Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/52203
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Stuttgart University

Abstract

מתילציה ליזין היא שינוי לאחר תרגום מתעורר וזה זוהה על חלבונים כמה היסטון ולא-היסטון, שבו היא משחקת תפקידים מכריעים בפיתוח תאים ומחלות רבות. כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים, הנקבעים על ידי כמה עשרות methyltransferases יזין החלבון. הדבר מצביע על כך כל PKMT methylates חלבונים מרובים, אך עד עכשיו רק אחד או שתיים מצעים זוהו במשך כמה אנזימים אלה. הספציפיות מצע מבוססות מערך פפטיד להתקרב בעיה זו, יש לנו הצגתי ניתוחים של PKMTs. מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs כי מתילציה של כמה מצעים עם רצפים שונים, ניתן לבדוק על מערך אחד. אנו מסונתזים מערכי פפטיד על קרום תאית באמצעות סינתיסייזר Intavis SPOT וניתחנו את הספציפיות של PKMTs השונים. בהתבסס על התוצאות, לכמה מאנזימים אלה של רומן,ubstrates יכול להיות מזוהה. לדוגמא, לNSD1 על ידי העסקת מערכי פפטיד, שהראינו כי זה methylates K44 של H4 במקום H4K20 דיווח ובנוסף H1.5K168 הוא המצע המועדף ביותר על H3K36 הידוע קודם לכן. לפיכך, מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין ביוכימית PKMTs.

Introduction

בשני העשורים האחרונים, כמה דיווחים הוכיחו את החשיבות של שינויים לאחר translational (PTM) בפיתוח סלולארי וכמה מחלות כמו סרטן, אך לאחרונה מתילציה ליזין חלבון התפתחה אחר PTM חיוני. בעוד מתילציה ליזין תחילה היסטון נמצאה סימן הכרומטין חיוני, עבודה מאוחר יותר הראתה גם מתילציה ליזין של כמה חלבונים לא-היסטון 1-4. ההעברה רציפה של קבוצות מתיל מS-adenosyl-L-מתיונין לקבוצת ε-אמינו של שאריות ליזין היא זרז על ידי משפחה של אנזימים בשם החלבון Methyltransferases ליזין (PKMTs) המכילה יותר מ -60 חלבונים בגנום האנושי. PKMTs תחילה התגלה כאנזימי היסטון שינוי שmethylate שאריות ליזין ספציפיים אך דיווחים מאוחרים יותר הראו שהם יכולים גם methylate חלבונים לא-היסטון 5. עד עכשיו, כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים 6

מערכי פפטיד נמצאים בשימוש נרחב בכלים לניתוח ביוכימי של נוגדנים, אנזימי שינוי פפטיד ומיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים (הנוגדנים אנטיגן, קולט ליגנד) 7-9. כמה מאות פפטידים הנדרשים לsucיישומי h. שיטות שונות זמינות עבור סינתזת פפטיד, ביניהם פפטיד סינתזה על שרף מאוד נפוץ, אבל יש לו מגבלות בתפוקה וזה יקר יחסית. בעיות אלה נפתרו עם כניסתה של שיטת סינתזת SPOT על ידי פרנק ועמיתים 10. שיטת סינתזת SPOT מאפשרת סינתזה של כמה מאה פפטידים במקביל ובממוצע זה הוא זול בהשוואה לסינתזת שרף. פפטידים המתאחד על קרום תאית יכולים לשמש באופן ישיר עבור יישומים או פפטידים שונים ניתן ביקעו מהקרום ומשמש כפפטידים חופשיים למבחני פתרון או להכין microarrays פפטיד 10-13.

סינתזת SPOT הינה נגזרת של סינתזת פפטיד השלב המוצקה, אשר עושה שימוש בקרום תאית כתמיכה מוצקה ומעסיקה Fmoc-הכימיה סטנדרטית 10-13. לפיכך, הסינתזה של רשתות פפטיד מתחילה בסוף C-מסוף וממשיך לכיווןסוף N-terminal בניגוד לסינתזה הביולוגית בריבוזומים. קרומים תאית הם פונקציונליות לצירופה של חומצות אמינו הופעלו הראשונות (איור. 1). שיטת SPOT מבוססת על האספקה ​​רציפה של חומצות אמינו הופעלו בטיפה של ממס לכתמים מוגדרים על הקרום באמצעות מערכת pipetting אוטומטית. הטיפה של נוזל היא לוותר על הקרום הנקבובי שבו הוא יוצר כתם רטוב מעגלי, אשר מאוחר יותר פועל ככור פתוח לתגובות כימיות בסינתזת פפטיד. גודל הנקודה נקבע על ידי הנפח לוותר ויכולת הקליטה של ​​הקרום, בכפולות של כתמים כגון מסודרות כמו מערכים. הסולם של סינתזה בקורלציה עם גודל הנקודה ואת יכולת הטעינה של הקרום. המרחק בין הכתמים והצפיפות של מערכים מנוהל על ידי שינוי גדלי המקום. יש קרום תאית כמה יתרונות כמו שלב מוצק בסינתזת פפטיד, זה לא יקר, סובלני לchemicals משמש בסינתזת פפטיד, יציב בתמיסות מימיות וקל לטפל. בנוסף, האופי הידרופילי שלה הופך אותו מתאים למספר מערכות assay ביולוגיות. סינתזת SPOT יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי (ל1000s של פפטידים) בהתאם למספר הנדרש של פפטידים. סינתיסייזר SPOT אוטומטי לחלוטין מIntavis (קלן, גרמניה) משמש ליישומים שלנו. היא מאפשרת סינתזה של פפטידים בכמויות שונות ואורך שונה. פפטידים ליניארי מסונתזים באופן קבוע עם אורך חומצת אמינו 15 עד 20, בפפטידים תוספת של עד 42 חומצות אמינו יכול גם להיות מוכן בסינתזה צעד חכם 14,15. עם זאת, הגדלת מספר חומצות אמינו מובילה לירידה בתשואות הצימוד הכוללות, אשר משפיעה על האיכות של פפטידים. בגלל הכמות הנמוכה של פפטידים למקום, המוצרים לעתים קרובות קשים כדי לטהר ולא ניתן להעריך בקלות את האיכות של פפטידים בודדים. לכן, התוצאות שהתקבלו מpept SPOTמערכי IDE חייבים להיות מאושרים גם עם פפטידים המתאחדים בשיטות סטנדרטי בקנה מידה גדולה יותר, אשר יכול להיות מטוהרת ונותחו על פי סטנדרטים בסינתזת פפטיד או על ידי סינתזת החלבונים המכילים את רצפי הפפטיד הרצויים. ובכל זאת, מצאנו את סינתזת SPOT להיות אמין מאוד ותוצאות בדרך כלל להיות לשחזור. סינתזת SPOT אינה מוגבלת לproteinogenic חומצות אמינו, חומצות אמינו כמה שונה זמינות מסחרי יכול לשמש גם לסינתזה, המאפשרת פפטידים להיות שונה לפני ואחרי המחשוף הסופי של קבוצת הגנת צד שרשרת ו, יתר על כן, הוא גם מאפשר שילוב של חומצות אמינו phosphorylated, מפוגלים או acetylated 11.

ספריות פפטיד משותקות המסונתזת על ידי שיטת SPOT ניתן להשתמש ישירות עבור רבים מבחני ביולוגיים וביוכימיים. אנחנו עובדים מערכי פפטיד הכוללים 300-400 פפטידים לחקור את הספציפיות המצע של PKMTs. לmodifi האנזימטיתקטיון, מערכי פפטיד מודגרת עם PKMT המתאים ושכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. מתילציה של המצע המתאים מנותחת על ידי בעקבות ההעברה האנזימטית של קבוצות מתיל שכותרת רדיואקטיבית מAdoMet למצע פפטיד באמצעות autoradiography (איור. 3). על ידי הליך זה, מערכי פפטיד לאפשר המחקר של מתילציה של מצעי פפטיד שונים באותו הזמן. יתרון חשוב של שיטה זו הוא שכל פפטידים מפוגלים בתחרות, כך שבשלב ליניארי של קינטיקה מתילציה, מתילציה היחסית של כל פפטיד היא פרופורציונלית לשיעור הקבוע קטליטי מחולק במתמיד דיסוציאציה (k חתול / K D) של האנזים למצע פפטיד בהתאמה. לפיכך, הסכום של רדיואקטיביות שולב כל נקודה מתואם ישירות עם הפעילות האנזימטית לקראת פפטיד המסוים. שימוש בתוצאותיו של ניסוי מתילציה מערך פפטיד, הפרופיל הספציפי של PKMT יכול להיות מוגדרת ומבוסס על מצעי הרומן הזה יכול להיות מבוסס. מערכי פפטיד לאפשר אימות היעילה המהירה ועלות של מתילציה של מצעי רומן ברמת פפטיד. לשם כך, מערכים מוכנים המכילים את מצעי הרומן חזו יחד עם פפטידים שונה המכילים עלא במקום ליס באתרי היעד, כמו גם פפטידים ביקורת חיוביים ושליליים. לבסוף, ניתן להכין מצעי רומן חלבונים יחד עם מוטציות, שבו היעד ליס משתנה לעלא ומתילציה ניתן לאשר ברמת החלבון. בהתאם לתוצאות, זה לאחר מכן על ידי מחקרים ביולוגיים טיפול תפקידים פוטנציאליים של מתילציה של מצעי החלבון תיארו זה עתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מערכי פפטיד

