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Biology

स्पॉट पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases की विशिष्टता विश्लेषण

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/52203
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Stuttgart University

Abstract

लाइसिन मेथिलिकरण एक उभरती के बाद अनुवाद संशोधन है और यह सेल विकास और कई बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जहां यह कई हिस्टोन और गैर हिस्टोन प्रोटीन पर पहचान की गई है। लगभग 5,000 लाइसिन मेथिलिकरण साइटों प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases की कुछ दर्जनों द्वारा स्थापित कर रहे हैं, जो विभिन्न प्रोटीन, पर पहचान की गई। यह अब केवल एक या दो substrates इन एंजाइमों के कई के लिए पहचान की गई है हालांकि, जब तक प्रत्येक PKMT कई प्रोटीन methylates कि पता चलता है। इस समस्या के दृष्टिकोण के लिए, हम शुरू की है पेप्टाइड सरणी आधारित सब्सट्रेट विशिष्टता PKMTs का विश्लेषण करती है। पेप्टाइड सरणियों विभिन्न दृश्यों के साथ कई substrates के मेथिलिकरण एक सरणी पर परीक्षण किया जा सकता है क्योंकि PKMTs की विशिष्टता को चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। हम एक Intavis स्पॉट सिंथेसाइज़र का उपयोग कर सेल्यूलोज झिल्ली पर पेप्टाइड सरणियों संश्लेषित और विभिन्न PKMTs की विशिष्टता का विश्लेषण किया। इन एंजाइमों के कई के लिए, परिणाम के आधार पर, उपन्यास कीubstrates पहचाना जा सकता है। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड सरणियों को रोजगार से NSD1 के लिए, हम इसे एच 4 की K44 के बजाय सूचना दी H4K20 methylates और इसके अलावा में H1.5K168 पहले से ज्ञात H3K36 पर अत्यधिक पसंदीदा सब्सट्रेट है कि पता चला है। इसलिए, पेप्टाइड सरणियों को biochemically PKMTs चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं।

Introduction

पिछले दो दशकों में, कई रिपोर्टों सेलुलर विकास और कैंसर जैसी कई बीमारियों, लेकिन हाल ही में प्रोटीन लाइसिन मेथिलिकरण एक अन्य महत्वपूर्ण PTM रूप में उभरा है में बाद translational संशोधनों (PTM) के महत्व का प्रदर्शन किया। शुरू में हिस्टोन लाइसिन मेथिलिकरण एक आवश्यक क्रोमेटिन निशान हो पाया था, बाद में काम भी कई गैर हिस्टोन प्रोटीन 1-4 लाइसिन मेथिलिकरण दिखाया। लाइसिन अवशेषों की ε अमीनो समूह के लिए एस-adenosyl एल मेथिओनिन से मिथाइल समूह के अनुक्रमिक हस्तांतरण मानव जीनोम में 60 से अधिक प्रोटीन होता है कि प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases (PKMTs) नामक एंजाइम का एक परिवार द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है। PKMTs शुरू में विशिष्ट लाइसिन अवशेषों methylate लेकिन बाद में रिपोर्टों वे भी गैर हिस्टोन प्रोटीन 5 methylate सकता है कि प्रदर्शन किया है कि हिस्टोन संशोधित एंजाइमों के रूप में खोज रहे थे। अब तक, लगभग 5,000 लाइसिन मेथिलिकरण साइटों के विभिन्न प्रोटीन 6 पर पहचान की गई

पेप्टाइड सरणियों व्यापक रूप से एंटीबॉडी, पेप्टाइड संशोधित एंजाइम और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों (एंटीबॉडी प्रतिजन, रिसेप्टर ligand) 7-9 की मैपिंग के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपकरणों का इस्तेमाल कर रहे हैं। पेप्टाइड्स के कई सैकड़ों सफलता के लिए आवश्यक हैंएच अनुप्रयोगों। अलग अलग तरीकों से उन्हें बहुत अधिक इस्तेमाल किया जाता है राल पर संश्लेषण पेप्टाइड के बीच में, पेप्टाइड संश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन यह throughput में सीमाएं हैं और यह अपेक्षाकृत महंगी है। इन मुद्दों फ्रैंक और उनके सहयोगियों ने 10 से स्पॉट संश्लेषण विधि की शुरुआत के साथ सुलझाया गया। स्पॉट संश्लेषण विधि समानांतर में कई सौ पेप्टाइड्स के संश्लेषण की अनुमति देता है और औसत पर यह राल संश्लेषण की तुलना में सस्ती है। सेलूलोज झिल्ली पर संश्लेषित पेप्टाइड्स झिल्ली से cleaved और समाधान assays में लिए मुफ्त पेप्टाइड्स के रूप में इस्तेमाल किया है या पेप्टाइड प्रोटीन 10-13 तैयार करने के लिए किया जा सकता है विभिन्न अनुप्रयोगों या पेप्टाइड्स के लिए या तो सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है।

