Abstract
Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.
Introduction
Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona 1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que contém mais de 60 proteínas no genoma humano. PKMTs foram inicialmente descoberto como histonas modificando enzimas que metilar resíduo de lisina específica, mas relatos posteriores demonstraram que eles também poderiam metilar proteínas não-histonas 5. Até agora, cerca de 5,000 locais de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas 6
Matrizes de péptidos são amplamente utilizadas ferramentas para a análise bioquímica de anticorpos, enzimas modificadoras de péptidos e o mapeamento dos locais de interacção proteína-proteína (antigénio-anticorpo, receptor-ligando) 7-9. Várias centenas de péptidos são necessários para such aplicações. Existem diferentes métodos para a síntese de péptidos, entre os quais o péptido na resina de síntese é muito usado, mas tem limitações no rendimento e é relativamente dispendioso. Esses problemas foram resolvidos com a introdução do método de síntese SPOT por Frank e seus colegas 10. O método de síntese permite a síntese de SPOT várias centenas de péptidos em paralelo e em média é barata em comparação com a síntese de resina. Os péptidos sintetizados em membrana de celulose pode ser usado, quer directamente para várias aplicações ou péptidos pode ser clivado a partir da membrana e usado como péptidos livres nos ensaios em solução ou para preparar micromatrizes de péptido 10-13.
Síntese SPOT é uma variante da síntese de péptidos em fase sólida, o qual utiliza uma membrana de celulose como um suporte sólido e emprega a química padrão Fmoc-10-13. Assim, a síntese das cadeias de péptidos começa na extremidade C-terminal e prossegue em direcçãoa extremidade N-terminal, em contraste com a síntese biológica em ribossomas. Membranas de celulose são funcionalizados para a ligação do primeiro amino ácidos activados (Fig. 1). O método SPOT baseia-se na entrega sequencial de aminoácidos activados em uma gota de solvente para pontos definidos na membrana usando um sistema automático de pipetagem. A gota de líquido é distribuído sobre a membrana porosa, onde forma uma zona molhada circulares, que mais tarde actua como um reactor aberto para as reacções químicas na síntese de péptidos. O tamanho do ponto é determinado pelo volume dispensado e a capacidade de absorção da membrana, múltiplos de tais pontos estão dispostos como matrizes. A escala de síntese está correlacionada com o tamanho do local e a capacidade de carga da membrana. A distância entre os pontos e a densidade das matrizes são geridas através da variação dos tamanhos de ponto. Membrana de celulose tem várias vantagens como fase sólida em síntese de péptidos, que é barato, tolerante ao químicoals utilizados na síntese de peptídeos, estável em soluções aquosas e fácil de manusear. Além disso, a sua natureza hidrofilica a torna adequada para vários sistemas de ensaio biológicos. SPOT síntese pode ser realizada manualmente ou automatizada (para 1000 de peptídeos), dependendo do número necessário de péptidos. Um sintetizador SPOT totalmente automatizado de Intavis (Köln, Alemanha) é usado para as nossas aplicações. Ele permite a síntese de péptidos em quantidades diferentes e de comprimento diferente. Os péptidos lineares são regularmente sintetizado com um comprimento de ácido de 15 a 20 aminoácidos, em adição de péptidos até 42 aminoácidos podem também ser preparados por síntese passo a passo 14,15. No entanto, o aumento do número de aminoácidos leva a reduções nos rendimentos de acoplamento gerais, o que afecta a qualidade dos péptidos. Devido à baixa quantidade de péptidos por local, os produtos são frequentemente difíceis de purificar e a qualidade dos péptidos individuais não podem ser facilmente avaliadas. Portanto, os resultados obtidos a partir de SPOT Peptide matrizes devem ser confirmados quer com péptidos sintetizados através de métodos padrão em maior escala, que podem ser purificados e analisados de acordo com as normas em síntese de péptidos ou por síntese de proteínas que contêm as sequências de péptidos desejados. Ainda assim, encontramos a síntese SPOT para ser altamente confiável e resulta geralmente ser reprodutível. SPOT síntese não é restrita a proteinogenic vários aminoácidos, aminoácidos modificados comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para a síntese, permitindo que os péptidos a ser modificado antes e após a clivagem final do grupo de protecção da cadeia lateral e, além disso, também permite a incorporação de aminoácidos fosforilados, acetilados ou metilados 11.