  1. תכנות של רצף הפפטידים
    1. עיצוב רצפי פפטיד לסינתזה באמצעות תוכנת MultiPep Spotter. הזן את רצף הפפטידים בקודי אות אחת.
      פפטיד 1: TARKSTGGKA
    2. צור ספריות אלאנין או ארגינין לטייל עם פקודה מסוימת (.replace,) להקרין את חומצות אמינו החשובות הנדרשות להכרה במצע מוגדר. למשל בדוגמא הבאה השורה הראשונה היא רצף הסוג בר ומהשורה השנייה כל חומצת אמינו בפפטיד משתנה ברצף אלאנין.
      להחליף,
      TARKSTG
      -ARKSTG
      T- -RKSTG
      ת א -KSTG
      הזפת -STG
      TARK- -TG
      TARKS- -G
      TARKST-
    3. להשתמש בפקודות דומות (R .replace,.להחליף N וכו ') כפי שמתואר ב1.1.2 עם כל שאריות חומצת אמינו הזמינות באופן טבעי (סופו של דבר השמטת ציסטאין, מתיונין וטריפטופן, כי שאריות אלה נוטות לחמצון ותשואת סינתזה לפעמים נמוכה) לסנתז מערך פפטיד לקביעת הקונצנזוס מוטיב רצף מצע לאנזים.
      הערה: כפי שמוצג באיור 4 א, ​​הציר האופקי מייצג את רצף הפפטיד ניתנו והציר האנכי מייצג את חומצות אמינו שנבחרו לפקודה. בדומה לרצף מוצג ב1.1.2, על הציר האנכי אומר שרצף עלא מחליף כל עמדה של הרצף נתון בשורה הראשונה באיור. 4A. באופן דומה ברצף ארגינין מחליף כל חומצת אמינו בשורה השנייה וכן הלאה עם חומצות אמינו האחרות. ספריות מערך פפטיד מלאים מסונתזים על ידי החלפה שיטתית כל שאריות ברצף המצע פפטיד מסופק עם כל אחד מהשאריות אחרות הדואר זמינה באופן טבעי חומצת אמינו, זה עוזר להבין את ההשפעה של כל שאריות בכל עמדה של הרצף נתון.
    4. לחלופין, מתילציה של מצעי פפטיד ידועים או צפויים יכולה להיות בקלות מאומתת סינתזת ספריות פפטיד עם פפטידים היעד של PKMT יחד עם בקרות מתילציה החיובית ושלילית (כלומר פפטידים ידועים מפוגל או ידועים לא להיות מפוגל). לסנתז פפטידים על ידי החלפת ליזין היעד המשוער לאלאנין כדי לאשר מתילציה של ליזין היעד כפי שמוצג להלן על ידי תכנות ידני.
      פפטיד סוג בר: STGG K PRQFL
      פפטיד Mutant: STGG PRQFL
      הערה: התוכנה יש גם תסריטים טבועים ליצור ספריות שונות, כמו מיפוי epitope עם שינוי מסגרת רצויה של הרצף למפות חומצות אמינו חשובות הנדרשות לאינטראקציה.
  2. הכנת ממברנה, חומצות אמינוריאגנטים ד
    1. טרום להתנפח קרום SPOT בDMF (N, N -Dimethylformamide) למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם את הקרום הרטוב על מסגרת סינתיסייזר SPOT ללא בועות אוויר או קמטים.
    2. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 100% אתנול. ייבש את הקרומים לחלוטין במשך לפחות 10 דקות לפני תחילת תכנית הסינתזה.
    3. במקביל, טרי להכין 0.5 M ריכוזי עבודה של חומצות אמינו מוגנים-Fmoc זמינים מסחרי על ידי המסתם בתמ"א וגם להכין את activator ובסיס כפי שמתואר בטבלה 1.
    4. ודא שכל מכולות פתרון בזבוז של סינתיסייזר SPOT התרוקנו ומילוי מאגרי מי הממס עם DMF, אתנול וpiperidine.
      הערה: עכשיו המכונה מוכנה לסינתזה.
  3. תצפית של ראשית חומצת אמינו
    1. על מנת ליצור את הקשר אמיד עם קבוצת אמינו החופשית על הקרום, להפעיל את קבוצת carboxy של חומצת אמינו נכנסת על ידי מודעהדינג activator (N, -Diisopropylcarbodiimide 'N) ופתרון בסיס (cyanoacetate hydroxyimino אתיל) לנגזר של חומצות אמינו.
    2. לזהות את ההיקפים הרצויים של חומצות אמינו הופעלו על הקרום פונקציונליות אמינו-PEG באמצעות הרובוט הניתן לתכנות.
      הערה: בכך, C-הסופי של חומצת אמינו הוא מצמידים את קבוצת אמינו של הקרום.
