Abstract
Lysin-Methylierung ist ein aufstrebendes posttranslationale Modifikation und es hat auf mehreren Histon und Nicht-Histon-Proteine identifiziert worden, wo er eine entscheidende Rolle bei der Zellentwicklung und viele Krankheiten spielt. Rund 5.000 Lysin Methylierungsstellen wurden auf verschiedene Proteine, die von einigen Dutzenden von Protein Lysin-Methyltransferasen eingestellt werden identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass jede PKMT methyliert mehrere Proteine jedoch bis jetzt nur ein oder zwei Substrate wurden für mehrere dieser Enzyme identifiziert worden. Um dieses Problem anzugehen, die wir eingeführt haben Peptidarray basierte Substratspezifität Analysen PKMTs. Peptidarrays sind mächtige Werkzeuge, um die Spezifität PKMTs charakterisieren, da die Methylierung der mehrere Substrate mit verschiedenen Sequenzen können auf einem Array getestet werden. Wir Peptidarrays auf Cellulosemembran mit einem Intavis SPOT-Synthese und analysiert die Spezifität der verschiedenen PKMTs. Basierend auf den Ergebnissen aus mehreren dieser Enzyme, neuartige substrates identifiziert werden. Zum Beispiel kann für NSD1 durch Verwendung Peptidarrays, zeigten wir, dass es methyliert K44 H4 statt der berichteten H4K20 und zusätzlich H1.5K168 ist stark bevorzugt Substrat über dem vorbekannten H3K36. Daher Peptid-Arrays sind leistungsfähige Werkzeuge, um biochemisch charakterisieren die PKMTs.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten, zeigen mehrere Berichte die Bedeutung der post-translationale Modifikationen (PTM) in zellulären Entwicklung und mehrere Krankheiten wie Krebs, aber vor kurzem Protein Lysin-Methylierung hat sich als eine andere lebenswichtige PTM entstanden. Während zunächst Histon Lysin-Methylierung wurde festgestellt, eine wesentliche Chromatin Marke werden, zeigten spätere Arbeit auch Lysin-Methylierung von mehreren Nicht-Histon-Proteine 1-4. Die sequentielle Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin zu der ε-Aminogruppe der Lysinreste wird durch eine Familie von Enzymen, genannt Protein Lysin-Methyltransferasen (PKMTs), die mehr als 60 Proteine, die in das menschliche Genom enthält katalysiert. PKMTs wurden zunächst als Histon-modifizierenden Enzymen, die spezifisch Lysinrest methylieren aber später Berichte gezeigt, dass sie auch zu methylieren Nicht-Histon-Proteine 5 entdeckt. Bisher wurden etwa 5.000 Lysin Methylierungsstellen auf verschiedenen Proteinen 6 ermittelten
Peptid-Arrays werden häufig verwendet Werkzeuge für die biochemische Analyse von Antikörpern, Peptid modifizierende Enzyme und Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen (Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand) 7-9. Mehrere hundert Peptide zur suc erforderlichh Anwendungen. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung für die Peptidsynthese, unter ihnen die Peptidsynthese am Harz wird sehr häufig verwendet, aber es kann nur eine beschränkte Durchsatz und relativ teuer ist. Diese Probleme wurden mit der Einführung des SPOT-Syntheseverfahren von Frank und seine Kollegen 10 gelöst. Die SPOT-Syntheseverfahren erlaubt die Synthese von mehreren hundert Peptide parallel und im Mittel er preiswert ist, verglichen mit der Harzsynthese. Die synthetisierten Peptide auf Cellulosemembran kann entweder direkt für verschiedene Anwendungen oder Peptide verwendet werden, können aus der Membran geschnitten und als freie Peptide in Lösung Assays verwendet werden oder Peptid-Mikroarrays 10-13 vorzubereiten.
SPOT-Synthese ist eine Variante des Festphasen-Peptidsynthese, die eine Cellulose-Membran als fester Träger verwendet und verwendet den Standard-Fmoc-Chemie 10-13. Daher ist die Synthese der Peptidketten beginnt am C-terminalen Ende und schreitet in Richtungdie N-terminalen Ende im Vergleich zu der biologischen Synthese in Ribosomen. Cellulosemembranen sind für die Befestigung des ersten aktivierten Aminosäuren (Fig. 1) funktionalisiert. Der Spot-Verfahren basiert auf der sequentiellen Abgabe aktivierten Aminosäuren in einem Tröpfchen von Lösungsmittel zu definierten Spots auf der Membran unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems bezogen. Die Flüssigkeitströpfchen auf der porösen Membran, wo sie eine Kreis nassen Fleck, der später wirkt als offener Reaktor für die chemischen Reaktionen bei der Peptidsynthese bildet verzichtet. Die Fleckgrße wird durch das Volumen abgefüllt und die Absorptionskapazität der Membran bestimmt wird, werden Vielfache von solchen Stellen als Arrays angeordnet sind. Der Synthesemaßstab korreliert mit der Punktgrße und die Belastbarkeit der Membran. Der Abstand zwischen den Flecken und der Dichte des Arrays werden durch Variation der Punktgrßen verwaltet. Cellulosemembran hat mehrere Vorteile, wie Festphasenpeptidsynthese, preiswert, tolerant gegenüber dem chemic ist esals in der Peptidsynthese verwendet, in wässrigen Lösungen stabil ist und leicht zu handhaben. Darüber hinaus macht seine hydrophile Natur es für verschiedene biologische Testsysteme geeignet. SPOT-Synthese kann manuell oder automatisiert (für 1000 von Peptiden), je nach der gewünschten Anzahl von Peptiden werden. Eine vollautomatische SPOT-Synthesizer von Intavis (Köln, Deutschland) ist für unsere Anwendungen. Es ermöglicht die Synthese von Peptiden in unterschiedlichen Mengen und von unterschiedlicher Länge. Lineare Peptide sind regelmäßig mit 15 bis 20 Aminosäuren Länge synthetisiert, zusätzlich Peptiden von bis zu 42 Aminosäuren können auch durch stufenweise Synthese 14,15 hergestellt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von Aminosäuren führt zu einer Verringerung in der Gesamtkopplungsausbeuten, die die Qualität der Peptide beeinträchtigen. Wegen der geringen Menge an Peptiden pro Spot, die Produkte sind oft schwierig zu reinigen, und die Qualität der einzelnen Peptide können nicht einfach beurteilt werden. Daher sind die Ergebnisse von SPOT Pept erhaltenenide Arrays müssen entweder mit Peptiden nach Standardverfahren in größerem Maßstab, die gereinigt und nach Standards in der Peptidsynthese oder durch Synthese der Proteine, die die gewünschten Peptidsequenzen analysiert werden können synthetisiert bestätigt werden. Dennoch fanden wir die SPOT-Synthese durch hohe Zuverlässigkeit und führt in der Regel reproduzierbar sein. SPOT-Synthese ist nicht beschränkt auf Aminosäuren, mehreren kommerziell erhältlichen modifizierten Aminosäuren können auch für die Synthese verwendet werden proteinogenen, wodurch Peptide, die vor und nach der abschließenden Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppe und ferner modifiziert werden, sondern ermöglicht auch den Einbau von phosphoryliert, methyliert oder acetyliert Aminosäuren 11.
Immobilisierte Peptidbibliotheken durch die SPOT-Verfahren synthetisiert können direkt für viele biologische und biochemische Assays verwendet werden. Wir verwendeten Peptidarrays, umfassend 300-400 Peptide, die Substratspezifität von PKMTs untersuchen. Für enzymatische modifiKationen werden die Peptid-Arrays mit den entsprechenden PKMT inkubiert und mit [Methyl- 3 H] -AdoMet in einem geeigneten Puffer. Die Methylierung des jeweiligen Substrats durch folgenden die enzymatische Übertragung von radioaktiv markierten Methylgruppen von AdoMet auf das Peptidsubstrat über Autoradiographie (Fig. 3) untersucht. Durch dieses Verfahren werden die Peptid-Arrays erlauben das Studium der Methylierung von verschiedenen Peptidsubstrate gleichzeitig. Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist, dass alle Peptide in Konkurrenz methyliert, so dass während der linearen Phase der Methylierung Kinetik, ist die relative Methylierungs jedes Peptids proportional zu der katalytischen Geschwindigkeitskonstante geteilt durch die Dissoziationskonstante (k cat / K D) des Enzyms für die jeweiligen Peptidsubstrat. Daher wird die Menge an Radioaktivität in jedem Spot einge direkt mit der enzymatischen Aktivität gegenüber dem jeweiligen Peptids korreliert. Mit derErgebnisse einer Peptidarray-Methylierung Experiment kann die Spezifität Profil des PKMT definiert und basieren auf dieser neuartige Substrate ausgesagt werden. Peptidarrays ermöglichen die schnelle und kostengünstige Überprüfung der Methylierung neuartige Substrate in Peptiden. Hierzu werden Arrays hergestellt, die die vorhergesagten neuen Substrate mit modifizierten Peptide, die eine Ala anstelle von Lys an den Zielorten sowie positive und negative Kontrollpeptide enthalten. Schließlich können die erfindungsgemäßen Proteine als Substrate zusammen mit Mutanten, in denen das Ziel Lys Ala verändert und die Methylierung kann auf Proteinebene zu bestätigen, hergestellt werden. Je nach Ergebnis wird diese dann von biologischen Studien zu möglichen Rollen der Methylierung der neu beschriebenen Proteinsubstraten gefolgt.
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Protocol
1. Herstellung von Peptidarrays
- Programmieren der Peptidsequenzen
- Gestalten Peptidsequenzen für die Synthese mit dem MultiPep Spotter Software. Geben Sie die Peptidsequenzen in Einzelbuchstabencodes.
Peptid 1: TARKSTGGKA - Gene Alanin oder Arginin Spaziergang Bibliotheken mit einem bestimmten Befehl (.replace, A), die für die Anerkennung der einen definierten Untergrund erforderlich wichtigen Aminosäuren zu untersuchen. Zum Beispiel in dem folgenden Beispiel wird die erste Zeile ist der Wildtyp-Sequenz und die aus der zweiten Zeile jeder Aminosäure in einem Peptid mit Alanin sequentiell verändert.
ersetzen, A
TARKSTG
Ein -ARKSTG
T- A -RKSTG
TA-A -KSTG
TAR- A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Verwenden Sie ähnliche Befehle (.replace R,.ersetzen N etc.), wie in 1.1.2 mit allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten (schließlich Weglassen Cystein, Methionin und Tryptophan beschrieben, weil diese Rückstände sind anfällig für Oxidation und manchmal niedriger Syntheseausbeute), um eine Peptidanordnung zur Bestimmung der Konsensus synthetisieren Substrat Sequenzmotiv für ein Enzym.
HINWEIS: Wie in 4A gezeigt ist, stellt die horizontale Achse die gegebene Peptidsequenz und die vertikale Achse repräsentiert die Aminosäuren, die für die Befehls ausgewählt sind. Ähnlich zu der in 1.1.2 gezeigt durch A auf der vertikalen Achse bedeutet, daß ein Ala sequentiell jede Position der gegebenen Reihenfolge in der ersten Reihe in Fig ersetzt. 4A. Ähnlich Arginin nacheinander ersetzt jede Aminosäure in der zweiten Reihe und so weiter bei den anderen Aminosäuren. Komplette Peptidarray-Bibliotheken werden von systematisch in die bereitgestellten Peptidsubstrats Folge Ersetzen jedes Rückstand mit jedem th synthetisierte andere natürlich verfügbaren Aminosäureresten, das hilft, den Einfluss von jedem Rest an jeder Position des gegebenen Sequenz zu verstehen. - Alternativ kann die Methylierung von bekannten oder vorhergesagten Peptidsubstrate leicht verifiziert werden Synthetisieren von Peptid-Bibliotheken mit den Zielpeptide der PKMT zusammen mit positiven und negativen Kontrollen Methylierung (dh Peptide, die methylierte bekannt oder bekannten nicht methyliert sind). Synthetisieren Peptide durch Austausch des mutmaßlichen Ziel Lysin zu Alanin auf Methylierung des Ziel Lysin zu bestätigen, wie unten durch manuelle Programmierung angezeigt.
Wildtyp-Peptid: StGG K PRQFL
Mutant Peptid: StGG A PRQFL
HINWEIS: Die Software ist auch inhärent Skripte verschiedenen Bibliotheken zu erstellen, wie Epitop-Kartierung mit einer gewünschten Rahmenverschiebung der Sequenz wichtig für eine Interaktion erforderlichen Aminosäuren abzubilden.
- Gestalten Peptidsequenzen für die Synthese mit dem MultiPep Spotter Software. Geben Sie die Peptidsequenzen in Einzelbuchstabencodes.
- Vorbereitung der Membran, Aminosäuren eind Reagenzien
- Pre-schwellen die SPOT-Membran in DMF (N, N-Dimethylformamid) für 10 Minuten und dann die feuchte Membran auf der SPOT-Synthesizer Rahmen ohne Luftblasen oder Falten.
- Dreimal mit 100% Ethanol waschen Membran. Man trocknet die Membranen vollständig mindestens 10 min vor Beginn der Syntheseprogramm.
- Parallel frisch zubereiten 0,5 M Arbeitskonzentrationen von kommerziell erhältlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren in NMP löst sie und auch den Aktivator und Base herzustellen, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Stellen Sie sicher, dass alle Abfalllösungsbehälter des SPOT-Synthesizer geleert wurden und füllen Sie die Lösungsmittelbehälter mit dem DMF, Ethanol und Piperidin.
HINWEIS: Das Gerät ist nun bereit für die Synthese.
- Spotten von der ersten Aminosäure
- Um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen, aktivieren Sie die Carboxy-Gruppe der ankommenden Aminosäure des Anbietersding der Aktivator (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) und Basenlösung (Ethyl hydroxyimino cyanoacetat) zu dem Aminosäurederivat.
- Finde die gewünschten Volumina der aktivierten Aminosäuren an die Amino-PEG funktionalisierten Membran unter Verwendung der programmierbaren Roboter.
HINWEIS: Dadurch wird der C-Terminus der Aminosäure an die Aminogruppe der Membran gekoppelt ist. - Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Membran für 20 Minuten und waschen mit DMF zu abgekoppelt Aminosäuren entfernen Sie dann.
- Das Blockieren der freien Plätze auf Non-Spot Bereiche
HINWEIS: Nach der Kupplung der ersten C-terminalen Aminosäure aller Peptide an der Aminogruppe der Membran, werden die Aminogruppen zwischen den Flecken und einige der Aminogruppen in den Punktbereichen keine Bindungen mit den Aminosäuren bilden.- Blockieren diese freien Aminogruppen durch Inkubation mit dem Capping-Lösung (20% Essigsäureanhydrid in DMF)für 5 min.
ANMERKUNG: Dies vermeidet die Kupplung der Aminosäuren in den weiteren Zyklen mit der Membran anstatt der wachsenden Peptidkette.
- Blockieren diese freien Aminogruppen durch Inkubation mit dem Capping-Lösung (20% Essigsäureanhydrid in DMF)für 5 min.
- Die Entfernung der Fmoc-Gruppe
- Nach der Blockierung, Waschen der Membran mit DMF 4 mal und dann inkubiert mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen.
Anmerkung: Dieser Schritt führt zu einer Entfernung der Aminoschutzgruppe Fmoc-Gruppen, und es heißt Entschützung. - Danach waschen Sie die Membran zweimal mit DMF und zweimal mit Ethanol und lassen Sie ihn trocknen.
HINWEIS: Nun ist die Membran ist für die Kopplung der nächsten Aminosäuren.
- Nach der Blockierung, Waschen der Membran mit DMF 4 mal und dann inkubiert mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen.
- Kettenverlängerung
HINWEIS: Die Zugabe jeder Aminosäure wird als ein Zyklus bezeichnet. Abgesehen von der Kopplung der ersten Aminosäure, beginnt der Zyklus mit der Abspaltung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe der gekoppelten Aminosäure und es wird durch die Kopplung der aktivierten Carboxylgruppe einer ankommenden Aminosäure an die Aminogruppe der wachsenden pep gefolgtFlut Kette.- Schritte 1.3 und 1.5, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht wird.
- Färbung
HINWEIS: Nach dem letzten Zyklus werden die Peptidarrays mit Bromphenolblau gefärbt, um die erfolgreiche Synthese von Peptiden zu bestätigen. Bromphenolblau bindet mit den freien Aminogruppen der Peptide. Peptid-Spots zeigen hellblaue Farbe nach dem Färben, aber die Intensität der Flecken variiert abhängig von der Peptidsequenz. Diese Färbung kann die Bestätigung der vollständigen Entfernung des Piperidin, weil in Gegenwart von Piperidin Bromphenolblau nicht die Peptide zu färben. Außerdem hilft dies auch, um die Peptid-Arrays für die weitere Verwendung zu markieren.- Nach der Entfernung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe im letzten Synthesezyklus, waschen Sie die Membran mit DMF und 100% Ethanol. Dann behandeln die Membran mit Bromphenolblau (0,02% Bromphenolblau in DMF) für mindestens 5 Minuten, bis es vollständig blau.
- Danach waschen Sie die Membran mit DMF und ethanol gefolgt von Trocknen für 10 min. Nun nehmen Sie die Membran aus dem Synthesizer und durchzuführen, Seitenkettenschutzgruppenentfernung (Abschnitt 1.8) von Hand. Falls benötigt, fotografieren der Membran, um die Ergebnisse des Peptid-Synthese (Fig. 2) zu dokumentieren.
- Side Chain Entfernung der Schutzgruppe
- Behandlung der Membran mit 20 bis 25 ml der Seitenkettenschutzgruppenabspaltung Mischung bestehend aus 95% Trifluoressigsäure (TFA), um die Seitenkettenschutzgruppen und Reagenzien Scavenger (2,5% Wasser und 2,5% Triisopropylsilan), um die Seitenketten von Aminosäuren aus schützen spalten Änderung bei diesem Schritt. Nehmen Sie eine ausreichende Menge an Entschützung Mischung, um sicherzustellen, dass er die Membran vollständig in einem dicht geschlossenen chemikalienbeständige Box und inkubieren Sie für 1-2 Stunden unter leichtem Schütteln.
- Sechsmal Waschen der Membran mit 20-25 ml DCM (Dichlormethan), jeweils 2 min und schließlich zweimal mit 100% Ethanol und trocknet es im Exsikkator über Nacht.
HINWEIS: Jetztkann die Membran für Experimente verwendet werden. Ein Schema der Peptidsynthese-Array ist in 1 bereitgestellt.
2. Protein Expression and Purification
- Protein Expression von PKMTs als GST Fusions
- Verwendung von Standardtechniken, klonen die über die gesamte Länge PKMT oder seine katalytische Domäne in einen bakteriellen Expressionsvektor (wie pGEX-6p2), um sie als GST-Fusionsprotein zu exprimieren kodierenden Gens.
- Übertragen Sie den Vektor mit dem gewünschten PKMT einfügen in BL21 oder BL21-Codon und E. coli-Zellen durch das Hitzeschock-Methode oder jede andere Methode.
- Vorbereiten einer Vorkultur in 30 ml Luria-Bertani (LB) Medium am Tag der Expression und Inkubation bei 37 ° C für 7 bis 8 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln.
- Als nächstes über 10 ml der Vorkultur in einen 2 l großen Schikane-Kolben mit 1 l LB-Medium und bei 37 ° C im Brutschrank unter ständigem Schütteln bis die Kultur die Reichweitees eine definierte optische Dichte bei 600 nm.
Anmerkung: Dies kann zwar für jedes Protein optimiert werden wir routinemäßig bei einer OD 600 nm von etwa 0,8 zu induzieren. Die Induktionstemperatur muss für jedes Protein einzeln optimiert werden einige Proteine zeigen eine gute Ausdrucks 22 ° C und einige bei höheren Temperaturen. - Verschieben die Zellen an den Induktionstemperatur für 15 min, dann mit 1 mM Isopropyl- & beta; -D-thiogalactopyranosid induziert und damit der Kultur für 10-12 Stunden bei Induktionstemperatur wachsen.
- Danach Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 Minuten und schließlich Waschen des Pellets mit 30 ml STE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA) resuspendiert und bei -20 ° C für die weitere Verwendung.
- Proteinreinigung
- Auftauen Zellpellet und resuspendiere in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) und stören durch Beschallung.
HINWEIS: Dieser Puffer needs für jedes Protein schließlich optimiert werden. - Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 22.000 · g für 1 Stunde und später den Überstand zu sammeln und durch eine Säule, die 600 & mgr; an Glutathion Sepharose 4B-Harz.
- Mit 50 ml Beschallungspuffer und anschließend mit 100 ml Hochsalzpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen Die Säule. Eluieren des gebundenen Proteins mit 5 ml Hochsalzpuffer, enthaltend 40 mM Glutathion.
- Dialysieren des eluierten Proteins in 2 l Dialysepuffer mit niedrigem Glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 10% Glycerin) für 2 Stunden und dann in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 70% Glycerin 8 Stunden oder über Nacht. Achten Sie darauf, alle Reinigungspuffer bei 4 ° C und führen Sie die Proteinreinigung im Kühlraum, um Proteindenaturierung zu vermeiden.
- Auftauen Zellpellet und resuspendiere in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) und stören durch Beschallung.
3. Peptid-Array-Methylierung
- Pre-incuBewährung von Peptidarrays
- Führen Peptidanordnung Methylierung entweder in einem Feld mit der entsprechenden Größe oder in einem Kunststoffbeutel, die Verschwendung des teuren Enzyms und radioaktiv markiertem AdoMet vermeiden. Pre-Inkubation der Peptidarray-Membran in versiegelten Plastikbeutel mit dem jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym und mit [Methyl-3H] -AdoMet 10 min. Das Puffervolumen ist abhängig von der Größe des Arrays, beispielsweise verwenden 8 ml Methylierungspuffer für eine volle Spezifität Profil Peptidanordnung. Optimieren der Menge und Konzentration der AdoMet für jedes Enzym.
- Die Methylierung von Peptidarrays
- Entsorgen Sie die Vorinkubation Puffer und Inkubation der Membran in 8 ml Methylierungspuffer, der die jeweilige PKMT und mit [Methyl-3H] -AdoMet für 1 bis 2 Stunden.
HINWEIS: Die Enzymmenge, für eine Methylierungsreaktion erforderlich ist, hängt von der Aktivität des speziellen PKMT initiieren wir unserem Screening-Experimente in der Regel mit 50 nM Enzym final-Konzentration.
- Entsorgen Sie die Vorinkubation Puffer und Inkubation der Membran in 8 ml Methylierungspuffer, der die jeweilige PKMT und mit [Methyl-3H] -AdoMet für 1 bis 2 Stunden.
- Das Waschen von Peptidarrays
- Danach verwerfen Methylierungspuffer in einer radioaktiven Abfallbehälter und waschen die Peptidarrays 5 mal mit 20 ml Puffer, enthaltend 100 mM Ammoniumbicarbonat und 1% SDS für 5 Minuten, um das gebundene Protein zu entfernen. Entsorgen Sie den Waschpuffer in einem radioaktiven Abfallbehälter.
- Detektion der radioaktives Signal
- Nach den Wäschen Inkubieren der Membran für 5 Minuten in 10 ml Lösung Amplify (NAMP100V).
- Dann werfen Sie die amplify Lösung in die radioaktive Abfälle Behälter für organische Lösemittel, dichten den Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie sie in einer Autoradiographie Kassette.
- Platzieren Sie die Autoradiographie-Film auf dem Peptidarray in den dunklen Raum. Schließen Sie die Kassette vorsichtig und setzen Sie es bei -80 ° C für die erforderliche Zeit. Dann entwickeln die Folie, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild mehrmals mit unterschiedlichen exposition-mal, um eine Sättigung von stark methylierten Peptidsubstrate zu vermeiden.
4. Datenverarbeitung und -analyse
- Densitometrische Analyse der Spotintensitäten
- Scannen Sie den Film in einem konventionellen Scanner und die Spotintensitäten analysieren densitometrisch. Tun Sie dies mit ImageJ (die Freeware ist) oder ein kommerzielles Programm.
BEMERKUNG: Wir verwenden Phoretix Software für diese Aufgabe.
- Scannen Sie den Film in einem konventionellen Scanner und die Spotintensitäten analysieren densitometrisch. Tun Sie dies mit ImageJ (die Freeware ist) oder ein kommerzielles Programm.
- Normalisierung und Mittelwertbildung der Ergebnisse aus verschiedenen Membranen
- Führen Sie die Peptidarray-Methylierungsexperimente zumindest in dreifacher Ausfertigung. Normalisieren die gescannten Intensitäten für jedes Experiment durch Subtraktion des Hinter und Einstellung der Tätigkeit bei einer Referenzsubstrat als 1,0. Der Mittelwert der Daten für die einzelnen Punkte und melden sie als Mittelwerte und Standardabweichungen.
- Datenanalyse und Anzeige
- Zeichnen Sie die Daten in 2D mit einem Graustufen- oder Farbschema, um die relative Tätigkeit hinweisen. Tun Sie dies with Excel oder Sigmaplot wie hier gezeigt. Auch bereiten eine graphische Darstellung der Verteilung der Standardabweichungen der wiederholten Versuchen, um die Qualität der Daten zu analysieren.
- Vergleichen und zeigt die Genauigkeit der Erkennung von jedem Rest in dem Substrat Peptid quantitativ berechnen die relative Präferenz der PKMT für jede Aminosäure i an Position x durch ein Diskriminierungsfaktor D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Wobei v i ist die Geschwindigkeit der Methylierung der Peptidvariante trägt Aminosäure i an Position x und <v j ≠ i> ist der Durchschnittskurs der Methylierung aller 19 Peptiden mit unterschiedlichen Aminosäure j ≠ i an der Position x (einschließlich der Wildtyp-Sequenz).
HINWEIS: Das Diskriminierungsfaktor dadurch definiert, hängt von der Hintergrundebene. Wenn nur ein Rückstand an einer bestimmten Position mit einem Hintergrund von 3%, eine Diskriminierung akzeptiertFaktor von 32,3 erhalten wird. Keine Präferenz in einer Position ergibt sich eine Diskriminierungsfaktor von 0.
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Representative Results
Peptidarrays wurden erfolgreich eingesetzt, um biochemisch charakterisieren die Spezifität PKMTs, und mehrere neue Histon und Nicht-Histon-Substrate PKMT identifiziert durch diesen Ansatz 5,16-19. Definieren der richtigen Substrat-Spektrum einer PKMT (oder einem Enzym), ist ein wesentlicher Schritt in Richtung auf das Verständnis des molekularen Mechanismus und zellulären Funktionen.
Als ein Beispiel für die Anwendung der Peptidfleckenanordnung Methylierungsmethode beschreiben wir die Ergebnisse der Analyse der Spezifität NSD1 PKMT 19. Zurück zu unserer Arbeit wurde dieses Enzym Methylat mehreren Substraten, einschließlich Histon H3 an K36 und Histon H4 an K20, sondern auch die NF-kB-Familie Transkriptionsfaktor p65 bei K218 und K221. Beschrieben. 4A zeigt ein Beispiel für eine Methylierungsreaktion eines Peptidarray mit NSD1. Für diese Versuche, ein großes Peptidarray auf der Basis der H3 (31-49) Sequenz wurde synthetisiert, dass enthält alle möglicheneinzelne Aminosäureveränderungen der ursprünglichen Sequenz, um die Bedeutung der einzelnen Aminosäure für NSD1 Interaktion und Methylierung zu testen. Insgesamt 380 Peptide wurden synthetisiert (20 möglichen Aminosäuren x 18 Rückstände plus eine Original-H3-Sequenz in jeder Zeile). Die horizontale Achse stellt die Sequenz des Peptids und in vertikaler Richtung die Aminosäure, die in dem entsprechenden Peptid verändert wird, wird angezeigt. Zum Beispiel kann die Stelle in Zeile 17 der Spalte 4 enthält ein Threonin an der dritten Position anstelle von Glycin, das in der Wildtyp-Sequenz (Fig. 4A) vorhanden ist. Derart sind Punktmutationen, die Präferenz der NSD1 für jede native Aminosäure an jeder Position in der Peptidsubstrats zu testen. Methylierung mit NSD1 zeigte, dass es wirkt spezifisch auf H3K36 und Einstellungen auf jeder Seite der Ziellysin 34-38 hat.
4B stellt die Konsolidierung der drei Peptidarray-MethylierungExperimente mit NSD1. Die quantitativen Angaben wurden aus den einzelnen Peptidarrays erfasst und die Ergebnisse wurden normalisiert und gemittelt, wie oben beschrieben. Die Standardabweichungen der einzelnen Durchschnittswerte zeigen, dass die Daten sehr gut reproduzierbar. Insgesamt etwa 85% der Peptide ein SDS kleiner als 20% und mehr als 97% der Peptidsubstraten demonstriert SDs kleiner als 30% (Fig. 4C). Darüber hinaus haben wir auch die Diskriminierungsfaktor, um den Beitrag jeder Aminosäure bei den getesteten Positionen genau zu bestimmen, ermittelt. Wie beschrieben ist liefert die quantitative Beschreibung des Peptids ausgelesen und bevorzugt von Aminosäuren an der spezifischen Position (Fig. 5A). Unsere Daten zeigen, dass NSD1 bevorzugt aromatische Reste an der 2-Position (unter Berücksichtigung K36 als Position 0) (F> Y> G); hydrophobe Reste bei -1 (I> L> V); basischen Resten +1 (R> QKNM), wo sie hydrophobe oder aromatische Reste nicht tolerieren; und hydrophobic Reste an zwei (V> IA> P). An anderen Standorten (zB -3, +3 oder +6), NSD1 zieht einige Aminosäuren, aber keine starke Rückstände spezifische Anzeige festgestellt.
Basierend auf diesem Profil können potenzielle neuartige Peptidsubstrate von Datenbankrecherchen wie mit Scansite 20 (Fig. 5B) gefunden werden. Diese Peptide wurden auf eine Fleckenanordnung, die positive und negative Kontrollen hergestellt und mit NSD1 inkubiert und radioaktiv markiertem AdoMet um die Teilmenge von ihnen, die auf Peptidebene (Fig. 5C) methyliert sind, zu identifizieren. Zur Nachverfolgung können Peptid-Arrays hergestellt, die Peptid-Varianten, in denen die Ziel Lysin durch Alanin ersetzt werden, umfassen, um zu bestätigen, dass die Methylierung an der vorhergesagten Stelle stattfindet. Dann kann die Zielproteine oder Subdomänen davon, die die Ziellysin rekombinant hergestellt werden und die Methylierung auch auf Proteinebene untersucht. Schließlich abhängig von den Ergebnissen, Follow-up-Experimente können i nvestigate wenn die Methylierung erfolgt auch in Zellen und die biologische Funktion hat.
Abb. 1: Schema der Peptidsynthese durch den SPOT-Methode auf Cellulosemembran Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 2: Beispiel einer Peptidarray mit Bromphenolblau gefärbt, um die Synthese von Peptiden zu bestätigen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 3: Schematische Darstellung des Peptidarray-Methylierungs-Experiment; Peptidarrays wurden durch Inkubation mit PKMT methyliert und markiertem [Methyl- 3 H] -AdoMet in einem geeigneten Puffer. Danach wird die Radioaktivität an jeden Ort übertragen wird, durch Autoradiographie nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 4: Beispiel für Ergebnisse mit der NSD1 PKMT A) Beispiel einer Substratspezifität Peptidanordnung für NSD1 mit der H3 (31-49) Sequenz als Matrize erhalten.. Die horizontale Achse stellt die H3-Sequenz und die vertikale Achse repräsentiert die Aminosäuren durch die die entsprechende Zeile mutiert. Die erste Zeile enthält Peptide mitOriginalsequenz. B) Konsolidierung der Ergebnisse von drei unabhängigen Peptidarray-Methylierungsexperimente mit NSD1 wurden die Daten gemittelt ergibt sich aus allen drei Versuchen nach der Normalisierung. C) Verteilung der Standardfehler für die in Feld B aus Kudithipudi et reproduziert gezeigt durchschnittlichen Methylierungsdaten al. (2014) mit einigen Änderungen 19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Fig. 5: Entwicklung neuartiger PKMT Substrate A) Discrimination Faktoren NSD1 zur Erkennung der Aminosäurereste an den Positionen neben dem Ziel Lysin (K36 im Experiment hier gezeigt). Die Daten zeigen, dass NSD1 bevorzugt aromatische Reste am -2 position (unter Berücksichtigung K36 als Position 0). Hydrophobe Reste an der 1 und 2 Positionen mit markanten Unterschiede in den Details erkennen, wenn auch. Am +1 Ort basischen Resten und Amide bevorzugt. An anderen Standorten wurden einige Schwach Vorlieben, aber keine starke Rückstände spezifische Anzeige) Screenshot eines beispiel Suche auf Scansite erkannt. B, mit der Besonderheit Profil für NSD1. C) Peptid SPOT Array mit mehreren vorhergesagt Roman NSD1 Substrate zusammen mit positiven (H3K36 bestimmt ) und Negativkontrollen (H3K36A). Einige der prädizierten neue Targets waren stark methyliert (einige von ihnen annotiert), in anderen Fällen die Vorhersagen konnte nicht verifiziert werden. Panel A und C ist aus Kudithipudi et al mit einigen Änderungen 19 wiedergegeben. (2014). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Basis | 1 M Oxyma pur in NMP -> 2,13 g Oxyma pur in 15 ml NMP |
| Activator | 2,4 ml N, N '-Diisopropylcarbodiimide in 15 ml NMP |
| Capping Mischung | 20% Essigsäureanhydrid in DMF -> 6 ml Essigsäureanhydrid in 30 ml DMF |
| Fmoc-Abspaltung | 20% Piperidin in DMF -> 200 ml in 1000 ml DMF |
| Sidechain Entfernung der Schutzgruppe | 900 ul Triisopropylsilan + 600 ul ddH 2 O in 30 ml TFA |
| Färbung | 0,02% Bromphenolblau in DMF |
Tabelle 1: Chemische Gemische und deren Zusammensetzung in der Protokoll verwendet.
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Discussion
SPOT-Synthese, wie hier beschrieben ist eine leistungsfähige Methode zur Karte Protein-Protein-Interaktionsstellen und untersuchen die Substraterkennung von Peptid-modifizierende Enzyme. Jedoch hat SPOT Synthese noch bestimmte Nachteile, denn obwohl die Peptide von der SPOT-Verfahren synthetisiert wird berichtet, daß mehr als 90% Reinheit 21 haben, ist dies schwierig, in jedem Fall zu bestätigen. Deshalb müssen Ergebnisse, die durch andere Methoden zum Beispiel mit Proteindomänen oder mit gereinigten Peptide mittels Standardverfahren synthetisiert reproduziert werden. Darüber hinaus ist die andere Hauptnachteil der SPOT-Arrays, die die meiste Zeit sie nicht wiederverwendet werden kann, um mehrere Assays mit einer Anordnung.
Um die Effizienz der Synthese mit Aminosäuren der geringen Stabilität zu erhöhen, wie das geschützte Arginin, ist es wichtig, sie frisch für jeweils 5 Zyklen zu machen. Bei enzymatischen Reaktionen oder Proteinbindungsstudien wird oft beobachtet, dass die Peripherie des Peptidfleck more Signalintensität als die Mitte ("Ring-Spot-Effekt"). Dieser Effekt kann durch die hohe Dichte von Peptiden im zentralen Teil des Flecks, und dann kann es durch Herunterskalieren der Peptidsynthese 22 gelöst werden. Weitere Fehlersuche der Peptidsynthese die Maschinenhandbuch und Unternehmensdienstleister konsultiert werden. Wenn Methylierung nicht beobachtet wird, sollte positive Kontroll-Peptide (dh Peptide bekannt, die durch das Enzym untersucht methyliert) zur Membran hinzugefügt.
Alternative zum SPOT-Arrays hoher Dichte Peptidmikroarrays 23 zur Verfügung, aber sie sind teurer und erfordern eine spezielle Ausrüstung für die Nutzung. Darüber hinaus die Menge an Peptid pro Spot ist kleiner, die empfindlicher Ausleseverfahren erfordert. Proteinarrays sind ebenfalls verfügbar, um diese Funktionen 24,25 studieren, aber sie sind schwieriger herzustellen, da jedes einzelne Protein muss exprimiert und gereinigt werden, undProteinfaltung auf der Anordnung beibehalten werden muss. Ein zusätzlicher Vorteil der Peptid-Arrays ist die mögliche Einführung von posttranslationalen Modifikationen während der Synthese und der Leichtigkeit der Mutationstests der Rollen einzelner Aminosäurereste.
Es ist eine wesentliche Ausgangspunkt für dieses Protokoll, um mindestens ein Peptid identifiziert, das durch das Enzym unter Untersuchung methyliert sind. Methylierungsbedingungen und Puffer müssen optimiert werden, ebenso wie die Konzentration der Methyltransferase. Ausführungszeitverläufe der Methylierung bestimmt werden müssen, um eine vollständige Methylierung der beste Substrat, die den Verlust der dynamischen Bereich verursachen vermeiden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
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