Bibliotecas peptídicas imobilizadas sintetizados pelo método seco pode ser utilizado directamente para muitos ensaios biológicos e bioquímicos. Nós empregamos matrizes péptido compreendendo 300-400 peptídeos para investigar a especificidade de substrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatião, os arrays de péptidos são incubadas com o respectivo PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. A metilação do respectivo substrato é analisada por após a transferência enzimática dos grupos metilo marcados radioactivamente de AdoMet para o substrato péptido através de auto-radiograf ia (Fig. 3). Por este procedimento, as matrizes peptídicos permite o estudo da metilação de diferentes substratos peptídicos, ao mesmo tempo. Uma vantagem importante deste método é que todos os péptidos são metilados em competição, de modo a que durante a fase linear da cinética de metilação, a metilação relativa de cada péptido é proporcional à constante de velocidade catalítica dividida pela constante de dissociação (k cat / K D) da enzima para o respectivo substrato péptido. Portanto, a quantidade de radioactividade incorporada dentro de cada local está directamente correlacionada com a actividade enzimática relativamente a péptido particular. Usando oresultados de uma experiência de metilação matriz péptido, o perfil de especificidade do PKMT pode ser definida e com base neste novos substratos podem ser baseiam. Matrizes de péptidos permite a validação rápida e eficiente custo da metilação de novos substratos para o nível de péptidos. Por isso, as matrizes são preparadas que contêm os novos substratos previstos em conjunto com os péptidos modificados contendo um Ala em vez de Lys nos locais-alvo, assim como péptidos de controlo positivos e negativos. Finalmente, os novos substratos podem ser preparados como proteínas, juntamente com os mutantes, em que o alvo é alterada Lys para Ala e a metilação pode ser confirmada ao nível da proteína. Dependendo dos resultados, este é então seguido por estudos biológicos referentes ao potencial papel da metilação dos substratos de proteínas recentemente descrita.
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Protocol
1. Preparação do péptido Matrizes
- Programação do Peptide Sequências
- Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais.
Péptido 1: TARKSTGGKA - Gerar alanina ou arginina pé bibliotecas com um comando específico (.replace, A) para rastrear os aminoácidos importantes necessários para o reconhecimento de um substrato definido. Por exemplo, no exemplo que se segue a primeira linha é a sequência de tipo selvagem e a partir da segunda linha de cada aminoácido num péptido é alterado para alanina sequencialmente.
substituir, Um
TARKSTG
A -ARKSTG
T- A -RKSTG
TA A -KSTG
TARGET A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
A TARKST- - Use comandos semelhantes (.replace R,.N substituir etc.), tal como descrito em 1.1.2 com todos os resíduos de aminoácido naturalmente disponíveis (eventualmente omitindo cisteína, metionina e triptofano, porque estes resíduos são propensos a oxidação e, por vezes, menor rendimento de síntese) para sintetizar um péptido de matriz para a determinação do consenso motivo da sequência substrato para uma enzima.
NOTA: Como mostrado na Figura 4A, o eixo horizontal representa a sequência do péptido dada e o eixo vertical representa os aminoácidos que são seleccionadas para o comando. Semelhante à sequência mostrada em 1.1.2, uma no eixo vertical significa que uma sequencialmente Ala substitui cada posição da sequência dada na primeira fila na FIG. 4A. Do mesmo modo sequencialmente arginina substitui cada aminoácido na segunda fila e assim por diante com outros aminoácidos. Bibliotecas de matriz péptido completas são sintetizados por substituição sistemática de cada resíduo na sequência de péptido substrato fornecida com cada uma das the outros resíduos de aminoácidos naturalmente disponíveis, o que ajuda a entender a influência de cada resíduo em cada posição da sequência dada. - Como alternativa, a metilação de substratos peptídicos conhecida ou prevista pode ser facilmente verificada sintetizar bibliotecas de péptidos com os péptidos alvo do PKMT juntamente com controles de metilação positivo e negativo (ou seja, peptídeos conhecidos desnaturado ou conhecidos não ser metilado). Sintetizar peptídeos através da troca de lisina alvo putativo para alanina para confirmar a metilação da lisina-alvo, como mostrado abaixo pela programação manual.