    3. חזור על פעולה זו שלוש פעמים כדי להבטיח צימוד טוב יותר של חומצת אמינו הופעלה לראשונה. דגירה הממברנה במשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף עם DMF להסיר חומצות אמינו כשהתיר.
  4. חסימה של החדרים חינם באזורים שאינם מקום
    הערה: לאחר הצימוד של החומצה הראשונה C-מסוף אמינו של כל פפטידים לקבוצת אמינו של הקרום, קבוצות אמינו בין הכתמים וגם חלק מקבוצות אמינו בתוך שטחי המקום אינן יוצרות קשרים עם חומצות אמינו.
    1. לחסום קבוצות אמינו חופשיות אלה על ידי דוגרים עם פתרון מכסת (20% אנהידריד אצטית בDMF)במשך 5 דקות.
      הערה: זה ימנע את הצימוד של חומצות אמינו במחזורים נוספים עם הקרום במקום שרשרת הפפטיד הגוברת.
  5. הסרת קבוצת Fmoc
    1. לאחר החסימה, לשטוף את הממברנה עם DMF 4 פעמים ולאחר מכן דגירה עם piperidine 20% בDMF עבור 20 דקות להסיר את קבוצת הגנת Fmoc.
      הערה: שלב זה מוביל להסרת קבוצות Fmoc הגנה-אמינו והוא נקרא deprotection.
    2. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה פעמיים עם DMF ופעמים עם אתנול ולאפשר לו להתייבש.
      הערה: עכשיו הקרום מוכן לצימוד של חומצות אמינו הבאות.
  6. התארכות שרשרת
    הערה: תוספת של כל חומצת אמינו נקראת מחזור. מלבד הצימוד של חומצת אמינו הראשונה, מחזור מתחיל עם deprotection של קבוצת Fmoc של חומצת אמינו בשילוב ואחריו מופיעים הצימוד של קבוצת carboxyl מופעלת של חומצת אמינו הנכנסת לקבוצת אמינו של העידוד גדלשרשרת גאות.
    1. חזור על שלבים 1.3 ו -1.5 עד אורך הפפטיד הרצוי.
  7. מכתים
    הערה: לאחר המחזור האחרון, מערכי פפטיד מגואלות bromophenol הכחול כדי לאשר את הסינתזה המוצלחת של פפטידים. Bromophenol הכחול נקשר עם קבוצות אמינו חופשיות של פפטידים. כתמי פפטיד להראות צבע כחול בהיר לאחר הצביעה אבל עוצמת הכתמים משתנה בהתאם לרצף הפפטיד. צביעה זו מאפשרת אישור של הסרת piperidine השלמה, כי בנוכחותו של bromophenol piperidine כחול לא להכתים את פפטידים. בנוסף, זה גם עוזר לציון מערכי פפטיד לשימוש נוסף.
    1. לאחר deprotection קבוצת Fmoc במחזור הסינתזה האחרון, לשטוף את הממברנה עם DMF ו 100% אתנול. לאחר מכן, לטפל בקרום עם bromophenol הכחול (0.02% bromophenol כחולים בDMF) למינימום של 5 דקות עד שהוא הופך לחלוטין כחול.
    2. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם DMF ומכון טכנולוגי שלanol אחרי ייבוש למשך 10 דקות. עכשיו קח את הקרום מסינתיסייזר ולבצע deprotection שרשרת הצד (סעיף 1.8) באופן ידני. במידת הצורך, לצלם את הקרום לתעד את התוצאות של סינתזת פפטיד (איור. 2).
  8. Deprotection שרשרת הצד
    1. פנק את הקרומים עם 20 עד 25 מיליליטר של תערובת deprotection שרשרת הצד בהיקף של 95% חומצת trifluoroacetic (TFA) לדבוק קבוצות הגנת שרשרת הצד וריאגנטים נבלות (2.5% triisopropylsilane מים ו -2.5%) כדי להגן על הרשתות בצד של חומצות אמינו מ שינוי במהלך שלב זה. קח נפח מספיק של תערובת deprotection כדי לוודא שהוא מכסה את הקרום בקופסא עמידה כימית סגורה היטב לחלוטין ודגירה אותו ל1-2 שעות תוך רעד בעדינות.
    2. לשטוף את הממברנה שש פעמים עם 20-25 מיליליטר של DCM (dichloromethane) עבור 2 דקות כל אחד, ולבסוף פעמיים עם 100% אתנול ולייבש אותו בתא ייבוש למשך לילה.
      הערה: עכשיוהקרום יכול לשמש לניסויים. תכנית של סינתזת מערך פפטיד מסופקת באיור 1.