स्पॉट संश्लेषण एक ठोस समर्थन के रूप में एक सेलूलोज़ झिल्ली का उपयोग करता है और मानक Fmoc-रसायन शास्त्र 10-13 कार्यरत हैं, जो ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण, का एक संस्करण है। इसलिए, पेप्टाइड श्रृंखला के संश्लेषण सी टर्मिनल अंत में शुरू होता है और दिशा आयराइबोसोम में जैविक संश्लेषण के विपरीत एन टर्मिनल अंत। सेल्यूलोज झिल्ली पहले सक्रिय अमीनो एसिड (छवि। 1) की कुर्की के लिए क्रियाशील कर रहे हैं। स्पॉट विधि एक स्वचालित pipetting प्रणाली का उपयोग कर झिल्ली पर परिभाषित स्पॉट करने के लिए विलायक की एक छोटी बूंद में सक्रिय अमीनो एसिड के अनुक्रमिक वितरण पर आधारित है। तरल पदार्थ की छोटी बूंद इसे बाद में पेप्टाइड संश्लेषण में रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए एक खुला रिएक्टर के रूप में कार्य करता है जो एक परिपत्र गीली जगह, रूपों जहां झरझरा झिल्ली पर तिरस्कृत है। स्थान आकार तिरस्कृत मात्रा और झिल्ली के अवशोषण की क्षमता से निर्धारित होता है, इस तरह के धब्बे के गुणकों सरणियों के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं। संश्लेषण के पैमाने स्थान आकार और झिल्ली की लोडिंग क्षमता के साथ संबद्ध करता है। स्पॉट और सरणियों के घनत्व के बीच की दूरी हाजिर आकार बदलती द्वारा प्रबंधित कर रहे हैं। सेल्यूलोज झिल्ली पेप्टाइड संश्लेषण में ठोस चरण के रूप में कई फायदे हैं, यह रासायनिक करने के लिए, सस्ती सहिष्णु हैजलीय समाधान में स्थिर और संभालना आसान पेप्टाइड संश्लेषण में इस्तेमाल ए एल एस। इसके अलावा, अपने हाइड्रोफिलिक प्रकृति कई जैविक परख प्रणालियों के लिए यह उपयुक्त बनाता है। स्पॉट संश्लेषण मैन्युअल रूप से बाहर किया जाता है या पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या के आधार पर (पेप्टाइड्स के 1000s के लिए) स्वचालित किया जा सकता है। Intavis (कोलन, जर्मनी) से एक पूरी तरह से स्वचालित स्पॉट सिंथेसाइज़र हमारे अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है। यह अलग अलग मात्रा में और अलग अलग लंबाई की पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए परमिट। भी कदम वार संश्लेषण 14,15 द्वारा तैयार किया जा सकता है रैखिक पेप्टाइड्स नियमित रूप से अप करने के लिए 42 एमिनो एसिड के अलावा पेप्टाइड्स में, 15 से 20 एमिनो एसिड की लंबाई के साथ संश्लेषित कर रहे हैं। हालांकि, अमीनो एसिड की संख्या बढ़ती जा रही पेप्टाइड्स की गुणवत्ता को प्रभावित करता है, जो समग्र युग्मन पैदावार में कमी की ओर जाता है। क्योंकि मौके प्रति पेप्टाइड्स की कम मात्रा के कारण, उत्पादों अक्सर शुद्ध करने के लिए मुश्किल हो जाता है और व्यक्ति पेप्टाइड्स की गुणवत्ता आसानी से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता। इसलिए, परिणाम स्पॉट pept से प्राप्तआईडीई सरणियों शुद्ध और पेप्टाइड संश्लेषण में या वांछित पेप्टाइड दृश्यों से युक्त प्रोटीन synthesizing द्वारा मानकों के अनुसार विश्लेषण किया जा सकता है, जो बड़े पैमाने में मानक तरीकों, द्वारा संश्लेषित पेप्टाइड्स के साथ या तो पुष्टि की जानी चाहिए। फिर भी, हम अत्यधिक विश्वसनीय होना मौके संश्लेषण पाया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए आम तौर पर यह परिणाम है। स्पॉट संश्लेषण पेप्टाइड्स से पहले और इसके अलावा अंतिम पक्ष श्रृंखला संरक्षण समूह की दरार और, के बाद संशोधित करने की अनुमति देता है, अमीनो एसिड, भी संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संशोधित अमीनो एसिड proteinogenic तक ही सीमित नहीं है, यह भी के समावेश की अनुमति देता है , phosphorylated methylated या acetylated अमीनो एसिड 11।

स्पॉट विधि द्वारा संश्लेषित Immobilized पेप्टाइड पुस्तकालयों सीधे कई जैविक और जैव रासायनिक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम PKMTs की सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच के लिए 300-400 पेप्टाइड्स शामिल पेप्टाइड सरणियों कार्यरत हैं। एंजाइमी modifi के लिएकेशन, पेप्टाइड सरणियों संबंधित PKMT साथ incubated रहे हैं और एक उपयुक्त बफर में [methyl- 3 एच] -AdoMet लेबल। संबंधित सब्सट्रेट के मिथाइलेशन autoradiography के माध्यम से पेप्टाइड सब्सट्रेट करने के लिए AdoMet से radioactively लेबल वाले मिथाइल समूह के enzymatic हस्तांतरण (छवि। 3) का पालन करते हुए विश्लेषण किया है। इस प्रक्रिया के द्वारा, पेप्टाइड सरणियों एक ही समय में अलग पेप्टाइड substrates के मिथाइलेशन के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। इस विधि से एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि सभी पेप्टाइड्स मेथिलिकरण कैनेटीक्स के रैखिक चरण के दौरान, प्रत्येक पेप्टाइड के रिश्तेदार मेथिलिकरण हदबंदी लगातार (कश्मीर बिल्ली / कश्मीर से विभाजित उत्प्रेरक की दर लगातार करने के लिए आनुपातिक ऐसी है, कि प्रतियोगिता में methylated रहे हैं संबंधित पेप्टाइड सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की डी)। इसलिए, प्रत्येक स्थान में शामिल रेडियोधर्मिता की राशि सीधे विशेष पेप्टाइड की ओर enzymatic गतिविधि के साथ जोड़ा जाता है। का प्रयोगएक पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रयोग के परिणाम, PKMT की विशिष्टता प्रोफाइल predicated किया जा सकता है इस उपन्यास substrates पर परिभाषित किया है और आधार पर किया जा सकता है। पेप्टाइड सरणियों पेप्टाइड स्तर पर उपन्यास substrates के मिथाइलेशन के तेजी से और लागत प्रभावी सत्यापन अनुमति देते हैं। इस के लिए, सरणियों लक्ष्य स्थलों पर बजाय लिस के एक आला युक्त संशोधित पेप्टाइड्स के साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड्स के साथ मिलकर भविष्यवाणी उपन्यास substrates के होते हैं कि तैयार कर रहे हैं। अंत में, उपन्यास substrates के एक साथ म्यूटेंट के साथ प्रोटीन, जिसमें लक्ष्य लिस अला को बदल दिया है और मेथिलिकरण प्रोटीन के स्तर पर इस बात की पुष्टि की जा सकती है के रूप में तैयार किया जा सकता है। परिणामों पर निर्भर करता है, यह तो नव वर्णित प्रोटीन substrates के मिथाइलेशन के संभावित भूमिकाओं को संबोधित जैविक अध्ययन के द्वारा पीछा किया जाता है।

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Protocol

पेप्टाइड सरणियों के 1. तैयारी

  1. पेप्टाइड दृश्यों की प्रोग्रामिंग
    1. MultiPep निशानदेही सॉफ्टवेयर का उपयोग संश्लेषण के लिए पेप्टाइड दृश्यों डिजाइन। एकल अक्षर के कोड में पेप्टाइड दृश्यों दर्ज करें।
      पेप्टाइड 1: TARKSTGGKA
    2. एक परिभाषित सब्सट्रेट की मान्यता के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एमिनो एसिड स्क्रीन करने के लिए एक विशेष आदेश (.replace, ए) के साथ एलनाइन या arginine टहलने के पुस्तकालयों उत्पन्न करता है। निम्न उदाहरण में उदाहरण के लिए पहली पंक्ति जंगली प्रकार के अनुक्रम है और दूसरी लाइन से एक पेप्टाइड में प्रत्येक अमीनो एसिड alanine क्रमिक रूप से करने के लिए बदल दिया है।
      , एक की जगह
      TARKSTG
      एक -ARKSTG
      टी ए -RKSTG
      टा एक -KSTG
      निशाना एक -STG
      TARK- एक -TG
      TARKS- ए जी
      TARKST- एक
    3. इसी तरह की आज्ञाओं (.replace उपयोग आर।सब स्वाभाविक रूप से उपलब्ध अमीनो एसिड के अवशेष (अंततः सिस्टीन, मेथिओनिन और tryptophan omitting के साथ 1.1.2 में वर्णित के रूप में इन अवशेषों ऑक्सीकरण होने का खतरा है और कभी कभी कम संश्लेषण उपज हैं क्योंकि), एन आदि) की जगह आम सहमति का निर्धारण करने के लिए एक पेप्टाइड सरणी synthesize करने के लिए एक एंजाइम के लिए सब्सट्रेट अनुक्रम आकृति।
      नोट: चित्रा -4 ए में दिखाया गया है, क्षैतिज अक्ष दिया पेप्टाइड अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है और ऊर्ध्वाधर अक्ष आदेश के लिए चुने गए हैं कि अमीनो एसिड का प्रतिनिधित्व करता है। 1.1.2 में दिखाया गया अनुक्रम के लिए इसी प्रकार, ऊर्ध्वाधर अक्ष पर एक एक आला क्रमिक रूप में छवि में पहली पंक्ति में दिया अनुक्रम की प्रत्येक स्थिति बदल देता है कि इसका मतलब है। -4 ए। इसी प्रकार arginine क्रमिक रूप से और इसलिए अन्य अमीनो एसिड के साथ पर दूसरी पंक्ति में प्रत्येक एमिनो एसिड की जगह। पूरा पेप्टाइड सरणी पुस्तकालयों को व्यवस्थित वें से प्रत्येक के साथ प्रदान की पेप्टाइड सब्सट्रेट अनुक्रम में प्रत्येक अवशेषों की जगह से संश्लेषित कर रहे हैंई अन्य प्राकृतिक रूप से उपलब्ध अमीनो एसिड के अवशेष, इस दिया अनुक्रम में से प्रत्येक की स्थिति में प्रत्येक अवशेषों के प्रभाव को समझने में मदद करता है।
    4. वैकल्पिक रूप से, ज्ञात या भविष्यवाणी पेप्टाइड substrates के मिथाइलेशन आसानी से सकारात्मक और नकारात्मक मेथिलिकरण नियंत्रण के साथ एक साथ PKMT का लक्ष्य पेप्टाइड्स के साथ (methylated करने के लिए जाना जाता है या methylated होने के लिए नहीं जाना जाता है यानी पेप्टाइड्स) पेप्टाइड पुस्तकालयों synthesizing सत्यापित किया जा सकता है। मैनुअल प्रोग्रामिंग से नीचे दिखाया गया के रूप में लक्ष्य लाइसिन की मेथिलिकरण पुष्टि करने के लिए alanine के लिए ख्यात लक्ष्य लाइसिन आदान प्रदान से पेप्टाइड्स synthesize।
      जंगली प्रकार पेप्टाइड: STGG कश्मीर PRQFL
      उत्परिवर्ती पेप्टाइड: STGG एक PRQFL
      नोट: इस सॉफ्टवेयर को भी एक बातचीत के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एमिनो एसिड नक्शा करने के अनुक्रम का एक वांछित फ्रेम बदलाव के साथ मिलान मानचित्रण जैसे विभिन्न पुस्तकालयों बनाने के लिए निहित लिपियों है।
  2. झिल्ली की तैयारी, अमीनो एसिड एकडी अभिकर्मकों
    1. 10 मिनट के लिए DMF (एन, एन -Dimethylformamide) में हाजिर झिल्ली प्री-फूल और फिर हवा के बुलबुले या झुर्रियों के बिना स्पॉट सिंथेसाइज़र फ्रेम पर गीला झिल्ली जगह है।
    2. झिल्ली 100% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं। संश्लेषण कार्यक्रम शुरू करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए पूरी तरह से झिल्ली सूखी।
    3. समानांतर में, हौसले एन एम पी में उन्हें भंग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Fmoc-संरक्षित एमिनो एसिड की 0.5 एम काम कर रहे सांद्रता तैयार है और तालिका 1 में वर्णित के रूप में भी उत्प्रेरक और आधार तैयार करते हैं।
    4. स्पॉट सिंथेसाइज़र के सब बेकार समाधान कंटेनर खाली कर दिया गया है कि सुनिश्चित करें और DMF, इथेनॉल और piperidine साथ विलायक जलाशयों फिर से भरना।
      नोट: अब मशीन संश्लेषण के लिए तैयार है।
  3. सबसे पहले एमिनो एसिड के खोलना
    1. विज्ञापन से आने वाली एमिनो एसिड की carboxy समूह को सक्रिय करने, झिल्ली पर मुक्त अमीनो समूह के साथ एमाइड बांड उत्पन्न करने के लिएडिंग उत्प्रेरक (एन, एन '-Diisopropylcarbodiimide) और एमिनो एसिड व्युत्पन्न के लिए आधार समाधान (इथाइल hydroxyimino cyanoacetate)।
    2. प्रोग्रामेबल रोबोट का उपयोग एमिनो खूंटी functionalized झिल्ली पर सक्रिय अमीनो एसिड के वांछित संस्करणों हाजिर।
      नोट: इस प्रकार, एमिनो एसिड की सी टर्मिनस झिल्ली के अमीनो समूह के लिए युग्मित है।
    3. पहले सक्रिय अमीनो एसिड के बेहतर युग्मन सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में तीन बार दोहराएँ। Uncoupled अमीनो एसिड को दूर करने के DMF से धो लें तो 20 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं और।
  4. गैर-हाजिर क्षेत्रों पर मुफ्त रिक्त स्थान के अवरुद्ध
    नोट: झिल्ली के अमीनो समूह के लिए सभी पेप्टाइड्स के पहले सी टर्मिनल अमीनो एसिड की युग्मन के बाद, धब्बे और भी मौके क्षेत्रों के भीतर अमीनो समूहों में से कुछ के बीच एमिनो समूहों एमिनो एसिड के साथ बांड फार्म नहीं है।
    1. कैपिंग समाधान के साथ incubating द्वारा इन मुक्त एमिनो समूहों ब्लॉक (DMF में 20% एसिटिक एनहाइड्राइड)5 मिनट के लिए।
      नोट: यह झिल्ली के बजाय बढ़ रही पेप्टाइड श्रृंखला के साथ आगे चक्रों में अमीनो एसिड के युग्मन से बचा जाता है।
  5. Fmoc समूह का हटाया
    1. अवरुद्ध करने के बाद, DMF 4 बार के साथ झिल्ली धो लें और फिर Fmoc संरक्षण समूह को दूर करने के लिए 20 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine साथ सेते हैं।
      नोट: इस कदम एमिनो की रक्षा Fmoc समूहों को हटाने के लिए होता है और यह deprotection कहा जाता है।
    2. बाद में, इथेनॉल के साथ दो बार DMF के साथ और दो बार झिल्ली धोने और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
      नोट: अब झिल्ली अगले अमीनो एसिड के युग्मन के लिए तैयार है।
  6. चेन बढ़ाव
    नोट: प्रत्येक अमीनो एसिड के अलावा एक चक्र कहा जाता है। इसके अलावा पहले एमिनो एसिड की युग्मन से, चक्र युग्मित अमीनो एसिड की Fmoc समूह की deprotection के साथ शुरू होता है और यह बढ़ रही सरगर्मी के अमीनो समूह के लिए एक आने वाली एमिनो एसिड की सक्रिय carboxyl समूह के युग्मन द्वारा पीछा किया जाता हैज्वार की चेन।
    1. वांछित पेप्टाइड लंबाई हासिल की है, जब तक दोहराएँ 1.3 और 1.5 कदम।
  7. धुंधला हो जाना
    नोट: अंतिम चक्र के बाद, पेप्टाइड सरणियों पेप्टाइड्स के सफल संश्लेषण की पुष्टि करने के bromophenol नीले रंग के साथ दाग रहे हैं। Bromophenol नीले पेप्टाइड्स से मुक्त अमीनो समूहों के साथ बांधता है। पेप्टाइड स्पॉट धुंधला के बाद हल्के नीले रंग दिखा, लेकिन स्पॉट की तीव्रता पेप्टाइड क्रम पर निर्भर करता है। यह धुंधला पेप्टाइड्स दाग नहीं है क्योंकि piperidine bromophenol नीले रंग की उपस्थिति में, piperidine की पूरी तरह हटाने की पुष्टि की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह भी आगे उपयोग के लिए पेप्टाइड सरणियों चिह्नित करने के लिए मदद करता है।
    1. पिछले संश्लेषण चक्र में Fmoc समूह deprotection के बाद, DMF और 100% इथेनॉल के साथ झिल्ली धो लें। यह पूरी तरह से नीला पड़ जाता है तो जब तक, 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए bromophenol नीला (DMF में 0.02% bromophenol नीला) के साथ झिल्ली का इलाज।
    2. बाद में, DMF और ETH साथ झिल्ली धोनेanol 10 मिनट के लिए सुखाने के द्वारा पीछा किया। अब सिंथेसाइज़र से झिल्ली बाहर ले और मैन्युअल पक्ष श्रृंखला deprotection (धारा 1.8) प्रदर्शन करते हैं। यदि आवश्यक हो, पेप्टाइड संश्लेषण (छवि। 2) के परिणामों के दस्तावेज़ के लिए झिल्ली तस्वीर।
  8. पक्ष श्रृंखला Deprotection
    1. पक्ष श्रृंखला संरक्षण समूहों और मेहतर अभिकर्मकों (2.5% पानी और 2.5% triisopropylsilane) से अमीनो एसिड के पक्ष श्रृंखला की रक्षा के लिए फोड़ना करने के लिए 95% trifluoroacetic एसिड (TFA) से मिलकर पक्ष श्रृंखला deprotection मिश्रण के 20 से 25 मिलीलीटर के साथ झिल्ली को समझो इस कदम के दौरान संशोधन। यह पूरी तरह से एक कसकर बंद रासायनिक प्रतिरोधी बॉक्स में झिल्ली को शामिल किया गया है कि यह सुनिश्चित करने और धीरे से मिलाते हुए, जबकि 1 से 2 घंटे के लिए यह सेते deprotection मिश्रण की पर्याप्त मात्रा लें।
    2. 2 मिनट प्रत्येक के लिए डीसीएम (dichloromethane) के 20-25 मिलीलीटर के साथ झिल्ली छह बार धोएं और अंत में दो बार 100% इथेनॉल के साथ और रात भर एक desiccator में सूखा।
      नोट: अबझिल्ली प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पेप्टाइड सरणी संश्लेषण की एक योजना चित्रा 1 में प्रदान की जाती है।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन

  1. जीएसटी Fusions रूप PKMTs के प्रोटीन की अभिव्यक्ति
    1. मानक तकनीक का उपयोग करना, जीएसटी संलयन प्रोटीन के रूप में इसे व्यक्त करने के लिए पूरी लंबाई PKMT या (pGEX-6p2) की तरह एक जीवाणु अभिव्यक्ति वेक्टर में इसके उत्प्रेरक डोमेन एन्कोडिंग जीन क्लोन।
    2. BL21 या BL21 कोडोन प्लस ई में डालने वांछित PKMT साथ वेक्टर स्थानांतरण गर्मी झटका विधि या किसी अन्य विधि द्वारा कोलाई कोशिकाओं।
    3. अभिव्यक्ति के दिन Luria-Bertani (पौंड) मीडिया के 30 मिलीलीटर के साथ एक पूर्व संस्कृति को तैयार है और निरंतर झटकों के साथ 7 से 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. अगला, लेग मीडिया के एक एल युक्त 2 एल बड़ा चकित बोतल में पूर्व संस्कृति के 10 एमएल हस्तांतरण और 37 पर सेते संस्कृति तक निरंतर झटकों के साथ इनक्यूबेटर में डिग्री सेल्सियस600 एनएम पर एक परिभाषित ऑप्टिकल घनत्व तों।
      नोट: इस प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हम नियमित रूप के बारे में 0.8 के एक आयुध डिपो 600nm पर प्रेरित। प्रेरण तापमान व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है, कुछ प्रोटीन 22 में अच्छी अभिव्यक्ति दिखाने डिग्री सेल्सियस और उच्च तापमान पर कुछ।
    5. तो isopropyl-बीटा-डी-thiogalactopyranoside की एक मिमी के साथ प्रेरित, 15 मिनट के लिए प्रेरण तापमान कोशिकाओं पारी और संस्कृति प्रेरण के तापमान पर 10-12 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    6. इसके बाद 15 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल और अंत में आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर STE बफर (10 मिमी Tris पीएच 8.0, 100 मिमी NaCl और 0.1 मिमी EDTA) और दुकान के 30 मिलीलीटर के साथ गोली धोने।
  2. प्रोटीन शुद्धि
    1. सेल गोली पिघलना और sonication बफर (50 मिमी Tris पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी और 5% ग्लिसरॉल) के 30 मिलीलीटर में फिर से निलंबित और sonication द्वारा बाधित।
      नोट: यह बफर एनeeds अंततः प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है।
    2. 1 घंटे के लिए 22,000 XG पर सेल lysate अपकेंद्रित्र और, बाद में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा और glutathione Sepharose 4B राल के 600 μl युक्त एक स्तंभ के माध्यम से गुजरती हैं।
    3. 50 sonication के बफर के मिलीलीटर और उच्च नमक बफर (7.5 50 मिमी Tris पीएच, 500 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी और 5% ग्लिसरॉल) unspecifically बाध्य प्रोटीन को हटाने के लिए की 100 मिलीलीटर के साथ अगले के साथ स्तंभ धो लें। 40 मिमी glutathione युक्त उच्च नमक बफर के 5 एमएल के साथ ही प्रोटीन elute।
    4. कम ग्लिसरॉल (20 मिमी Tris 7.4 पीएच, 100 मिमी KCl, 0.5 मिमी डीटीटी और 10% ग्लिसरॉल) 7.4 पीएच 2 घंटे के लिए और बाद में 20 मिमी Tris में, 100 मिमी KCl, 0.5 मिमी के साथ डायलिसिस बफर के 2 एल में eluted प्रोटीन dialyze डीटीटी और 70% ग्लिसरॉल 8 घंटे के लिए या रात। सभी शुद्धि बफ़र्स 4 डिग्री सेल्सियस पर कर रहे हैं सुनिश्चित करें और प्रोटीन विकृतीकरण से बचने के लिए ठंडे कमरे में प्रोटीन शुद्धि प्रदर्शन करते हैं।

3. पेप्टाइड ऐरे मेथिलिकरण

  1. प्री-incuपेप्टाइड सरणियों के bation
    1. एंजाइम और महंगी radioactively में लेबल AdoMet की बर्बादी से बचने के लिए उपयुक्त आकार के एक बॉक्स में या एक प्लास्टिक की थैली में या तो पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रदर्शन करते हैं। 10 मिनट के लिए एंजाइम के बिना संबंधित मेथिलिकरण बफर युक्त मोहरबंद प्लास्टिक की थैली में पेप्टाइड सरणी झिल्ली और लेबल [मिथाइल-3H] -AdoMet पूर्व सेते हैं। उदाहरण के लिए एक पूर्ण विशिष्टता प्रोफाइल पेप्टाइड सरणी के लिए मेथिलिकरण बफर के 8 मिलीलीटर उपयोग के लिए बफर की मात्रा, सरणी के आकार पर निर्भर करता है। प्रत्येक एंजाइम के लिए राशि और AdoMet की एकाग्रता का अनुकूलन।
  2. पेप्टाइड सरणियों का मेथिलिकरण
    1. पूर्व ऊष्मायन बफर त्यागें और संबंधित PKMT युक्त मेथिलिकरण बफर के 8 मिलीलीटर में झिल्ली सेते हैं और लेबल [मिथाइल-3H] -AdoMet 1 घंटा 2 करने के लिए।
      नोट: एक मेथिलिकरण प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक एंजाइम की राशि विशिष्ट PKMT की गतिविधि पर निर्भर करता है, हम अपने स्क्रीनिंग प्रयोगों 50 एनएम एंजाइम फिन के साथ आम तौर पर आरंभअल एकाग्रता।
  3. पेप्टाइड सारणियों की धुलाई
    1. बाद में एक रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में मेथिलिकरण बफर त्यागें और बाध्य प्रोटीन को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 100 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट और 1% एसडीएस युक्त बफर के 20 मिलीलीटर के साथ 5 बार के लिए पेप्टाइड सरणियों धो लें। एक रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में कपड़े धोने बफर त्यागें।
  4. रेडियोधर्मी सिग्नल की जांच
    1. Washes के बाद बढ़ाना समाधान (NAMP100V) के 10 एमएल में 5 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं।
    2. फिर, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में बढ़ाना समाधान त्यागें एक प्लास्टिक की थैली में पेप्टाइड सरणी मुहर और एक autoradiography कैसेट में डाल दिया।
    3. अंधेरे कमरे में पेप्टाइड सरणी पर autoradiography फिल्म रखें। ध्यान से कैसेट को बंद करें और इसे बेनकाब -80 आवश्यक समय के लिए सी °। फिर, परिणामों का विश्लेषण करने के लिए फिल्म का विकास। अलग Expositio के साथ समय की छवि जोड़ी पर कब्जाएन बार जोरदार methylated पेप्टाइड substrates के संतृप्ति से बचने के लिए।

4. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. स्पॉट तीव्रता के Densitometric विश्लेषण
    1. एक परंपरागत स्कैनर में फिल्म स्कैन और densitometry द्वारा मौके तीव्रता का विश्लेषण। (फ्रीवेयर है) इस का उपयोग ImageJ या एक व्यावसायिक कार्यक्रम करते हैं।
      नोट: हम इस कार्य के लिए Phoretix सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  2. सामान्यीकरण और विभिन्न झिल्ली से परिणाम का औसत
    1. तीन प्रतियों में कम से कम पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रयोगों का संचालन। 1.0 के रूप में एक संदर्भ सब्सट्रेट पर पृष्ठभूमि घटाव और गतिविधि की स्थापना करके एक प्रयोग के लिए स्कैन किया तीव्रता मानक के अनुसार। अलग-अलग स्थानों के लिए डेटा औसत और उन के रूप में मतलब मूल्यों और मानक विचलन की रिपोर्ट।
  3. डेटा विश्लेषण और प्रदर्शन
    1. रिश्तेदार गतिविधि इंगित करने के लिए एक स्केल या रंग योजना का उपयोग कर 2 डी में डेटा प्लॉट। इस वाई करोवें एक्सेल या SigmaPlot यहाँ दिखाया गया है। इसके अलावा, डेटा की गुणवत्ता का विश्लेषण करने के लिए दोहराया प्रयोगों के मानक विचलन के वितरण के एक भूखंड तैयार करते हैं।
    2. तुलना और मात्रात्मक सब्सट्रेट पेप्टाइड में प्रत्येक अवशेषों की मान्यता की सटीकता को प्रदर्शित करने के लिए, एक भेदभाव कारक डी 16,17 से स्थिति एक्स पर प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए मैं PKMT के रिश्तेदार वरीयता गणना:
      डी एक्स, मैं = <वी जे ≠ मैं> / वी मैं - 1
      वी मैं स्थिति एक्स और कम से अमीनो एसिड मैं ले जाने पेप्टाइड संस्करण का मेथिलिकरण की दर है जहां <वी जे ≠ मैं> सहित स्थिति एक्स पर एक अलग अमीनो एसिड जम्मू ≠ मैं ले जाने के लिए सभी 19 पेप्टाइड्स के मेथिलिकरण की औसत दर (है जंगली प्रकार के अनुक्रम)।
      नोट: इस से परिभाषित भेदभाव कारक पृष्ठभूमि स्तर पर निर्भर करता है। केवल एक अवशेषों 3% की पृष्ठभूमि, एक भेदभाव के साथ एक निश्चित स्थान पर स्वीकार किया जाता है तो32.3 के कारक प्राप्त की है। एक स्थिति में कोई वरीयता 0 के एक भेदभाव कारक में यह परिणाम है।

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Representative Results

इस दृष्टिकोण 5,16-19 द्वारा पेप्टाइड सरणियों सफलतापूर्वक biochemically PKMTs की विशिष्टता को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और PKMT के कई उपन्यास हिस्टोन और गैर हिस्टोन substrates के पहचान की गई। एक PKMT (या किसी भी एंजाइम) की सही सब्सट्रेट स्पेक्ट्रम परिभाषित अपनी आणविक तंत्र और सेलुलर कार्यों की समझ की दिशा में एक आवश्यक कदम है।

पेप्टाइड स्पॉट सरणी मेथिलिकरण विधि के आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, हम NSD1 PKMT 19 की विशिष्टता विश्लेषण के परिणामों का वर्णन है। हमारे काम करने के लिए पिछला, इस एंजाइम K36 पर हिस्टोन H3 और हिस्टोन एच 4 K20 में भी है लेकिन K218 और K221। छवि पर एनएफ-केबी परिवार प्रतिलेखन कारक P65 सहित methylate कई substrates के लिए वर्णित किया गया था। -4 ए NSD1 के साथ एक पेप्टाइड सरणी के एक मेथिलिकरण प्रतिक्रिया का एक उदाहरण से पता चलता है। इस प्रयोगों, H3 पर आधारित एक बड़े पेप्टाइड सरणी के लिए (31-49) अनुक्रम कि सभी संभव होता है संश्लेषित किया गया थामूल अनुक्रम का एकल एमिनो एसिड परिवर्तन NSD1 संपर्क और मेथिलिकरण के लिए प्रत्येक अमीनो एसिड के महत्व को परीक्षण करने के लिए। कुल 380 पेप्टाइड्स में संश्लेषित कर रहे थे (20 संभव अमीनो एसिड 18 अवशेषों के साथ साथ प्रत्येक पंक्ति में एक मूल H3 के अनुक्रम x)। क्षैतिज अक्ष पेप्टाइड के अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है और ऊर्ध्वाधर दिशा में इसी पेप्टाइड में बदल दिया है जो एमिनो एसिड संकेत दिया है। उदाहरण के लिए, लाइन 17 स्तंभ 4 में स्थान जंगली प्रकार के अनुक्रम (छवि। -4 ए) में मौजूद है कि बजाय ग्लाइसिन के तीसरे स्थान पर एक threonine शामिल हैं। ऐसे में, बिंदु उत्परिवर्तन पेप्टाइड सब्सट्रेट में प्रत्येक स्थिति में प्रत्येक देशी एमिनो एसिड के लिए NSD1 की वरीयता परीक्षण करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं। NSD1 साथ मेथिलिकरण यह विशेष रूप से H3K36 पर काम करता है और यह 34-38 लक्ष्य लाइसिन के दोनों तरफ पसन्द है कि पता चला है।

4B चित्रा तीन पेप्टाइड सरणी मिथाइलेशन के समेकन का प्रतिनिधित्व करता हैNSD1 के साथ प्रयोग। मात्रात्मक जानकारी व्यक्तिगत पेप्टाइड सरणियों से अधिग्रहण कर लिया था और परिणाम सामान्यीकृत थे और ऊपर वर्णित के रूप में औसत। व्यक्ति औसत का मानक विचलन डेटा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि दिखा। कुल मिलाकर पेप्टाइड्स के चारों ओर 85% से 20% की तुलना में छोटे और पेप्टाइड substrates के अधिक से अधिक 97% एसडीएस (छवि। 4C) एसडीएस छोटे से अधिक 30% का प्रदर्शन दिखाता है। इसके अलावा, हम भी ठीक से परीक्षण पदों पर प्रत्येक अमीनो एसिड के योगदान को निर्धारित करने के लिए भेदभाव कारक गणना की थी। यह प्रदान करता है के रूप में वर्णित पेप्टाइड की मात्रात्मक वर्णन से बाहर पढ़ने के लिए और विशिष्ट स्थिति (छवि। 5A) में एमिनो एसिड की पसंद। हमारे डेटा NSD1 (एफ> वाई> जी) (स्थिति शून्य के रूप में K36 पर) -2 की स्थिति में खुशबूदार अवशेषों पसंद बताते हैं कि; हाइड्रोफोबिक अवशेषों पर -1 (मैं> एल> वी); यह हाइड्रोफोबिक या खुशबूदार अवशेषों को बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं, जहां एक (आर> QKNM), पर बुनियादी अवशेषों; और Hydदो पर rophobic अवशेषों (वी> आइए> पी)। अन्य साइटों पर (जैसे -3, 3, या 6), NSD1 कुछ अमीनो एसिड पसंद है, लेकिन कोई मजबूत अवशेषों विशिष्ट readout का पता चला था।

इस प्रोफाइल के आधार पर संभावित उपन्यास पेप्टाइड substrates के Scansite 20 (छवि। 5 ब) का उपयोग कर की तरह डेटाबेस खोजों से पाया जा सकता है। ये पेप्टाइड्स सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित एक जगह सरणी पर तैयार और NSD1 के साथ incubated और radioactively पेप्टाइड स्तर (छवि। 5C) में methylated रहे हैं कि उनमें से सबसेट की पहचान के लिए AdoMet लेबल थे। अप का पालन के रूप में, पेप्टाइड सरणियों कि मेथिलिकरण भविष्यवाणी स्थल पर जगह लेता पुष्टि करने के लिए लक्ष्य लाइसिन alanine द्वारा बदल दिया है, जिसमें पेप्टाइड वेरिएंट में शामिल हैं, जो तैयार किया जा सकता है। फिर, लक्ष्य प्रोटीन या लक्ष्य लाइसिन युक्त उनमें से उप डोमेन recombinantly का उत्पादन किया जा सकता है और मेथिलिकरण भी प्रोटीन के स्तर पर परीक्षण किया गया। अंत में, परिणाम पर निर्भर करता है, मैं प्रयोगों सकते हैं ऊपर का पालन करें मेथिलिकरण भी जैविक जो भूमिका यह है कोशिकाओं में पाया जाता है और अगर nvestigate।

चित्रा 1
चित्रा 1:। सेल्यूलोज झिल्ली पर हाजिर विधि द्वारा पेप्टाइड संश्लेषण की योजना इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2:। पेप्टाइड्स के संश्लेषण की पुष्टि करने के Bromophenol नीले रंग के साथ दाग एक पेप्टाइड सरणी का उदाहरण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3: पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रयोग की योजना; पेप्टाइड सरणियों PKMT साथ ऊष्मायन द्वारा methylated और एक उपयुक्त बफर में [methyl- 3 एच] -AdoMet लेबल थे। बाद में प्रत्येक स्थान के लिए स्थानांतरित कर रेडियोधर्मिता autoradiography ने पता लगाया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। चित्रा 4: NSD1 PKMT ए) H3 टेम्पलेट के रूप में (31-49) के अनुक्रम का उपयोग कर NSD1 के लिए एक सब्सट्रेट विशिष्टता पेप्टाइड सरणी के उदाहरण के साथ प्राप्त उदाहरण का परिणाम है। क्षैतिज अक्ष H3 के अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है और ऊर्ध्वाधर अक्ष इसी पंक्ति उत्परिवर्तित है जिसके द्वारा एमिनो एसिड का प्रतिनिधित्व करता है। पहली पंक्ति के साथ पेप्टाइड्स होता हैमूल अनुक्रम। बी) NSD1 के साथ 3 स्वतंत्र पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रयोगों से परिणाम का एकीकरण, डेटा Kudithipudi ईटी से Reproduced पैनल बी में दिखाया औसत मेथिलिकरण डेटा के लिए मानक त्रुटियों को सामान्य बनाने के। सी) के वितरण के बाद सभी तीन प्रयोगों से परिणाम औसतन थे अल। (2014) में कुछ संशोधनों के 19 के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। उपन्यास PKMT substrates के डिस्कवरी ए) अगले लक्ष्य लाइसिन पदों पर अमीनो एसिड के अवशेष की मान्यता के लिए NSD1 के भेदभाव कारकों (K36 प्रयोग में) यहाँ दिखाया गया है। डेटा NSD1 -2 पी में खुशबूदार अवशेषों पसंद बताते हैं किosition (स्थिति शून्य के रूप में K36 पर)। हाइड्रोफोबिक अवशेष विवरण में विशिष्ट मतभेदों के साथ यद्यपि, -1 और 2 पदों पर पहचाने जाते हैं। एक साइट पर बुनियादी अवशेषों और amides पसंद कर रहे हैं। अन्य साइटों पर कुछ कमजोर वरीयताओं, लेकिन कोई मजबूत अवशेषों विशिष्ट readout का पता चला था। बी Scansite पर एक उदाहरण खोज के) स्क्रीनशॉट, NSD1। सी) पेप्टाइड स्पॉट सरणी NSD1 सकारात्मक के साथ एक साथ substrates कई भविष्यवाणी उपन्यास युक्त (H3K36 के लिए निर्धारित विशिष्टता प्रोफ़ाइल का उपयोग ) और नकारात्मक नियंत्रण (H3K36A)। प्रतिपादित उपन्यास लक्ष्यों में से कुछ जोरदार (उनमें से कुछ एनोटेट) methylated थे, अन्य मामलों में भविष्यवाणियों सत्यापित नहीं किया जा सकता है। पैनल ए और सी Kudithipudi एट अल से reproduced है। (2014) में कुछ संशोधनों के 19 के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आधार एन एम पी में 1 एम Oxyma शुद्ध - 15 मिलीलीटर एन एम पी में> 2,13 जी Oxyma शुद्ध
उत्प्रेरक 2.4 मिलीलीटर एन, 15 मिलीलीटर एन एम पी में 'एन -Diisopropylcarbodiimide
कैपिंग मिश्रण DMF में 20% एसिटिक एनहाइड्राइड - 30 मिलीलीटर DMF में> 6 मिलीलीटर एसिटिक एनहाइड्राइड
Fmoc Deprotection DMF में 20% piperidine - 1000 मिलीलीटर DMF में> 200 मिलीलीटर
Sidechain Deprotection 900 μl Triisopropylsilane + 600 μl DDH 2 हे 30 मिलीलीटर TFA में
धुंधला हो जाना DMF में 0.02% bromophenol नीला

तालिका 1: रासायनिक मिश्रण और प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है उनकी रचना।

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Discussion

यहाँ वर्णित के रूप में स्पॉट संश्लेषण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों नक्शा और पेप्टाइड संशोधित एंजाइमों के सब्सट्रेट मान्यता की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। स्पॉट विधि द्वारा संश्लेषित पेप्टाइड्स इस प्रत्येक उदाहरण में इस बात की पुष्टि करने के लिए मुश्किल है 90% से अधिक शुद्धता 21 है करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं, हालांकि, क्योंकि हालांकि, स्पॉट संश्लेषण अभी भी कुछ कमियां हैं। इसलिए, परिणाम उदाहरण का उपयोग प्रोटीन डोमेन के लिए या मानक तरीकों से संश्लेषित शुद्ध पेप्टाइड्स के साथ अन्य तरीकों से reproduced किया जाना है। इसके अलावा, स्पॉट सरणियों की अन्य बड़ी खामी है कि वे पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता है सबसे अधिक समय से एक सरणी के साथ कई assays के बाहर ले जाने के लिए है।

कम स्थिरता के एमिनो एसिड के साथ संश्लेषण की क्षमता में वृद्धि करने के लिए, संरक्षित arginine की तरह, यह हर 5 चक्रों के लिए उन्हें नए सिरे से बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। एंजाइमी प्रतिक्रियाओं या प्रोटीन बाध्यकारी अध्ययन में यह अक्सर पेप्टाइड स्थल की परिधि मो गया है कि मनाया जाता हैकेन्द्र ("अंगूठी मौके प्रभाव") से संकेत तीव्रता रहे हैं। इस आशय स्थान के मध्य भाग में पेप्टाइड्स के उच्च घनत्व के कारण हो सकता है और फिर इसे पेप्टाइड संश्लेषण 22 downscaling द्वारा हल किया जा सकता है। पेप्टाइड की आगे की मुसीबत शूटिंग के लिए मशीन हैंडबुक संश्लेषण और कंपनी की सेवा में परामर्श किया जाना चाहिए। मेथिलिकरण नहीं मनाया जाता है, तो सकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड्स (जांच के तहत एंजाइम द्वारा methylated होने के लिए जाना जाता है यानी पेप्टाइड्स) झिल्ली को जोड़ा जाना चाहिए।

स्पॉट सरणियों के लिए वैकल्पिक, उच्च घनत्व पेप्टाइड सूक्ष्म सरणियों 23 उपलब्ध हैं, लेकिन वे और अधिक महंगे हैं और उपयोग के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा हाजिर प्रति पेप्टाइड की राशि अधिक संवेदनशील readout के प्रक्रियाओं की आवश्यकता है, जो छोटी है। प्रोटीन भी इन कार्यों 24,25 अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन व्यक्त की और शुद्ध और जाने की जरूरत है क्योंकि वे तैयार करने के लिए और अधिक मुश्किल हो जाता हैसरणी पर प्रोटीन तह बनाए रखा जाना चाहिए। पेप्टाइड सरणियों का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि संश्लेषण के दौरान बाद translational संशोधनों के संभावित परिचय और व्यक्तिगत अमीनो एसिड के अवशेष की भूमिकाओं के उत्परिवर्तनीय परीक्षण के कम है।

यह इस प्रोटोकॉल के लिए एक अनिवार्य प्रारंभिक बिंदु है, जांच के तहत एंजाइम द्वारा methylated है जो पहचान की कम से कम एक पेप्टाइड, के लिए है। मेथिलिकरण की स्थिति और बफ़र्स अनुकूलित किया है, के रूप में अच्छी तरह से मिथाइल की एकाग्रता किया जाना है। मेथिलिकरण की अनुकरणीय समय पाठ्यक्रम गतिशील रेंज के नुकसान का कारण होगा जो सबसे अच्छा सब्सट्रेट, की पूरी मेथिलिकरण से बचने के लिए निर्धारित किया जाना है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Gradient Grade HPLC Honeywell 10299901 Flammable
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis Biosolve 4193302 Flammable, Toxic
Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis Roth A122.1 Flammable, Toxic, corrosive
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) Novabiochem 8510860100
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC Fluka 38370 Flammable, Toxic, corrosive
Acetic anhydride Roth CP28.1 Flammable, Toxic, corrosive
Triisopropylsilane 99% Aldrich 233781 Flammable, Toxic
Dichlormethane ≥99.9% Roth P089.1 Carcinogenic
N-Methyl-2-Pyrrolidone Roth 4306.2 Toxic
Derivatized cellulose Membrane Intavis AG Köln 32.1
Trifluoroacetic acid Roth P088.2 Toxic, corrosive
Bromphenolblue AppliChem A3640.0010
Ammonium Hydrogen Carbonate Roth T871.2 Toxic
Sodium Dodecyl Sulfate Pellets Roth CN30.3 Toxic, Flammable
MultiPep Synthesizer Intavis AG Köln n.a.
HyperfilmTM high performance film GE Healthcare 28906837
Phoretix software TotalLab n.a.

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References

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स्पॉट पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases की विशिष्टता विश्लेषण
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Kudithipudi, S., Kusevic, D.,… More

Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays. J. Vis. Exp. (93), e52203, doi:10.3791/52203 (2014).

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