Tipo selvagem peptídeo: STGG K PRQFL
Peptídeo Mutant: STGG A PRQFL
NOTA: O software também tem os scripts inerentes para criar diversas bibliotecas, como mapeamento de epitopo com uma mudança de enquadramento desejada da sequência de aminoácidos para mapear importantes necessários para uma interacção.
- Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais.
- Preparação de Membrana, Aminoácidos umd Reagentes
- Pré-inchar a membrana SPOT em DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 minutos e em seguida, coloque a membrana molhado na armação SPOT sintetizador sem bolhas de ar ou rugas.
- Lava-se a membrana três vezes com etanol a 100%. Secam-se as membranas completamente durante pelo menos 10 min antes de iniciar o programa de síntese.
- Em paralelo, preparar de fresco 0,5 M concentrações úteis de aminoácidos protegidos com Fmoc comercialmente disponíveis através da dissolução em NMP e também preparar o activador e de base como descrito na Tabela 1.
- Certifique-se de que todos os recipientes de solução resíduos do sintetizador SPOT foram esvaziados e reabastecer os reservatórios de solvente com o DMF, etanol e piperidina.
NOTA: A máquina está pronta para a síntese.
- A mancha de primeiro aminoácido
- Para gerar a ligação amida com o grupo amino livre sobre a membrana, activar o grupo carboxilo do amino ácido de entrada por adding o activador (N, N '-diisopropilcarbodiimida) e solução de base (hidroxiimino Cianoacetato de etilo) para o derivado de aminoácido.
- Spot the volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizado Amino-PEG usando o robô programável.
NOTA: Deste modo, o C-terminal do aminoácido é acoplado ao grupo amino da membrana. - Repetir esta etapa, três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido activado. Incubar a membrana durante 20 minutos e, em seguida, lava-se com DMF, para remover os aminoácidos desacoplados.
- Bloqueio de espaços livres em áreas não-local
NOTA: Após o acoplamento do primeiro aminoácido C-terminal de todos os péptidos para o grupo amino da membrana, os grupos amino entre as manchas e também alguns dos grupos amino no local dentro das áreas não formar ligações com os aminoácidos.- Bloquear os grupos amino livres através da incubação com a solução de nivelamento (20% de anidrido acético em DMF)durante 5 min.
NOTA: Este evita o acoplamento de aminoácidos nos ciclos posteriores, com a membrana em vez da cadeia peptídica em crescimento.
- Bloquear os grupos amino livres através da incubação com a solução de nivelamento (20% de anidrido acético em DMF)durante 5 min.
- A remoção do grupo Fmoc
- Após o bloqueio, lavar a membrana com DMF 4 vezes e depois incubar com 20% de piperidina em DMF durante 20 min para remover o grupo de protecção Fmoc.
NOTA: Este passo leva à remoção dos grupos Fmoc protectores de amino e é chamado de desprotecção. - Em seguida, lava-se a membrana duas vezes com DMF e duas vezes com etanol e deixar secar.
NOTA: Agora, a membrana está pronto para o acoplamento dos próximos amino ácidos.
- Após o bloqueio, lavar a membrana com DMF 4 vezes e depois incubar com 20% de piperidina em DMF durante 20 min para remover o grupo de protecção Fmoc.
- O alongamento da cadeia
NOTA: A adição de cada aminoácido é chamada um ciclo. Para além do acoplamento do primeiro aminoácido, o ciclo inicia-se com a desprotecção do grupo Fmoc do aminoácido acoplado e é seguido pelo acoplamento do grupo carboxilo activado de um amino ácido de entrada para o grupo amino do pep crescentecadeia maré.- Repita os passos 1.3 e 1.5 até que o comprimento de péptido desejado é alcançado.