2. ביטוי חלבון וטיהור

  1. ביטוי חלבון של PKMTs כFusions GST
    1. באמצעות שימוש בטכניקות סטנדרטית, לשכפל את גן קידוד PKMT באורך המלא ובתחומו הקטליטי לתוך וקטור ביטוי חיידקים (כמו pGEX-6p2) לבטא את זה כמו חלבון GST-היתוך.
    2. העבר את הווקטור עם PKMT הרצוי להכניס לתוך BL21 או BL21 קודון בתוספת א ' תאי coli בשיטת הלם חום או כל שיטה אחרת.
    3. הכן מראש תרבות עם 30 מיליליטר של וריא-Bertani (LB) תקשורת ביום ביטוי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 7-8 שעות עם רעד מתמשך.
    4. בשלב הבא, להעביר 10 מיליליטר של טרום-התרבות לצלוחיות מבולבלות גדולות 2 L מכילות 1 ליטר של תקשורת LB ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה עם רעד מתמשך עד להישג ידם התרבותes צפיפות אופטית מוגדרת ב 600 ננומטר.
      הערה: אמנם זה יכול להיות מותאם לכל חלבון, אנו באופן שיגרתי לגרום ב600nm OD של כ 0.8. טמפרטורת האינדוקציה צריך להיות מותאמת לכל חלבון בנפרד, כמה חלבונים להראות ביטוי טוב בגיל 22 מעלות צלזיוס וכמה בטמפרטורות גבוהות.
    5. Shift התאים לטמפרטורת האינדוקציה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשרות עם 1 מ"מ של איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside ולאפשר לתרבות לגדול במשך 10-12 שעות בטמפרטורת אינדוקציה.
    6. לאחר מכן לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 15 דקות ולבסוף לשטוף את הכדור עם 30 מיליליטר של חיץ STE (10 מ"מ טריס pH 8.0, 100 mM NaCl ו -0.1 מ"מ EDTA) ולאחסן ב -20 ° C לשימוש נוסף.
  2. חלבון טיהור
    1. להפשיר את התא גלולה מחדש להשעות ב -30 מיליליטר של חיץ sonication (50 מ"מ טריס pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ DTT ו -5% גליצרול) ולשבש ידי sonication.
      הערה: n חיץ זהeeds להיות מותאם לכל חלבון סופו של דבר.
    2. צנטריפוגה lysate התא ב22,000 XG עבור שעה 1, ולאחר מכן לאסוף את supernatant ועובר דרך עמודה המכילה 600 μl של גלוטתיון שרף Sepharose 4B.
    3. לשטוף את העמודה עם 50 מיליליטר של חיץ sonication והבא עם של חיץ מלח גבוה (50 מ"מ טריס pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 מ"מ DTT ו -5% גליצרול) כדי להסיר חלבונים מחויבים unspecifically 100 מיליליטר. Elute החלבון הקשור עם 5 מיליליטר של חיץ מלח גבוה המכיל 40 מ"מ גלוטתיון.
    4. Dialyze חלבון eluted ב 2 L של חיץ דיאליזה עם גליצרול הנמוך (20 מ"מ טריס pH 7.4, 100 מ"מ KCl, גליצרול 0.5 מ"מ DTT ו- 10%) עבור שעה 2, ומאוחר יותר ב -20 מ"מ טריס pH 7.4, 100 מ"מ KCl, 0.5 מ"מ DTT וגליצרול 70% במשך 8 שעות או למשך הלילה. ודא שכל מאגרי הטיהור הם על 4 מעלות צלזיוס ולבצע טיהור החלבון בחדר הקר, כדי למנוע denaturation חלבון.

3. מתילציה מערך פפטיד

  1. טרום incubation של פפטיד מערכים
    1. בצע מתילציה מערך פפטיד או בקופסא בגודל מתאים או בשקית ניילון, כדי למנוע הבזבוז של אנזים וAdoMet שכותרתו רדיואקטיבית היקר. טרום דגירה קרום פפטיד המערך בשקית פלסטיק אטומה המכיל מאגר מתילציה בהתאמה ללא אנזים וכותרתו [מתיל-3H] -AdoMet במשך 10 דקות. הנפח של חיץ תלוי בגודל של המערך, למשל להשתמש 8 מיליליטר של חיץ מתילציה למערך פפטיד הפרופיל סגוליות מלא. לייעל את הכמות וריכוז של AdoMet לכל אנזים.
  2. מתילציה של פפטיד מערכים
    1. מחק את כל המאגר של טרום-הדגירה דגירה הקרום ב 8 מיליליטר של חיץ מתילציה מכיל PKMT המתאים ושכותרתו [מתיל-3H] -AdoMet ל1-2 שעות.
      הערה: כמות האנזים הדרושה לתגובת מתילציה תלויה בפעילות של PKMT הספציפי, אנו יוזמים ניסויי ההקרנה שלנו בדרך כלל עם 50 סנפיר אנזים ננומטרריכוז אל.
  3. כביסה של פפטיד מערכים
    1. לאחר מכן לבטל את חיץ מתילציה במכל פסולת רדיואקטיבית ולשטוף את מערכי פפטיד במשך 5 פעמים עם 20 מיליליטר של מאגר המכיל 100 מ"מ ביקרבונט אמוניום ו -1% SDS למשך 5 דקות כדי להסיר את החלבון הקשור. מחק את חיץ הכביסה במכל פסולת רדיואקטיבית.
  4. זיהוי של אותות רדיואקטיבי
    1. לאחר שטיפות דגירה הקרום במשך 5 דקות ב 10 מיליליטר של תמיסה להגביר (NAMP100V).
    2. לאחר מכן, לבטל את הפתרון להגביר לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית לממסים אורגניים, לאטום את מערך פפטיד בשקית ניילון ולשים אותו בקלטת autoradiography.
    3. מניחים את סרט autoradiography על מערך פפטיד בחדר החשוך. סגור את הקלטת בזהירות ולחשוף אותו ב -80 ° C לזמן הדרוש. לאחר מכן, לפתח את הסרט כדי לנתח את התוצאות. ללכוד את זוג התמונה של פעמים עם expositio שונהn פעמים כדי למנוע הרוויה של מצעי פפטיד מאוד מפוגלים.

4. עיבוד נתונים וניתוח

  1. ניתוח densitometric של עוצמות ספוט
    1. סרוק את הסרט בסורק קונבנציונלי ולנתח את העוצמות במקום על ידי צפיפות. האם ImageJ זה באמצעות (שהוא חופשית) או תכנית מסחרית.
      הערה: אנו משתמשים בתוכנות Phoretix למשימה זו.
  2. נורמליזציה ומיצוע של תוצאות מממברנות שונות
    1. לנהל ניסויי מתילציה מערך פפטיד לפחות בשלושה עותקים. לנרמל את העוצמות שנסרקו לכל ניסוי על ידי חיסור רקע והגדרת הפעילות במצע התייחסות כ1.0. ממוצע הנתונים למקומות מסוימים ולדווח עליהם כערכים ממוצעים וסטיות תקן.
  3. ניתוח נתונים ותצוגה
    1. העלילה נתונים ב2D באמצעות ערכת גווני אפור או צבע כדי לציין את הפעילות היחסית. האם זה wiה Excel או SigmaPlot כפי שמוצג כאן. כמו כן, להכין את עלילה של חלוקת סטיות התקן של הניסויים החוזרים ונשנים כדי לנתח את איכות הנתונים.
    2. כדי להשוות ולהציג את הדיוק של זיהוי של כל שאריות בפפטיד מצע כמותית, לחשב את ההעדפה היחסית של PKMT עבור כל חומצת אמינו שאני בעמדת x על ידי D גורם אפליית 16,17:
      X D; i = <j V ≠ i> / V i - 1
      איפה אני v השיעור של מתילציה של גרסת פפטיד ביצוע חומצת אמינו שאני בעמדה x ו- <j v ≠ i> הוא השיעור הממוצע של מתילציה של כל 19 פפטידים ביצוע j חומצת אמינו שונה ≠ i בx העמדה (כוללים רצף סוג בר).
      הערה: גורם האפליה שהוגדר על ידי זה תלויה ברמת הרקע. אם רק אחד שאריות מקובלת בעמדה מסוימת עם רקע של 3%, אפליהגורם של 32.3 מתקבל. לא בחירה במיקום תוצאות בגורם אפליה של 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכי פפטיד שמשו בהצלחה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs ביוכימית, וכמה מצעי היסטון רומן ולא-היסטון של PKMT זוהו על ידי גישה זו 5,16-19. הגדרת ספקטרום המצע הנכון של PKMT (או כל אנזים) היא צעד חיוני לקראת הבנה של המנגנון המולקולרי שלו ותפקודים תאיים.

כדוגמא ליישום שיטת מתילציה מערך SPOT פפטיד, אנו מתארים את תוצאות הניתוח הספציפי של NSD1 PKMT 19. קודם לעבודה שלנו, אנזים זה תואר לכמה מצעי methylate כוללים H3 היסטון בK36 וH4 היסטון בK20 אלא גם p65 גורם שעתוק משפחת NF-kB בK218 וK221. איור. 4A מראה דוגמא של תגובת מתילציה של מערך פפטיד עם NSD1. לשם כך ניסויים, מערך פפטיד גדול המבוסס על H3 (31-49) רצף היה מסונתז המכיל את כל אפשרישינויי חומצת אמינו בודדים של הרצף המקורי כדי לבדוק את המשמעות של כל חומצת אמינו לאינטראקציה NSD1 ומתילציה. בסך הכל 380 פפטידים היו מסונתזים (20 חומצות אמינו אפשריות x 18 שאריות בתוספת רצף H3 מקורי אחד בכל שורה). הציר האופקי מייצג את הרצף של הפפטיד ובכיוון האנכי חומצת אמינו אשר שינתה בפפטיד המקביל מצויינים. לדוגמא, הנקודה בקו 17 בעמודה 4 מכילה תראונין במקום שלישי במקום גליצין שנמצא ברצף הפראי הסוג (איור. 4 א). באופן כזה, מוטציות נקודה נוצרות על מנת לבחון את ההעדפה של NSD1 עבור כל חומצת אמינו ילידים בכל עמדה במצע פפטיד. מתילציה עם NSD1 הראתה שזה דווקא פועל על H3K36 ויש לה העדפות משני צדי ליזין היעד 34-38.

איור 4 מייצג את האיחוד של מתילציה מערך שלושה פפטידניסויים עם NSD1. המידע כמותי נרכש ממערכי פפטיד הבודדים והתוצאות היו מנורמלות וממוצע כפי שתוארו לעיל. סטיות התקן של ממוצעי פרט מראות כי הנתונים הם מאוד לשחזור. בסך הכל כ -85% מפפטידים תערוכות סטיות תקן קטנים יותר מ -20% ויותר מ- 97% ממצעי פפטיד הפגינו סטיות תקן קטנים יותר מ -30% (איור. 4C). בנוסף, אנחנו גם מחושבים גורם האפליה כדי לקבוע את תרומתו של כל חומצת אמינו בעמדות שנבדקו בדיוק. כפי שתואר זה מספק תיאור כמותי של פפטיד הקריא והעדפה של חומצות אמינו במיקום הספציפי (איור. 5A). הנתונים שלנו מראים כי NSD1 מעדיף שאריות ריחניות בעמדת -2 (בהתחשב K36 כעמדה 0) (F> Y> G); שאריות הידרופובי ב-1 (אני> L> V); שאריות בסיסיות ב+1 (R> QKNM), שבו הוא לא יכול לסבול את השאריות הידרופובי או ריחניות; וhydשאריות rophobic ב+2 (V> P IA>). באתרים אחרים (כמו -3, +3, או +6), NSD1 מעדיף כמה חומצות אמינו, אבל אין קריאה ספציפית שאריות חזקות זוהתה.

בהתבסס על פרופיל זה, ניתן למצוא מצעי פפטיד רומן פוטנציאליים על ידי חיפושי מסד נתונים כמו שימוש Scansite 20 (איור. 5 ב). פפטידים אלה נערכו על מערך SPOT כוללים בקרות חיוביות ושליליות וטופחו עם NSD1 ושכותרתו רדיואקטיבית AdoMet לזהות תת-הקבוצה שלהם, כי הם מפוגלים ברמת פפטיד (איור. 5 ג). כמו בצעו קופצים, ניתן להכין מערכי פפטיד הכוללים גרסאות פפטיד, שבו ליזין היעד הוא הוחלף על ידי אלאנין, כדי לאשר מתילציה המתרחשת באתר ניבא. לאחר מכן, ניתן לייצר חלבוני היעד או תחומי משנה שלהם מכילים ליזין היעד recombinantly ומתילציה בדקה גם ברמת חלבון. לבסוף, בהתאם לתוצאות, מעקב ניסויים אני יכול nvestigate אם מתילציה מתרחשת גם בתאים ושיש לו תפקיד ביולוגי.

איור 1
איור 1:. תכנית של סינתזת פפטיד בשיטת SPOT על קרום תאית אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. דוגמא למערך פפטיד המוכתם בכחול bromophenol כדי לאשר את הסינתזה של פפטידים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

p_upload / 52,203 / 52203fig3highres.jpg "/>
איור 3: תכנית של ניסוי מתילציה מערך פפטיד; מערכי פפטיד היו מפוגלים על ידי דגירה עם PKMT וכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. לאחר מכן הועברה לרדיואקטיביות כל מקום הוא זוהה על ידי autoradiography. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
תוצאות שהושגו עם דוגמא PKMT NSD1 דוגמא למערך פפטיד ספציפי מצע לNSD1 באמצעות H3 () רצף 31-49 כתבנית): איור 4.. הציר האופקי מייצג את רצף H3 והציר האנכי מייצג את חומצות אמינו על ידי שהשורה המתאימה עוברת מוטציה. השורה הראשונה מכילה פפטידים עםרצף מקורי. B) איחוד תוצאות מניסויי 3 מתילציה מערך פפטיד עצמאיים עם NSD1, נתונים היו בממוצע תוצאות מכל שלושת הניסויים לאחר הפצת נורמליזציה. C) של סטיות תקן עבור נתונים מתילציה הממוצע מוצגים בB. הפנל לשכפל מet Kudithipudi אל. (2014) עם שינויים מסוימים 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. גילוי של מצעי PKMT רומן) גורמי אפליה של NSD1 להכרה של שאריות חומצת אמינו בעמדות ליד ליזין היעד (K36 שמוצגים כאן בניסוי). הנתונים מראים כי NSD1 מעדיף שאריות ריחניות בעמ -2 osition (בהתחשב K36 כעמדה 0). שאריות הידרופובי מוכרות ב-1 ו+2 עמדות, אם כי בהבדלים בולטים בפרטים. באתר +1 שאריות ואורגניות חיבור בסיסיים עדיפות. באתרים אחרים כמה העדפות חלשות, אבל אין קריאה ספציפית שאריות חזקות זוהו. B) צילום מסך של חיפוש דוגמא בScansite, באמצעות הפרופיל הספציפי שנקבע לNSD1. מערך פפטיד SPOT C) המכיל כמה רומן חזה NSD1 מצעים יחד עם חיובי (H3K36 ) ובקרות שליליות (H3K36A). חלק ממטרות הרומן התבססו היו מפוגל מאוד (חלקם מבואר), ובמקרים אחרים לא ניתן היו לאמת את התחזיות. לוח A ו- C הוא לשחזר מKudithipudi et al. (2014) עם שינויים מסוימים 19. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

= Cellspacing "0" ing = "0">
בסיס 1 M Oxyma טהור בתמ"א -> 2,13 g Oxyma טהור ב 15 מיליליטר NMP
Activator 2.4 מיליליטר N, -Diisopropylcarbodiimide 'N ב 15 מיליליטר NMP
תערובת מכסת 20% אנהידריד אצטית בDMF -> 6 מיליליטר אנהידריד אצטית ב -30 מיליליטר DMF
Fmoc Deprotection Piperidine 20% בDMF -> 200 מיליליטר ב1,000 מיליליטר DMF
Sidechain Deprotection DDH Triisopropylsilane + 600 μl 900 μl 2 O ב -30 מיליליטר TFA
מכתים 0.02% bromophenol כחול בDMF

טבלת 1: תערובות כימיות וההרכב שלהם בשימוש בפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סינתזת SPOT כפי שמתואר כאן היא שיטה חזקה כדי למפות אתרי אינטראקציה בין חלבונים ולחקור את הכרת המצע של אנזימי פפטיד שינוי. עם זאת, סינתזת SPOT עדיין יש חסרונות מסוימים, משום שלמרות שפפטידים המתאחדים בשיטת SPOT מדווחים יש יותר מ- 90% טוהר 21 זה קשה כדי לאשר בכל מקרה. לכן, תוצאות צריכה להיות מיוצרות בשיטות אחרות לתחומים חלבון למשל באמצעות או עם פפטידים מטוהרים מסונתזים על ידי שיטות סטנדרטית. בנוסף, החסרון העיקרי האחר של מערכי SPOT הוא שרוב הזמן הם לא ניתן לעשות שימוש חוזר לבצע כמה מבחני עם מערך אחד.

כדי להגביר את היעילות של סינתזה עם חומצות אמינו של יציבות נמוכה, כמו ארגינין המוגן, חשוב להפוך אותם טריים לכל 5 מחזורים. בתגובות אנזימטיות או לימודי חלבון מחייב אותו הוא נצפה לעתים קרובות שהפריפריה של מקום פפטיד יש מומחדש עוצמת אות יותר מאשר במרכז ("אפקט נקודת טבעת"). אפקט זה יכול להיות בגלל הצפיפות הגבוהה של פפטידים בחלק מהמקום המרכזי ואז זה יכול להיפתר על ידי downscaling סינתזת פפטיד 22. לירי צרות נוסף של פפטיד סינתזה מדריך המכונה ושירות חברה יש להתייעץ. אם מתילציה לא נצפתה, פפטידים בקרה חיובית (כלומר פפטידים ידועים להיות מפוגל על ידי האנזים תחת חקירה) יש להוסיף לממברנה.

חלופי למערכי SPOT, מערכי מיקרו פפטיד צפיפות הגבוה 23 זמינים, אך הם יקרים יותר ודורשים ציוד מיוחד לשימוש. יתר על כן הסכום של הפפטיד למקום קטן יותר, אשר דורש נהלי קריאה רגישים יותר. מערכי חלבון זמינים גם ללמוד פונקציות אלה 24,25, אבל הם קשים יותר להכנה, כי כל חלבון אדם צריך לבוא לידי ביטוי ומטוהר וקיפול חלבונים במערך צריך להישמר. יתרון נוסף של מערכי פפטיד הוא ההקדמה האפשרית של שינויי translational פוסט במהלך הסינתזה ואת הקלות של בדיקות מוטאציות של התפקידים של שאריות חומצת אמינו בודדות.

זה נקודת התחלה חיונית לפרוטוקול זה, יש פפטיד לפחות אחד מזוהה, אשר מפוגל על ​​ידי האנזים תחת חקירה. תנאי מתילציה ומאגרים צריכים להיות מותאמים, כמו גם את הריכוז של methyltransferase. קורסי זמן מופת של מתילציה צריכים להיות נחושים בדעתו למנוע מתילציה של המצע הטוב ביותר, דבר שיגרום לאובדן של טווח דינמי מלאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Gradient Grade HPLC Honeywell 10299901 Flammable
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis Biosolve 4193302 Flammable, Toxic
Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis Roth A122.1 Flammable, Toxic, corrosive
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) Novabiochem 8510860100
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC Fluka 38370 Flammable, Toxic, corrosive
Acetic anhydride Roth CP28.1 Flammable, Toxic, corrosive
Triisopropylsilane 99% Aldrich 233781 Flammable, Toxic
Dichlormethane ≥99.9% Roth P089.1 Carcinogenic
N-Methyl-2-Pyrrolidone Roth 4306.2 Toxic
Derivatized cellulose Membrane Intavis AG Köln 32.1
Trifluoroacetic acid Roth P088.2 Toxic, corrosive
Bromphenolblue AppliChem A3640.0010
Ammonium Hydrogen Carbonate Roth T871.2 Toxic
Sodium Dodecyl Sulfate Pellets Roth CN30.3 Toxic, Flammable
MultiPep Synthesizer Intavis AG Köln n.a.
HyperfilmTM high performance film GE Healthcare 28906837
Phoretix software TotalLab n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
  2. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  3. Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
  4. Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
  5. Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
  6. Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
  7. Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
  8. Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
  9. Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
  10. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
  11. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
  12. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
  13. Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
  14. Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
  15. Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
  16. Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
  17. Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
  18. Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
  19. Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
  20. Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
  21. Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
  22. Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
  23. Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
  24. Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
  25. Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).

Tags

ביוכימיה גיליון 93 מערכי פפטיד סינתזת פפטיד שלב מוצקה סינתזת SPOT methyltransferases יזין החלבון ניתוח פרופיל ספציפי מצע מתילציה ליזין
ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kudithipudi, S., Kusevic, D.,… More

Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays. J. Vis. Exp. (93), e52203, doi:10.3791/52203 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter