق حتى يتحول تماما الأزرق.
    2. بعد ذلك، ويغسل الغشاء مع DMF وETHيتبع أنول عن طريق تجفيف لمدة 10 دقيقة. الآن تأخذ بها غشاء من المزج وأداء deprotection سلسلة جانبية (القسم 1.8) يدويا. إذا لزم الأمر، تصوير غشاء لتوثيق نتائج الببتيد التوليف (الشكل 2).
  8. سلسلة الجانب Deprotection
    1. علاج الأغشية مع 20 إلى 25 مل من سلسلة الجانب خليط deprotection تتكون من حمض Trifluoroacetic 95٪ (TFA) ليلتصق المجموعات حماية سلسلة الجانبية والكواشف زبال (2.5٪ ماء و 2.5٪ triisopropylsilane) لحماية سلاسل الجانب من الأحماض الأمينية من التعديل خلال هذه الخطوة. تأخذ حجم كاف من خليط deprotection لضمان أن يغطي الغشاء تماما في صندوق مغلق بإحكام المقاومة للمواد الكيمائية واحتضان لمدة 1 إلى 2 ساعة في حين يهز بلطف.
    2. غسل غشاء ست مرات مع 20-25 مل من DCM (ثنائي كلورو ميثان) لمدة 2 دقيقة لكل منهما، وأخيرا مرتين مع الإيثانول بنسبة 100٪ وجففه في مجفف بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: الآنالغشاء يمكن استخدامها لإجراء التجارب. ويرد مخطط تركيب مجموعة الببتيد في الشكل 1.

2. التعبير البروتين وتنقية

  1. التعبير البروتين من PKMTs كما GST الإنشطار
    1. باستخدام تقنيات القياسية، استنساخ الجين ترميز طول PKMT الكامل أو مجال الحفاز في ناقلات التعبير البكتيرية (مثل pGEX-6p2) للتعبير عن ذلك كما البروتين GST الانصهار.
    2. نقل متجه مع PKMT المطلوب إدراجها في BL21 BL21 أو كودون بالإضافة إلى E. خلايا القولونية بواسطة طريقة الصدمة الحرارية أو أي طريقة أخرى.
    3. إعداد ما قبل الثقافة مع 30 مل من لوريا، BERTANI (LB) وسائل الاعلام في اليوم التعبير واحتضان عند 37 ° C لمدة 7 الى 8 ساعة مع الهز المستمر.
    4. وبعد ذلك، نقل 10 مل من قبل الثقافة في 2 L قوارير حيرة كبيرة تحتوي على 1 L من وسائل الاعلام LB واحتضان عند 37 ° C في الحاضنة مع الهز المستمر حتى متناول الثقافةوفاق كثافة بصرية محددة في 600 نانومتر.
      ملاحظة: في حين أن هذا يمكن أن يكون الأمثل لكل بروتين، ونحن لحث بشكل روتيني في لل 600Nm OD من حوالي 0.8. درجة الحرارة الحث يجب أن يكون الأمثل لكل بروتين بشكل فردي، وتشير بعض البروتينات التعبير جيدة في 22 ° C وبعض عند ارتفاع درجات الحرارة.
    5. تحول الخلايا إلى درجة حرارة تحريض لمدة 15 دقيقة، ثم حمل مع 1 ملم من الآيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactopyranoside والسماح للثقافة لتنمو لمدة 10-12 ساعة في درجة حرارة الاستقراء.
    6. بعد ذلك حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 x ج لمدة 15 دقيقة، وأخيرا يغسل بيليه مع 30 مل من العازلة STE (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 100 مم كلوريد الصوديوم و 0.1 ملي EDTA) وتخزينها في -20 ° C لمزيد من الاستخدام.
  2. تنقية البروتين
    1. ذوبان الجليد بيليه الخلية واعادة تعليق في 30 مل من العازلة صوتنة (50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT و 5٪ الجلسرين) وتعطيل من قبل صوتنة.
      ملاحظة: هذا عازلة نeeds ليكون الأمثل لكل بروتين في نهاية المطاف.
    2. الطرد المركزي المحللة الخلية في 22،000 x ج لمدة 1 ساعة، وبعد جمع طاف ويمر عبر عمود يحتوي على 600 ميكرولتر من الجلوتاثيون سيفاروز 4B الراتنج.
    3. غسل العمود مع 50 مل من العازلة صوتنة والقادم مع 100 مل من العازلة الملح العالية (50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT و 5٪ الجلسرين) لإزالة البروتينات ملزمة unspecifically. أزل البروتين ملزمة مع 5 مل من ارتفاع عازلة الملح التي تحتوي على 40 ملي الجلوتاثيون.
    4. Dialyze البروتين مزال في 2 L العازلة غسيل الكلى مع الجلسرين منخفضة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 100 ملي بوكل، 0.5 ملي DTT و 10٪ الجلسرين) لمدة 2 ساعة وبعد ذلك في 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 100 ملي بوكل، 0.5 ملي DTT و 70٪ الجلسرين لمدة 8 ساعة أو بين عشية وضحاها. تأكد من أن جميع المخازن المؤقتة تنقية هي في 4 درجات مئوية وتنفيذ أعمال تنقية البروتين في غرفة باردة لتجنب تمسخ البروتين.

3. الببتيد صفيف مثلأيشن

  1. قبل incubation من الببتيد صفائف
    1. أداء الببتيد مجموعة مثيلة إما في علبة من الحجم المناسب أو في كيس من البلاستيك لتجنب هدر انزيم وباهظة الثمن المسمى بالإشعاع AdoMet. قبل احتضان مجموعة غشاء الببتيد في كيس من البلاستيك مختوم يحتوي المخزن المؤقت مثيلة منها دون الانزيم والمسمى [الميثيل-3H] -AdoMet لمدة 10 دقيقة. حجم عازلة يعتمد على حجم المصفوفة، على سبيل المثال استخدام 8 مل من العازلة مثيلة لخصوصية كاملة الشخصي الببتيد مجموعة. تحسين كمية وتركيز AdoMet لكل الانزيم.
  2. مثيلة من الببتيد صفائف
    1. تجاهل المخزن المؤقت مرحلة ما قبل الحضانة واحتضان الغشاء في 8 مل من العازلة مثيلة تحتوي على PKMT منها والمسمى [الميثيل-3H] -AdoMet ل1 إلى 2 ساعة.
      ملاحظة: كمية الانزيم اللازمة لرد فعل مثيلة تعتمد على نشاط PKMT معين، يمكننا الشروع في تجارب الفحص لدينا عادة مع 50 نانومتر زعنفة انزيمتركيز آل.
  3. غسل الببتيد صفائف
    1. بعد ذلك تجاهل المخزن المؤقت مثيلة في حاوية النفايات المشعة وغسل صفائف الببتيد لمدة 5 مرات مع 20 مل من العازلة التي تحتوي على 100 ملي بيكربونات الأمونيوم و 1٪ SDS لمدة 5 دقائق لإزالة البروتين منضم. تجاهل المخزن المؤقت الغسيل في حاوية النفايات المشعة.
  4. الكشف عن الإشارة المشعة
    1. بعد يغسل احتضان الغشاء لمدة 5 دقائق في 10 مل من محلول تضخيم (NAMP100V).
    2. ثم، ونبذ الحل تضخيم في حاوية النفايات المشعة للمذيبات العضوية، وختم مجموعة الببتيد في كيس من البلاستيك ووضعها في كاسيت تصوير الإشعاع الذاتي.
    3. وضع الفيلم تصوير الإشعاع الذاتي على مجموعة الببتيد في غرفة مظلمة. إغلاق كاسيت بعناية وتعريضها في -80 ° C للمرة ضروريا. ثم، ووضع الفيلم على تحليل النتائج. القبض على زوجين صورة مرات مع expositio مختلفةن مرات لتجنب تشبع من ركائز الببتيد ميثليته بشدة.

4. معالجة وتحليل البيانات

  1. تحليل الكثافة من بقعة البئرية
    1. مسح الفيلم في الماسح الضوئي التقليدي وتحليل كثافة بقعة من قياس كثافة. القيام بذلك باستخدام يماغيج (والتي هي مجانية) أو برنامج تجاري.
      ملاحظة: نحن نستخدم برامج Phoretix لهذه المهمة.
  2. التطبيع والمتوسطات النتائج من الأغشية مختلفة
    1. إجراء تجارب مثيلة مجموعة الببتيد على الأقل في ثلاث نسخ. تطبيع شدة الممسوحة ضوئيا لكل تجربة من قبل الطرح الخلفية ووضع النشاط في ركيزة مرجعية كما 1.0. متوسط ​​البيانات للبقع الفردية والإبلاغ عنها القيم المتوسطة كما والانحرافات المعيارية.
  3. تحليل البيانات والعرض
    1. رسم البيانات في 2D باستخدام نظام الرمادي أو اللون للإشارة إلى النشاط النسبي. هل هذا وايعشر إكسل أو Sigmaplot كما هو موضح هنا. أيضا، وإعداد مخطط لتوزيع الانحرافات المعيارية من التجارب المتكررة لتحليل نوعية البيانات.
    2. لمقارنة وعرض دقة الاعتراف كل بقايا في الببتيد الركيزة كميا، وحساب التفضيل النسبي من PKMT لكل الأحماض الأمينية أنا في موقف x بواسطة عامل التمييز وD 16،17:
      D X، وأنا = <V ي ≠ ط> / V ط - 1
      حيث ت ط هو معدل مثيلة من البديل الببتيد تحمل الأحماض الأمينية أنا في موقف x و <V ي ≠ ط> هو متوسط ​​معدل مثيلة من كل الببتيدات 19 يحمل مختلفة ي الأحماض الأمينية ≠ ط في موقف العاشر (بما في ذلك البرية تسلسل نوع).
      ملاحظة: عامل التمييز التي يحددها هذا يعتمد على مستوى الخلفية. إذا تم قبول بقايا واحد فقط في موقف معين مع خلفية من 3٪، والتمييزيتم الحصول على عامل 32.3. لا توجد تفضيل في موقف يؤدي إلى عامل التمييز من 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت تستخدم صفائف الببتيد بنجاح لتوصيف كيميائيا خصوصية PKMTs، وتم تحديد عدة هيستون رواية وغير هيستون-ركائز من PKMT هذا النهج 5،16-19. تحديد الطيف الركيزة الصحيح لPKMT (أو أي انزيم) هو خطوة ضرورية نحو فهم آليتها الجزيئية والخلوية وظائف.

وكمثال على تطبيق الببتيد SPOT طريقة مجموعة مثيلة، نحن تصف نتائج تحليل خصوصية NSD1 PKMT 19. السابق لعملنا، وقد وصفت هذا الانزيم إلى عدة ركائز ميثيل بما في ذلك H3 هيستون في K36 وهيستون H4 في K20 ولكن أيضا NF-كيلوبايت النسخ الأسرة عامل P65 في K218 K221 والشكل. يظهر 4A مثال على رد فعل مثيلة من مجموعة الببتيد مع NSD1. لهذا التجارب، مجموعة الببتيد كبيرة على أساس H3 تم توليفها (31-49) تسلسل الذي يحتوي على كافة ممكنواحدة التعديلات الأحماض الأمينية من تسلسل الأصلي لاختبار أهمية كل الأحماض الأمينية لNSD1 التفاعل ومثيلة. في إجمالي 380 الببتيدات تم توليفها (20 الأحماض الأمينية الممكنة × 18 بقايا زائد واحد تسلسل H3 الأصلي في كل صف). يمثل المحور الأفقي تسلسل الببتيد وفي الاتجاه الرأسي يشار إلى الأحماض الأمينية التي يتم تبديل في الببتيد المقابل. على سبيل المثال، وبقعة في خط 17 العمود 4 يحتوي على ثريونين في المركز الثالث بدلا من الجلايسين التي موجود في تسلسل نوع البرية (الشكل 4A). في مثل هذه الطريقة، يتم إنشاء الطفرات نقطة لاختبار تفضيل NSD1 لكل الأحماض الأمينية الأصلي في كل موقف في الركيزة الببتيد. أظهر مثيلة مع NSD1 أنه يعمل بشكل خاص على H3K36 ولها أفضليات على جانبي يسين الهدف 34-38.

الشكل 4B يمثل توحيد ثلاثة الببتيد مجموعة مثيلةتجارب مع NSD1. تم الحصول على المعلومات الكمية من صفائف الببتيد الفردية وكانت النتائج تطبيع وبلغ متوسط ​​كما هو موضح أعلاه. الانحرافات المعيارية المعدلات الفردية تبين أن البيانات هي استنساخه للغاية. عموما حوالي 85٪ من الببتيدات وتظهر الانحرافات المعيارية أصغر من 20٪ وأكثر من 97٪ من ركائز الببتيد تظاهر الانحرافات المعيارية أصغر من 30٪ (الشكل 4C). وبالإضافة إلى ذلك، كما نقوم بحساب عامل التمييز لتحديد بالضبط مساهمة كل الأحماض الأمينية في المواقف التي تم اختبارها. كما هو موضح أنه يوفر وصفا كميا لالببتيد تلا وتفضيل من الأحماض الأمينية في موقف معين (الشكل 5A). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن NSD1 يفضل بقايا العطرية في موقف -2 (النظر K36 كما موقف 0) (F> Y> G)؛ بقايا مسعور في -1 (I> L> V)؛ بقايا الأساسية في +1 (R> QKNM)، حيث أنه لا يمكن أن يتسامح مع بقايا مسعور أو العطرية. وHYDبقايا rophobic في +2 (V> IA> P). في مواقع أخرى (مثل -3، +3، أو +6)، NSD1 يفضل بعض الأحماض الأمينية، ولكن لم يتم اكتشاف أي قراءات محددة بقايا قوية.

وبناء على هذا الملف، ركائز الببتيد جديدة محتملة يمكن العثور بواسطة البحث في قواعد البيانات مثل استخدام Scansite 20 (الشكل 5B). تم إعداد هذه الببتيدات على مجموعة SPOT بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية وحضنت مع NSD1 والمسمى بالإشعاع AdoMet لتحديد فرعية منها التي يتم ميثليته على مستوى الببتيد (الشكل 5C). على النحو التالي يو بي إس، صفائف الببتيد يمكن إعداد والتي تشمل المتغيرات الببتيد، والتي يتم استبدال يسين الهدف عن طريق ألانين، للتأكد من أن مثيلة يحدث في موقع المتوقعة. ثم، والبروتينات المستهدفة أو نطاقات فرعية منها التي تحتوي على يسين الهدف يمكن أن تنتج recombinantly واختبار الحامض أيضا في مستوى البروتين. وأخيرا، اعتمادا على النتائج، ومتابعة التجارب يمكنني nvestigate إذا حدث مثيلة أيضا في الخلايا والتي البيولوجية دور لديه.

الشكل (1)
الشكل 1: مخطط التوليف الببتيد بواسطة طريقة SPOT على غشاء السليلوز الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مثال على مجموعة الببتيد ملطخة برموفينول الأزرق لتأكيد تركيب الببتيدات الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
الشكل (3): مخطط التجربة الببتيد مجموعة مثيلة. تم ميثليته صفائف الببتيد من قبل الحضانة مع PKMT وصفت [ميثيل 3 H] -AdoMet في العازلة المناسبة. بعد ذلك تم الكشف عن النشاط الإشعاعي نقلها إلى كل بقعة من تصوير الإشعاع الذاتي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مثال النتائج التي تم الحصول عليها مع NSD1 PKMT A) مثال على مجموعة الببتيد الركيزة خصوصية لNSD1 باستخدام H3 (31-49) تسلسل كقالب. يمثل المحور الأفقي تسلسل H3 ويمثل المحور الرأسي الأحماض الأمينية التي يتم تحور الصف المقابل. يحتوي الصف الأول الببتيدات معتسلسل الأصلي. ب) تجميع النتائج من 3 تجارب مجموعة الببتيد مثيلة مستقلة مع NSD1، وبلغ متوسط ​​البيانات النتائج من جميع التجارب الثلاث بعد التطبيع. C) توزيع الأخطاء المعيارية لمتوسط ​​البيانات مثيلة يظهر في لوحة B. مستنسخة من Kudithipudi وآخرون آل (2014) مع بعض التعديلات 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: اكتشاف ركائز PKMT رواية A) عوامل التمييز من NSD1 للاعتراف بقايا الأحماض الأمينية في مواقع قريبة من ليسين الهدف (K36 في التجربة أظهرت هنا). تشير البيانات إلى أن NSD1 يفضل بقايا العطرية في -2 ص osition (النظر K36 كما موقف 0). يتم التعرف على بقايا مسعور في -1 و+2 المواقف، وإن كان ذلك مع وجود اختلافات مميزة في التفاصيل. في موقع +1 ويفضل بقايا الأساسية والأميدات. في مواقع أخرى تم الكشف عن بعض الأفضليات ضعيفة، ولكن لا قراءات محددة بقايا قوية. B) لقطة لبحث سبيل المثال في Scansite، باستخدام ملف التعريف المحدد لخصوصية NSD1. C) الببتيد SPOT مجموعة تحتوي على عدة الرواية توقع NSD1 ركائز جنبا إلى جنب مع الموجب (H3K36 ) والضوابط السلبية (H3K36A). تم ميثليته بشدة بعض الأهداف رواية مبنية (بعضها المشروح)، وفي حالات أخرى لا يمكن التحقق من التنبؤات. لوحة A و C ويرد من Kudithipudi وآخرون (2014) مع بعض التعديلات 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جي = "0" هوامش الخلية = "0">
قاعدة 1 M Oxyma البحتة في NMP -> 2،13 ز Oxyma البحتة في 15 مل NMP
المنشط 2.4 مل N، -Diisopropylcarbodiimide N 'في 15 مل NMP
متوجا خليط 20٪ أنهيدريد الخليك في DMF -> 6 مل أنهيدريد الخليك في 30 مل DMF
Fmoc Deprotection 20٪ تأكسد في DMF -> 200 مل في 1،000 مل DMF
Sidechain Deprotection 900 ميكرولتر Triisopropylsilane + 600 ميكرولتر DDH 2 O في 30 مل TFA
تلطيخ 0.02٪ برموفينول الأزرق في DMF

الجدول 1: الخلائط الكيميائية وتكوينها المستخدمة في البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التوليف SPOT كما هو موضح هنا هو وسيلة قوية لرسم خريطة مواقع التفاعل البروتين البروتين والتحقيق في التعرف على الركيزة من الببتيد تعديل الانزيمات. ومع ذلك، SPOT التوليف لا يزال لديه بعض العيوب، لأنه على الرغم يتم الإبلاغ عن الببتيدات توليفها من خلال طريقة SPOT أن يكون أكثر من 90٪ نقاء 21 هذا من الصعب تأكيد في كل حالة. ولذلك، النتائج يجب أن تكون مستنسخة عن طريق وسائل أخرى على سبيل المثال باستخدام المجالات البروتين أو مع الببتيدات تنقية تصنيعه بالطرق العادية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العيب الرئيسي الآخر من صفائف SPOT هو أن معظم الوقت الذي لا يمكن إعادة استخدامها لتنفيذ عدة فحوصات مع مجموعة واحدة.

لزيادة كفاءة التوليف مع الأحماض الأمينية من الاستقرار منخفضة، مثل أرجينين المحمية، من المهم لجعلها طازجة لكل 5 دورات. في التفاعلات الأنزيمية أو بروتين ملزمة دراسات كثيرا ما لوحظ أن المحيط الخارجي للبقعة الببتيد ديه موإعادة كثافة إشارة من المركز ("حلقة تأثير بقعة"). يمكن أن يكون هذا التأثير يرجع ذلك إلى كثافة عالية من الببتيدات في الجزء الأوسط من البقعة وبعد ذلك يمكن أن تحل عن طريق تقليص النطاقات توليف الببتيد 22. لمزيد من مشكلة إطلاق النار من الببتيد التوليف كتيب الجهاز وينبغي استشارة خدمة الشركة. إن لم يكن لوحظ مثيلة، والببتيدات مراقبة إيجابية (أي الببتيدات المعروف أن ميثليته بواسطة انزيم قيد التحقيق) وينبغي أن يضاف إلى الغشاء.

بديل لصفائف SPOT، وارتفاع كثافة الببتيد صفائف الدقيقة 23 متوفرة، لكنها أكثر تكلفة وتتطلب معدات خاصة للاستخدام. وعلاوة على ذلك كمية من الببتيد في بقعة أصغر، الأمر الذي يتطلب إجراءات قراءات أكثر حساسية. صفائف البروتين وتتوفر أيضا لدراسة هذه الوظائف 24،25، لكنها أكثر صعوبة لإعداد لأن كل فرد البروتين يحتاج إلى أن يعبر عنه وتنقيته وطي البروتين على مجموعة يحتاج إلى الحفاظ عليها. ميزة إضافية من صفائف الببتيد هي إمكانية إدخال التعديلات متعدية ما بعد خلال التوليف وسهولة اختبار طفرية من أدوار فردية بقايا الأحماض الأمينية.

وهو نقطة الانطلاق الأساسية لهذا البروتوكول، أن يكون الببتيد واحد على الأقل تم تحديدها، والذي ميثليته بواسطة انزيم قيد التحقيق. شروط مثيلة ومخازن يجب أن يكون الأمثل، فضلا عن تركيز ناقلة الميثيل. دورات الوقت المثالي للمثيلة يجب أن تكون مصممة على تجنب مثيلة كاملة من أفضل الركيزة، والتي سوف تسبب فقدان النطاق الديناميكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Gradient Grade HPLC Honeywell 10299901 Flammable
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis Biosolve 4193302 Flammable, Toxic
Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis Roth A122.1 Flammable, Toxic, corrosive
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) Novabiochem 8510860100
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC Fluka 38370 Flammable, Toxic, corrosive
Acetic anhydride Roth CP28.1 Flammable, Toxic, corrosive
Triisopropylsilane 99% Aldrich 233781 Flammable, Toxic
Dichlormethane ≥99.9% Roth P089.1 Carcinogenic
N-Methyl-2-Pyrrolidone Roth 4306.2 Toxic
Derivatized cellulose Membrane Intavis AG Köln 32.1
Trifluoroacetic acid Roth P088.2 Toxic, corrosive
Bromphenolblue AppliChem A3640.0010
Ammonium Hydrogen Carbonate Roth T871.2 Toxic
Sodium Dodecyl Sulfate Pellets Roth CN30.3 Toxic, Flammable
MultiPep Synthesizer Intavis AG Köln n.a.
HyperfilmTM high performance film GE Healthcare 28906837
Phoretix software TotalLab n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
  2. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  3. Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
  4. Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
  5. Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
  6. Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
  7. Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
  8. Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
  9. Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
  10. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
  11. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
  12. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
  13. Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
  14. Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
  15. Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
  16. Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
  17. Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
  18. Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
  19. Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
  20. Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
  21. Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
  22. Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
  23. Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
  24. Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
  25. Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 93، صفائف الببتيد، الببتيد التوليف الصلبة مرحلة، والتوليف SPOT، ميثيل البروتين ليسين، تحليل الشخصية الركيزة خصوصية، ليسين مثيلة
تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kudithipudi, S., Kusevic, D.,… More

Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays. J. Vis. Exp. (93), e52203, doi:10.3791/52203 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter