Abstract
Lysin methylering er en ny post-translation modificering, og det er blevet identificeret på adskillige histon og ikke-histon-proteiner, hvor det spiller afgørende roller i celleudvikling og mange sygdomme. Ca. blev identificeret 5.000 lysin methylering sites på forskellige proteiner, som fremgår af få snesevis af protein lysin methyltransferaser. Dette antyder, at hver PKMT methylerer multiple proteiner imidlertid indtil nu kun én eller to substrater er blevet identificeret for flere af disse enzymer. For at nærme sig dette problem, har vi indført peptid-array baseret substratspecificitet analyser af PKMTs. Peptid arrays er effektive værktøjer til at karakterisere specificiteten af PKMTs fordi methylering af flere substrater med forskellige sekvenser kan testes på en array. Vi syntetiserede peptid arrays på cellulosemembran ved hjælp af en Intavis SPOT synthesizer og analyseret specificitet forskellige PKMTs. Baseret på resultaterne, flere af disse enzymer, roman substrates kunne identificeres. For eksempel, for NSD1 ved anvendelse af peptid-arrays, viste vi, at det methylerer K44 af H4 i stedet for den rapporterede H4K20 og desuden H1.5K168 er meget foretrukket substrat over tidligere kendte H3K36. Derfor peptid arrays er stærke værktøjer til biokemisk kendetegner PKMTs.
Introduction
I de sidste to årtier, flere rapporter vist betydningen af post-translationelle modifikationer (PTM) i cellulær udvikling og flere sygdomme som kræft, men for nylig protein lysin methylering er opstået som en anden vigtig PTM. Mens oprindeligt histon-lysin methylering viste sig at være en væsentlig kromatin mærke, senere arbejde viste også lysin methylering af flere ikke-histon proteiner 1-4. Den sekventielle overførsel af methylgrupper fra S-adenosyl-L-methionin til ε-aminogruppen i lysinrester katalyseres af en familie af enzymer kaldet Protein Lysin methyltransferaser (PKMTs), som indeholder mere end 60 proteiner i det humane genom. PKMTs blev oprindeligt opdaget som histon modificerende enzymer, der methylere specifik lysinrest men senere rapporter vist, at de også kunne methylere ikke-histon proteiner 5. Indtil nu blev identificeret ca. 5.000 lysin methylering sites på forskellige proteiner 6
Peptid arrays er udbredte værktøjer til biokemisk analyse af antistoffer, peptid-modificerende enzymer og kortlægning af protein-protein-interaktion sites (antistof-antigen, en receptor-ligand) 7-9. Adskillige hundreder af peptider er nødvendige for SUCh applikationer. Forskellige metoder er til rådighed til peptidsyntese, blandt dem peptidsyntese på harpiks er meget almindeligt anvendt, men den har begrænsninger i gennemløb og det er relativt dyrt. Disse problemer blev løst med indførelsen af SPOT syntese metoden af Frank og kolleger 10. SPOT syntesemetode tillader syntese af flere hundrede peptider parallelt og i gennemsnit er billig i forhold til resin-syntese. Peptiderne syntetiseret på cellulose membran kan anvendes enten direkte til forskellige anvendelser eller peptider kan spaltes fra membranen og anvendes som frie peptider i opløsning assays eller til at forberede peptid microarrays 10-13.
SPOT syntese er en variant af fastfasepeptidsyntese, som bruger en cellulosemembran som en fast støtte og anvender standard Fmoc-kemi 10-13. Derfor er syntesen af peptidkæder begynder ved den C-terminale ende og fortsætter i retning afden N-terminale ende i modsætning til den biologiske syntese i ribosomer. Cellulosemembraner funktionaliseres til fastgørelse af den første aktiverede aminosyrer (Fig. 1). SPOT Metoden er baseret på den sekventielle levering af aktiverede aminosyrer i en dråbe opløsningsmiddel definerede pletter på membranen under anvendelse af et automatiseret pipetteringssystem. Den lille dråbe af væske dispenseres på den porøse membran, hvor den danner en cirkulær våd plet, som senere fungerer som en åben reaktor til de kemiske reaktioner i peptidsyntese. Pletstørrelsen bestemmes af det dispenserede volumen og den absorberende kapacitet af membranen er multipla af sådanne pletter arrangeret som arrays. Omfanget af syntese korrelerer med punktstørrelse og lasteevne membranen. Afstanden mellem pletter og tætheden af arrays styres ved at variere pletstørrelser. Cellulosemembran har flere fordele som fast fase i peptidsyntese, det er billigt, tolerant for chemicals der anvendes i peptidsyntese, stabile i vandige opløsninger og let at håndtere. Desuden sin hydrofile natur gør det egnet til en række biologiske assaysystemer. SPOT syntese kan udføres manuelt eller automatiseret (for 1000'erne af peptider), afhængigt af det nødvendige antal af peptider. En fuldautomatisk SPOT synthesizer fra Intavis (Köln, Tyskland) anvendes til vores applikationer. Den tillader syntese af peptider i forskellige mængder og med forskellig længde. Lineære peptider regelmæssigt syntetiseret med 15 til 20 aminosyre længde, foruden peptider op til 42 aminosyrer kan også fremstilles ved trinvis syntese 14,15. Men forøgelse af antallet af aminosyrer fører til reduktion i de samlede koblingsudbytter, hvilket påvirker kvaliteten af peptiderne. På grund af den lille mængde af peptider pr stedet, produkterne er ofte vanskeligt at oprense og kvaliteten af individuelle peptider ikke let kan vurderes. Derfor opnåede resultater fra SPOT PeptIDE arrays skal bekræftes enten peptider syntetiseret ved standardmetoder i større målestok, som kan oprenses og analyseres i henhold til standarderne i peptidsyntese eller ved at syntetisere proteiner indeholdende de ønskede peptidsekvenser. Alligevel fandt vi SPOT syntese at være meget pålidelig og resultater generelt at de kan gentages. SPOT syntese er ikke begrænset til proteinogene aminosyrer, flere kommercielt tilgængelige modificerede aminosyrer kan også anvendes til syntese, giver peptider ændres før og efter den endelige spaltning af sidekædebeskyttelse gruppe og desuden også tillader inkorporering af phosphorylerede, methylerede eller acetylerede aminosyrer 11.
Immobiliserede peptidbiblioteker syntetiseret ved SPOT metode kan anvendes direkte til mange biologiske og biokemiske assays. Vi anvendte peptid arrays omfatter 300-400 peptider for at undersøge substrat specificitet PKMTs. For enzymatisk modifikation, peptid-arrays inkuberet med de respektive PKMT og mærket [methyl-3H] -AdoMet i en passende buffer. Methylering af det respektive substrat analyseres ved at følge den enzymatiske overførsel af radioaktivt mærkede methylgrupper fra AdoMet til peptidsubstratet via autoradiografi (Fig. 3). Ved denne procedure peptidet arrays tillader undersøgelse af methylering af forskellige peptidsubstrater samtidig. En vigtig fordel ved denne fremgangsmåde er, at alle peptiderne er methyleret i konkurrence, således at i den lineære fase af methylering kinetik relative methylering af hvert peptid er proportional med den katalytiske hastighedskonstant divideret med dissociationskonstanten (kcat / K D) af enzymet til det respektive peptidsubstrat. Derfor er mængden af radioaktivitet inkorporeret i hver plet direkte korreleret med den enzymatiske aktivitet mod det særlige peptid. Brug afresultater af et peptid-array methylering eksperiment, kan specificitet profil PKMT defineres og baseres på denne roman substrater kan forjættede. Peptid arrays tillade hurtig og omkostningseffektiv validering af methylering af hidtil ukendte substrater på peptidet niveau. Til dette, er arrays forberedt som indeholder de forudsagte nye substrater sammen med modificerede peptider indeholdende en Ala i stedet for Lys på mål-sites samt positive og negative kontroller peptider. Endelig kan de hidtil ukendte substrater fremstilles som proteiner sammen med mutanter, i hvilken målet Lys ændres til Ala og methylering kan blive bekræftet på proteinniveau. Afhængigt af resultaterne er denne efterfølges af biologiske undersøgelser vedrørende mulige roller methylering af de nyligt beskrevne proteinsubstrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af peptid Arrays
- Programmeringen af peptidsekvenser
- Design peptidsekvenser til syntese ved hjælp af MultiPep spotter software. Indtast peptidsekvenserne i enkelte bogstavkoder.
Peptid 1: TARKSTGGKA - Generer alanin eller arginin gåtur biblioteker med en bestemt kommando (.Sæt, A) til at screene de vigtige aminosyrer, der er nødvendige for anerkendelse af en defineret substrat. For eksempel i følgende eksempel den første linie er vildtypesekvensen og fra den anden linje hver aminosyre i et peptid ændres til alanin sekventielt.
erstatte, A
TARKSTG
En -ARKSTG
T- A -RKSTG
TA A -KSTG
TARGET A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Brug lignende kommandoer (.Sæt R,.erstatte N etc.) som beskrevet i 1.1.2 med alle de naturligt tilgængelige aminosyrerester (vinder udeladelse cystein, methionin og tryptophan, fordi disse rester er tilbøjelige til oxidation og undertiden lavere syntese udbytte) at syntetisere et peptid array til bestemmelse af konsensus substrat sekvensmotiv for et enzym.
BEMÆRK: Som vist i figur 4A, den vandrette akse repræsenterer givet peptid sekvensen og den lodrette akse repræsenterer de aminosyrer, der er valgt for kommandoen. Svarende til sekvensen vist i 1.1.2, A på den lodrette akse betyder, at en Ala sekventielt erstatter hver position af den givne sekvens i den første række i fig. 4A. Tilsvarende arginin sekventielt erstatter hver aminosyre i den anden række og så videre med de andre aminosyrer. Komplet peptid array-biblioteker syntetiseres ved systematisk at erstatte hver rest i den medfølgende peptidsubstrat sekvens med hver af the andre naturligt tilgængelige aminosyrerester dette hjælper til at forstå den indflydelse hver rest ved hver position af den givne sekvens. - Alternativt kan methylering af kendt eller forventet peptidsubstrater let verificeres syntese peptidbiblioteker med target peptiderne PKMT sammen med positive og negative methylering kontroller (dvs. peptider, der vides at methyleret eller vides ikke at være methyleret). Syntetisere peptider ved at udveksle den formodede mål lysin til alanin for at bekræfte methylering af målet lysin som vist nedenfor ved manuel programmering.
Vildtypepeptidet: STGG K PRQFL
Mutant peptid: STGG A PRQFL
BEMÆRK: Softwaren har også iboende scripts til at tage forskellige biblioteker, ligesom epitopkortlægning med en ønsket ramme skift af sekvensen til at kortlægge vigtige aminosyrer, der er nødvendige for en interaktion.
- Design peptidsekvenser til syntese ved hjælp af MultiPep spotter software. Indtast peptidsekvenserne i enkelte bogstavkoder.
- Fremstilling af membran Amino Acids enD reagenser
- Pre-svulme SPOT membran i DMF (N, N-dimethylformamid) i 10 minutter, og derefter placere den våde membran på SPOT synthesizer frame uden luftbobler eller rynker.
- Vask membranen tre gange med 100% ethanol. Tør membranerne helt i mindst 10 minutter, før du starter syntese programmet.
- Sideløbende frisk forberede 0,5 M arbejdsdage koncentrationer af kommercielt tilgængelige Fmoc-beskyttede aminosyrer ved at opløse dem i NMP og også forberede aktivator og base som beskrevet i tabel 1.
- Sørg for, at alt det affald opløsningsbeholdere af SPOT synthesizer blev tømt og refill opløsningsmidlet reservoirer med DMF, ethanol og piperidin.
BEMÆRK: Nu er maskinen klar til syntese.
- Spotting af første aminosyre
- For at generere amidbinding med den frie aminogruppe på membranen, aktivere carboxygruppen af den indkommende aminosyre ved adding aktivatoren (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) og baseopløsning (ethylhydroxyimino cyanoacetat) til aminosyrederivat.
- Spot de ønskede mængder af aktiverede aminosyrer på Amino-PEG funktionaliseret membran under anvendelse af den programmerbare robot.
BEMÆRK: Derved C-terminalen af aminosyren er koblet til aminogruppen af membranen. - Gentag dette trin tre gange for at sikre en bedre kobling af den første aktiverede aminosyre. Inkuber membranen i 20 minutter og derefter vaske med DMF for at fjerne afkoblede aminosyrer.
- Blokering af frie rum på ikke-spot områder
BEMÆRK: Efter koblingen af den første C-terminale aminosyre i alle peptiderne til aminogruppen af membranen behøver aminogrupperne mellem pletterne og også nogle af aminogrupperne i stedet områder, der ikke danner bindinger med aminosyrerne.- Blokere disse frie aminogrupper ved inkubering med udjævningen opløsning (20% eddikesyreanhydrid i DMF)for 5 min.
BEMÆRK: Denne undgår kobling af aminosyrer i de yderligere cykler med membranen i stedet for den voksende peptidkæde.
- Blokere disse frie aminogrupper ved inkubering med udjævningen opløsning (20% eddikesyreanhydrid i DMF)for 5 min.
- Fjernelse af Fmoc-gruppe
- Efter blokering vaskes membranen med DMF 4 gange og derefter inkuberes med 20% piperidin i DMF i 20 min for at fjerne Fmoc beskyttelsesgruppe.
BEMÆRK: Dette trin fører til fjernelse af amino-beskyttende Fmoc-grupper, og det kaldes afbeskyttelse. - Bagefter vaskes membranen to gange med DMF og to gange med ethanol og lad den tørre.
BEMÆRK: Nu membranen er klar til kobling af de næste aminosyrer.
- Efter blokering vaskes membranen med DMF 4 gange og derefter inkuberes med 20% piperidin i DMF i 20 min for at fjerne Fmoc beskyttelsesgruppe.
- Kædeforlængelse
BEMÆRK: Tilsætning af hver aminosyre kaldes en cyklus. Bortset fra koblingen af første aminosyre, cyklus begynder med afbeskyttelse af Fmoc-gruppen af den koblede aminosyre og det efterfølges af kobling af den aktiverede carboxylgruppe i en indgående aminosyre til aminogruppen på den voksende peptidevandet kæde.- Gentag trin 1.3 og 1.5 indtil det ønskede peptid længde er opnået.
- Farvning
BEMÆRK: Efter den sidste cyklus, peptid arrays farvet med bromphenolblåt at bekræfte den vellykkede syntese af peptider. Bromphenolblåt bindes med de frie aminogrupper af peptiderne. Peptid pletter viser lyseblå farve efter farvning men intensiteten af pletterne varierer afhængigt peptidsekvensen. Denne farvning tillader bekræftelse af fuldstændig fjernelse af piperidin, fordi i nærværelse af piperidin bromphenolblåt ikke pletter peptiderne. Derudover, hvilket også bidrager til at markere peptid arrays til yderligere brug.- Efter Fmoc-gruppen afbeskyttelse i den sidste syntesecyklus vaskes membranen med DMF og 100% ethanol. Derefter behandler membranen med bromphenolblåt (0,02% bromphenolblåt i DMF) i mindst 5 min, indtil den er helt blåt.
- Bagefter vaskes membranen med DMF og ethanol efterfulgt af tørring i 10 minutter. Nu tager ud membranen fra synthesizeren og udfør sidekædeafbeskyttelse (afsnit 1.8) manuelt. Hvis det er nødvendigt, fotografi membranen at dokumentere resultaterne af peptidsyntese (fig. 2).
- Sidekædeafbeskyttelse
- Behandl membranerne med 20 til 25 ml sidekædeafbeskyttelse blanding bestående af 95% trifluoreddikesyre (TFA) for at spalte grupper sidekædebeskyttelse og scavenger reagenser (2,5% vand og 2,5% triisopropylsilan) for at beskytte sidekæderne af aminosyrer fra modifikation under dette trin. Tag et tilstrækkeligt afbeskyttelse blanding for at sikre, at den dækker membranen helt i en tæt lukket kemikaliebestandig kasse og inkuberes det i 1 til 2 timer under omrystning forsigtigt.
- Vask membranen seks gange med 20-25 ml DCM (dichlormethan) i 2 minutter hver og endelig to gange med 100% ethanol og tørres i en ekssikkator natten over.
BEMÆRK: Numembranen kan anvendes til eksperimenter. En ordning af peptidet matrix syntese er tilvejebragt i figur 1.
2. Protein Expression and Purification
- Protein Expression af PKMTs GST Fusions
- Anvendelse af standardteknikker, klone genet, der koder fuld længde PKMT eller dens katalytiske domæne i en bakteriel ekspressionsvektor (som pGEX-6p2) at udtrykke det som GST-fusionsprotein.
- Overfør vektoren med den ønskede PKMT indsætte i BL21 eller BL21 codon plus E. coli-celler ved varmechok metode eller enhver anden metode.
- Forbered en pre-kultur med 30 ml Luria-Bertani (LB) medier på dagen for udtryk, og der inkuberes ved 37 ° C i 7 til 8 timer med kontinuerlig omrystning.
- Dernæst overføres 10 ml af præ-kultur i en 2 liters store ledeplader kolber indeholdende 1 liter LB-medier og inkuberes ved 37 ° C i inkubatoren med kontinuerlig rystning, indtil kulturen rækkeviddees en defineret optisk densitet ved 600 nm.
BEMÆRK: Mens dette kan optimeres for hvert protein, vi rutinemæssigt inducere en OD 600 nm på ca. 0,8. Induktionen temperatur skal optimeres for hvert protein individuelt nogle proteiner udviser god ekspression ved 22 ° C og nogle ved højere temperaturer. - Skift af cellerne til induktion temperatur i 15 min, derefter inducere med 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid og tillade kulturen at vokse i 10-12 timer ved induktion temperatur.
- Bagefter høste cellerne ved centrifugering ved 5000 xg i 15 minutter og til slut vaskes pelleten med 30 ml STE-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl og 0,1 mM EDTA) og opbevares ved -20 ° C til yderligere anvendelse.
- Protein Purification
- Optø cellepelleten og genopslæmmes i 30 ml sonikeringsbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT og 5% glycerol) og forstyrre ved sonikering.
BEMÆRK: Denne buffer needs skal optimeres for hvert protein sidst. - Centrifugeres cellelysatet ved 22.000 xg i 1 time og senere indsamle supernatanten og passere gennem en kolonne indeholdende 600 pi glutathion Sepharose 4B harpiks.
- Vask kolonnen med 50 ml sonikeringsbuffer og næste med 100 ml puffer med højt saltindhold (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT og 5% glycerol) for at fjerne uspecifikt bundne proteiner. Elueres det bundne protein med 5 ml buffer med højt saltindhold indeholdende 40 mM glutathion.
- Dialysere det eluerede protein i 2 L af dialyse buffer med lav glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT og 10% glycerol) i 2 timer og senere i 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT og 70% glycerol i 8 timer eller natten over. Sørg for at alle rensning buffere er ved 4 ° C og udføre proteinrensningskonstruktionen i kølerummet for at undgå proteindenaturering.
- Optø cellepelleten og genopslæmmes i 30 ml sonikeringsbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT og 5% glycerol) og forstyrre ved sonikering.
3. Peptid Array Methylering
- Pre-INCUbation af peptid Arrays
- Udfør peptid matrix methylering enten i en kasse med passende størrelse eller i en plastpose for at undgå spild af enzym og dyre radioaktivt mærkede AdoMet. Præinkuberes peptidet matrix membran forseglet plastpose indeholdende respektive methylering buffer uden enzym og mærket [methyl-3H] -AdoMet i 10 min. Mængden af puffer afhænger af størrelsen af array, for eksempel bruger 8 ml methylering buffer for en fuld specificitet profil peptid array. Optimer mængde og koncentration af AdoMet for hvert enzym.
- Methylering af peptid Arrays
- Kassér præinkubation buffer og inkuberes membranen i 8 ml methylering buffer indeholdende de respektive PKMT og mærket [methyl-3H] -AdoMet for 1 til 2 timer.
BEMÆRK: Mængden af enzym, der kræves for en methylering reaktion afhænger af aktiviteten af specifikke PKMT, vi indleder vores screening eksperimenter typisk med 50 nm enzym final koncentration.
- Kassér præinkubation buffer og inkuberes membranen i 8 ml methylering buffer indeholdende de respektive PKMT og mærket [methyl-3H] -AdoMet for 1 til 2 timer.
- Vask af Peptid Arrays
- Bagefter kassere methylering buffer i et radioaktivt affald beholder og vaske peptid arrays 5 gange med 20 ml buffer indeholdende 100 mM ammoniumbicarbonat og 1% SDS i 5 minutter for at fjerne det bundne protein. Kassér vaskebuffer i et radioaktivt affaldsbeholder.
- Påvisning af radioaktive signal
- Efter vask inkuberes membranen i 5 minutter i 10 ml Amplify opløsning (NAMP100V).
- Derefter kasseres Forstærk løsning i det radioaktive affald beholder til organiske opløsningsmidler, forsegle peptidet array i en plastikpose og læg dem i et autoradiografi kassette.
- Placer autoradiografi film på peptidet array i det mørke rum. Luk kassetten omhyggeligt og udsætte det ved -80 ° C for den nødvendige tid. Derefter udvikle filmen at analysere resultaterne. Tage billedet par gange med forskellige exposition gange for at undgå mætning af stærkt methylerede peptidsubstrater.
4. Databehandling og analyse
- Densitometrisk Analyse af Spot Intensiteter
- Scan filmen i en konventionel scanner og analysere stedet intensiteter ved densitometri. Gøre dette ved hjælp ImageJ (som er freeware) eller et kommercielt program.
BEMÆRK: Vi anvender Phoretix software til denne opgave.
- Scan filmen i en konventionel scanner og analysere stedet intensiteter ved densitometri. Gøre dette ved hjælp ImageJ (som er freeware) eller et kommercielt program.
- Normalisering og Midling af resultater fra forskellige membraner
- Gennemføre peptid array-methylering eksperimenter mindst tre gange. Normalisere scannede intensiteter for hvert forsøg med baggrund subtraktion og indstilling af aktivitet ved en henvisning substrat som 1.0. Beregn gennemsnittet af de data for de enkelte pletter og rapportere dem som middelværdier og standardafvigelser.
- Dataanalyse og Display
- Plot dataene i 2D ved hjælp af en gråtoner eller farveskema for at angive den relative aktivitet. Gør dette with Excel eller Sigmaplot som vist her. Også forberede en afbildning af fordelingen af standardafvigelser af de gentagne forsøg til at analysere kvaliteten af dataene.
- At sammenligne og vise nøjagtigheden af anerkendelsen af hver rest i substratpeptid kvantitativt, beregne den relative præference for PKMT for hver aminosyre i ved position X ved en forskelsbehandling faktor D 16,17:
D X i = <V j ≠ i> / V i - 1
Hvor v i er hastigheden af methylering af peptidet variant transporterer aminosyre i ved position X og <v j ≠ i> er den gennemsnitlige methylering af alle 19 peptider, der bærer en anden aminosyre j ≠ i ved position x (herunder vildtypesekvens).
BEMÆRK: forskelsbehandlingsfaktor defineret af dette afhænger af baggrundsniveauet. Hvis kun en rest accepteres i en bestemt position med en baggrund af 3%, en forskelsbehandlingfaktor på 32,3 opnås. Ingen præference ved en position resulterer i en diskrimination på 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptid arrays blev med succes anvendt til biokemisk karakterisering specificitet PKMTs, og blev identificeret flere roman histon og ikke-histon substrater af PKMT af denne tilgang 5,16-19. Definition korrekt substrat spektrum af en PKMT (eller ethvert enzym) er et væsentligt skridt i retning af forståelse af dens molekylære mekanisme og cellulære funktioner.
Som et eksempel på anvendelsen af peptidet SPOT-array methylering metode beskriver vi resultaterne af de særlige analyse af NSD1 PKMT 19. Forud for vores arbejde, blev dette enzym beskrevet til methylerer flere substrater, herunder histon H3 på K36 og histon H4 på K20, men også NF-kB familie transkriptionsfaktor p65 på K218 og K221. Fig. 4A viser et eksempel på en methyleringsreaktion af et peptid array med NSD1. Til dette forsøg, en stor peptid matrix baseret på H3 (31-49) sekvens blev syntetiseret, som indeholder alle muligeenkelt aminosyre ændringer af den oprindelige sekvens for at teste betydningen af hver aminosyre til NSD1 interaktion og methylering. I alt 380 peptider blev syntetiseret (20 mulige aminosyrer x 18 rester plus en original H3-sekvens i hver række). Den vandrette akse repræsenterer sekvensen af peptidet og i lodret retning den aminosyre, som er ændret i det tilsvarende peptid er angivet. For eksempel stedet ved linie 17 kolonne 4 indeholder en threonin ved den tredje position i stedet for glycin, der er til stede i vildtype-sekvensen (fig. 4A). På en sådan måde er punktmutationer frembragt at teste præference NSD1 for hver native aminosyre ved hver position i peptidsubstratet. Methylering med NSD1 viste, at den specifikt virker på H3K36 og det har præferencer på hver side af målet lysin 34-38.
4B repræsenterer konsolidering af tre peptid-array methyleringforsøg med NSD1. De kvantitative oplysninger blev erhvervet fra de enkelte peptid arrays og resultaterne var normaliseret og gennemsnit, som beskrevet ovenfor. Standardafvigelser ved de enkelte gennemsnit viser, at dataene er meget reproducerbar. Samlet omkring 85% af peptiderne viser SDS mindre end 20% og mere end 97% af peptidsubstrater demonstreret SD er mindre end 30% (fig. 4C). Derudover har vi også beregnet diskrimination faktor præcist at afgøre bidrag af hver aminosyre ved de testede positioner. Som beskrevet det giver den kvantitative beskrivelse af peptidet udlæsning og præference for aminosyrer ved specifikke position (Fig. 5A). Vores data viser, at NSD1 foretrækker aromatiske rester ved -2 position (overvejer K36 som position 0) (F> Y> G); hydrofobe rester ved -1 (I> L> V); basiske rester på +1 (R> QKNM), hvor det ikke kan tåle hydrofobe eller aromatiske rester; og hydrophobic rester på +2 (V> IA> P). På andre sites (ligesom -3, +3, eller +6), NSD1 foretrækker nogle aminosyrer, men ingen stærk rest specifik udlæsning blev opdaget.
Baseret på denne profil kan potentielle hidtil ukendte peptidsubstrater findes ved databasesøgninger gerne bruge Scansite 20 (fig. 5B). Disse peptider blev fremstillet på en SPOT matrix herunder positive og negative kontroller og inkuberet med NSD1 og radioaktivt mærket AdoMet at identificere den delmængde af dem, der er methyleret på peptid-niveau (fig. 5C). Som følge ups, kan peptid arrays fremstilles som omfatter peptidvarianter, i hvilken målet lysin er erstattet med alanin, at bekræfte, at methylering finder sted på det forudsagte sted. Derefter kan målproteiner eller subdomæner af dem indeholdt mål lysin fremstilles rekombinant og methylering også testet på proteinniveau. Endelig afhængigt af resultaterne, opfølgning eksperimenter kan jeg nvestigate hvis methylering forekommer også i celler, og som biologiske rolle det har.
Figur 1:. Ordningen for peptidsyntese ved SPOT metoden på cellulosemembran Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Eksempel på et peptid-array farvet med bromphenolblåt at bekræfte syntese af peptider Klik her for at se en større udgave af dette tal.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Figur 3: Ordning af peptidet vifte methylering eksperiment; peptid arrays blev methyleret ved inkubation med PKMT og mærket [methyl-3H] -AdoMet i en passende buffer. Bagefter den overføres til hver plet radioaktivitet detekteres ved autoradiografi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4: Eksempel opnåede resultater med NSD1 PKMT A) Eksempel på et substrat specificitet peptid array til NSD1 hjælp af H3 (31-49) sekvens som template.. Den vandrette akse repræsenterer H3-sekvensen, og den lodrette akse repræsenterer de aminosyrer, som den tilsvarende række er muteret. Den første række indeholder peptider medoprindelige sekvens. B) Konsolidering af resultater fra 3 uafhængige peptid-array methylering eksperimenter med NSD1 var oplysningerne gennemsnit resultater fra alle tre forsøg efter normalisering. C) Fordeling af standardfejl for de gennemsnitlige methylering data vist i panelet B. Gengivet fra Kudithipudi et al. (2014) med nogle ændringer 19. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5:. Opdagelsen af nye PKMT substrater A) Forskelsbehandling faktorer NSD1 for anerkendelse af aminosyrerester i positionerne ved siden af målet lysin (K36 i forsøget vist her). Dataene viser, at NSD1 foretrækker aromatiske rester på -2 pHOLDNING (overvejer K36 som position 0). Hydrofobe rester indregnes til -1 og +2 positioner, dog med markante forskelle i detaljer. På +1 stedet basiske rester og amider foretrækkes. På andre sites nogle svage præferencer, men ingen stærk rest specifik udlæsning blev opdaget. B) Screenshot af et eksempel søge på Scansite, ved hjælp af specificitet profil bestemt for NSD1. C) Peptid SPOT array indeholdende flere forudsagt roman NSD1 substrater sammen med positive (H3K36 ) og negative kontroller (H3K36A). Nogle af de bygger nye targets var stærkt methylerede (nogle af dem kommenteret), i andre tilfælde forudsigelserne kunne ikke verificeres. Panel A og C er gengivet fra Kudithipudi et al. (2014) med nogle ændringer 19. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Base | 1 M Oxyma Pure i NMP -> 2,13 g Oxyma Pure i 15 ml NMP |
| Activator | 2,4 ml N, N '-Diisopropylcarbodiimide i 15 ml NMP |
| Loft Blanding | 20% eddikesyreanhydrid i DMF -> 6 ml eddikesyreanhydrid i 30 ml DMF |
| Fmoc-afbeskyttelse | 20% piperidin i DMF -> 200 ml i 1.000 ml DMF |
| Sidechain Afbeskyttelse | 900 pi triisopropylsilan + 600 pi Hedeselskabet 2 O i 30 ml TFA |
| Farvning | 0,02% bromphenolblåt i DMF |
Tabel 1: Kemiske blandinger og deres sammensætning, der anvendes i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPOT syntese som beskrevet her er en kraftfuld metode til at kortlægge protein-protein-interaktion steder og undersøge substratet anerkendelse af peptid-modificerende enzymer. Men SPOT syntese stadig har visse ulemper, fordi selv om peptiderne syntetiseret ved SPOT metode rapporteres at have mere end 90% renhed 21 Dette er vanskeligt at bekræfte i hvert tilfælde. Derfor resultater skal gengives ved andre metoder for eksempel ved anvendelse proteindomæner eller med oprensede peptider syntetiseret ved standardmetoder. Derudover anden væsentlig ulempe ved SPOT arrays er, at det meste af tiden ikke kan genbruges til at udføre flere assays med et array.
For at øge effektiviteten af syntese med aminosyrer med lav stabilitet, ligesom den beskyttede arginin, er det vigtigt at gøre dem friske for hver 5 cyklusser. I enzymatiske reaktioner eller proteinbindende undersøgelser er det ofte bemærkes, at periferien af peptidet stedet har more signalintensitet end midten ("ring spot effekt"). Denne effekt kan skyldes den store tæthed af peptider i den centrale del af stedet og så kan det løses ved nedskalering peptidsyntesen 22. For yderligere fejlfinding af peptidsyntese maskinens håndbog og servicevirksomhed bør høres. Hvis methylering ikke overholdes, skal positiv kontrol peptider (dvs. peptider, der vides methyleres af enzymet, der undersøges) tilføjes til membranen.
Suppleant til SPOT arrays, high density peptid mikro arrays 23 er til rådighed, men de er dyrere og kræver særligt udstyr til brug. Endvidere mængde peptid pr spot er mindre, hvilket kræver mere følsomme udlæsning procedurer. Proteinarrays er også tilgængelige til at studere disse funktioner 24,25, men de er mere vanskelige at fremstille, fordi hver enkelt protein skal udtrykkes og oprenses ogproteinfoldning på arrayet skal opretholdes. En yderligere fordel ved peptid arrays er en eventuel indførelse af post-translationelle modifikationer under syntesen og den lethed mutationel afprøvning af roller individuelle aminosyrerester.
Det er et vigtigt udgangspunkt for denne protokol, skal have mindst ét peptid identificeres, som er methyleret af enzymet under undersøgelsen. Methylering betingelser og puffere skal optimeres, samt koncentrationen af methyltransferase. Eksempler tidsforløb for methylering skal bestemmes for at undgå fuldstændig methylering af det bedste substrat, hvilket vil føre til tab af dynamikområde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