- Coloração
NOTA: Após o ciclo final, as matrizes de peptídeos são corados com azul de bromofenol para confirmar a síntese bem-sucedida de peptídeos. Azul de bromofenol se liga com os grupos amino livres dos péptidos. Manchas de péptidos mostrar luz cor azul após a coloração, mas a intensidade das manchas varia dependendo da sequência peptídica. Esta coloração permite a confirmação da remoção completa de piperidina, porque na presença de azul de bromofenol a piperidina não mancha os péptidos. Além disso, isto também ajuda a marcar as matrizes de péptidos para posterior utilização.- Após desprotecção do grupo Fmoc no último ciclo de síntese, lava-se a membrana com DMF e etanol a 100%. Em seguida, tratar a membrana com azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol em DMF) durante um mínimo de 5 minutos até que se torne azul completamente.
- Em seguida, lava-se a membrana com DMF e ethanol seguido por secagem durante 10 min. Agora tire a membrana do sintetizador e realizar a desprotecção da cadeia lateral (seção 1.8) manualmente. Se necessário, a fotografia da membrana para registar os resultados da síntese de péptidos (Fig. 2).
- Cadeia Lateral desprotecção
- Tratar as membranas com 20 a 25 ml de mistura de desprotecção da cadeia lateral que consiste em 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para clivar os grupos de protecção de cadeia lateral e reagentes eliminadores de água (2,5% e 2,5% de triisopropilsilano) para proteger as cadeias laterais de aminoácidos a partir de modificação durante este passo. Tomar um volume suficiente da mistura de desprotecção para assegurar que abrange a membrana completamente numa caixa resistente a produtos químicos e hermeticamente fechado e que incubar durante 1 a 2 horas enquanto se agita suavemente.
- Lava-se a membrana seis vezes com 20-25 mL de DCM (diclorometano), durante 2 minutos cada e, finalmente, duas vezes com etanol a 100% e seca-se num exsicador durante a noite.
NOTA: Agoraa membrana pode ser utilizado para experiências. Um esquema de síntese da matriz péptido é fornecida na Figura 1.
2. Protein Expression and Purification
- Expressão de Proteína de PKMTs como GST Fusions
- Usando técnicas padrão, clonar o gene que codifica o PKMT comprimento completo ou o seu domínio catalítico num vector de expressão bacteriana (como pGEX-6p2) para expressar a proteína de fusão-GST.
- Transferir o vector com o PKMT desejado inserir em BL21 BL21 codão ou mais E. células de E. coli pelo método de choque de calor ou qualquer outro método.
- Prepara-se uma pré-cultura com 30 ml de meio de Luria-Bertani (LB), o dia de expressão e incubar a 37 ° C durante 7 a 8 horas com agitação contínua.
- Em seguida, transferir 10 ml da pré-cultura em 2 L de frascos de grandes confundidos contendo 1 L de meio LB e incubar a 37 ° C no incubador com agitação contínua até que o alcance culturaes uma densidade óptica a 600 nm definido.
NOTA: Enquanto isto pode ser optimizado para cada proteína, que normalmente induzem a um OD 600 nm de cerca de 0,8. A temperatura de indução tem de ser optimizados para cada proteína individual, algumas proteínas mostram boa expressão em 22 ° C e a temperaturas um pouco mais elevadas. - Deslocar as células à temperatura de indução, durante 15 min, em seguida, induzir com 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido e permitir a cultura a crescer durante 10-12 horas à temperatura de indução.
- Em seguida a colheita das células por centrifugação a 5000 xg durante 15 min e, finalmente, lavar o sedimento com 30 ml de tampão de STE (10 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM e EDTA 0,1 mM) e armazenar a -20 ° C para posterior utilização.
- Protein Purification
- Descongelar o pellet celular e re-suspensão em 30 ml de tampão de sonicação (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) e perturbar por sonicação.
NOTA: Este tampão needs de ser optimizados para cada proteína, eventualmente. - Centrifuga-se o lisado celular a 22000 x g durante 1 hora e, depois, recolher o sobrenadante e passar através de uma coluna contendo 600 mL de resina glutationa Sepharose 4B.
- Lava-se a coluna com 50 ml de tampão de sonicação e em seguida com 100 ml de tampão de alto teor salino (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) para remover as proteínas não especificamente ligadas. Elui-se a proteína ligada com 5 ml de tampão de alto teor salino contendo glutationa 40 mM.
- Dializar a proteína eluída em 2 L de tampão de diálise com baixo glicerol (20 mM de Tris, pH 7,4, KCl 100 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 10%) durante 2 horas e depois em tampão Tris 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e glicerol a 70% durante 8 horas ou durante a noite. Certifique-se de todos os buffers de purificação são a 4 ° C e realizar a purificação de proteínas na câmara fria para evitar a desnaturação das proteínas.
- Descongelar o pellet celular e re-suspensão em 30 ml de tampão de sonicação (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) e perturbar por sonicação.
3. Peptide Matriz Methylation
- Pré-incubation of Peptide Arrays
- Realizar péptido matriz de metilação, quer dentro de uma caixa de tamanho apropriado ou em um saco de plástico para evitar o desperdício de enzima e caro marcado radioactivamente AdoMet. Pré-incubar o péptido matriz da membrana no saco de plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e rotulado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. O volume de tampão depende do tamanho da matriz, por exemplo, usar 8 ml de tampão de metilação de uma especificidade completa matriz perfil peptídico. Optimizar a quantidade e a concentração da AdoMet para cada enzima.
- A metilação do péptido Matrizes
- Descartar o tampão de pré-incubação e incubação da membrana em 8 ml de tampão de metilação contendo a respectiva PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet por 1 a 2 horas.
NOTA: A quantidade de enzima necessária para uma reacção de metilação depende da actividade de PKMT específico, iniciamos nossas experiências de rastreio, tipicamente com 50 nM de enzima aletaconcentração al.
- Descartar o tampão de pré-incubação e incubação da membrana em 8 ml de tampão de metilação contendo a respectiva PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet por 1 a 2 horas.
- Lavagem das matrizes Peptide
- Depois descartar o tampão de metilação de um recipiente de resíduos radioactivos e lavar as matrizes de péptidos por 5 vezes com 20 ml de tampão contendo 100 mM de bicarbonato de amónio e 1% de SDS durante 5 minutos para remover a proteína ligada. Descarte o tampão de lavagem em um recipiente de lixo radioativo.
- A detecção do sinal radioativo
- Após as lavagens da membrana incubar durante 5 min em 10 ml de solução amplificar (NAMP100V).
- Em seguida, descartar a solução amplificar no contentor de resíduos radioactivos para solventes orgânicos, selar a matriz peptídeo em um saco plástico e coloque-o em uma cassete de auto-radiografia.
- Coloque a película auto-radiografia da matriz sobre o péptido em quarto escuro. Fechar a cassete cuidadosamente e expô-lo a -80 ° C durante o tempo necessário. Em seguida, o desenvolvimento do filme para analisar os resultados. Capturar a imagem do casal vezes com expositio diferenten vezes para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilado.
4. Processamento de Dados e Análise
- Densitom�rica Análise da mancha Intensities
- Digitalizar o filme em um scanner convencional e analisar as intensidades local por densitometria. Faça isso usando ImageJ (que é gratuito) ou um programa comercial.
NOTA: Nós usamos o software Phoretix para esta tarefa.
- Digitalizar o filme em um scanner convencional e analisar as intensidades local por densitometria. Faça isso usando ImageJ (que é gratuito) ou um programa comercial.
- Normalização e Média dos resultados de diferentes membranas
- Conduzir as experiências de metilação péptido de matriz, pelo menos em triplicado. Normalizar as intensidades digitalizados para cada experimento por subtração de fundo e definindo a atividade em um substrato de referência como 1.0. Calcular a média dos dados para os pontos individuais e relatá-los como valores médios e desvios-padrão.
- Análise e visualização de dados
- Traçar os dados em 2D, utilizando um esquema de escala de cinza ou de cor para indicar a atividade relativa. Faça isso with Excel ou SigmaPlot imediata. Além disso, preparar um gráfico da distribuição dos desvios padrão das experiências repetidas para analisar a qualidade dos dados.
- Para comparar e visualizar a exactidão do reconhecimento de cada resíduo no péptido substrato quantitativamente, calcular a preferência relativa do PKMT para cada aminoácido na posição x i por um factor de discriminação 16,17 D:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Onde v i é a taxa de metilação do péptido portador de variante de aminoácido na posição x i e <v j ≠ i> é a taxa média de metilação de todos os 19 péptidos que transportam um aminoácido diferente j ≠ i na posição x (incluindo o sequência de tipo selvagem).
NOTA: O factor de discriminação definido por este depende do nível de fundo. Se apenas um resíduo é aceito em uma determinada posição com um fundo de 3%, a discriminaçãofator de 32,3 é obtido. Sem preferência numa posição resulta num factor de discriminação de 0.
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Representative Results
Matrizes de péptidos foram utilizados com sucesso para caracterizar bioquimicamente a especificidade de PKMTs, e foram identificados vários novel histonas e não-histonas substratos de PKMT por esta abordagem 5,16-19. Definindo o espectro substrato correta de um PKMT (ou qualquer enzima) é um passo essencial para a compreensão do seu mecanismo molecular e funções celulares.
Como um exemplo da aplicação do método da matriz de metilação péptido SPOT, descrevem-se os resultados da análise da especificidade do NSD1 PKMT 19. Anterior ao nosso trabalho, esta enzima foi descrito metilato de vários substratos, incluindo a histona H3 em K36 e histonas H4 no K20, mas também o fator de transcrição da família p65 NF-kB na K218 e K221. Fig. 4A mostra um exemplo de uma reacção de metilação de uma matriz de péptido com NSD1. Para estas experiências, uma grande variedade de péptidos com base no H3 (31-49) seqüência foi sintetizado que contém todos os possíveisalterações de um único aminoácido da sequência original para testar o significado de cada um dos aminoácidos em interacção NSD1 e metilação. No total, foram sintetizados péptidos 380 (20 aminoácidos possíveis x 18 resíduos, mais uma sequência de H3 inicial em cada linha). O eixo horizontal representa a sequência do péptido e no sentido vertical do aminoácido que é alterado no péptido correspondente é indicado. Por exemplo, o ponto a linha 17 da coluna 4 contém uma treonina na terceira posição em vez de glicina, que está presente na sequência de tipo selvagem (Fig. 4A). Em tal forma, são geradas mutações pontuais para testar a preferência de NSD1 para cada aminoácido nativo em cada posição no substrato peptídico. A metilação com NSD1 mostrou que actua especificamente sobre H3K36 e que tem preferências em ambos os lados da lisina alvo 34-38.
A Figura 4B representa a consolidação da matriz metilação três peptídeoexperiências com NSD1. As informações quantitativas foi adquirida a partir das matrizes de peptídeos individuais e os resultados foram normalizados e média, como descrito acima. Os desvios-padrão das médias individuais mostram que os dados são altamente reprodutível. Em geral cerca de 85% dos péptidos mostra SDs menores do que 20% e mais de 97% dos substratos peptídicos demonstrado SDs menor do que 30% (Fig. 4C). Além disso, nós também calculado o fator de discriminação para determinar com precisão a contribuição de cada um dos aminoácidos nas posições testadas. Como descrito fornece a descrição quantitativa do péptido lidos e de preferência os aminoácidos na posição específica (Fig. 5A). Os nossos dados mostram que NSD1 prefere resíduos aromáticos na posição -2 (considerando K36 como a posição 0) (F> Y> G); resíduos hidrófobos em -1 (I> L> V); resíduos básicos em um (R> QKNM), onde ele não pode tolerar resíduos hidrófobos ou aromáticos; e hidráulicaresíduos rophobic em 2 (V> IA> P). Em outros locais (como -3, 3, ou 6), NSD1 prefere alguns aminoácidos, mas nenhum resíduo de leitura específico forte foi detectada.
Com base neste perfil, os potenciais substratos peptídicos novos podem ser encontrados por pesquisas de banco de dados usando como Scansite 20 (Fig. 5B). Estes péptidos foram preparados em uma matriz SPOT incluindo os controlos positivos e negativos e incubadas com NSD1 e marcado radioactivamente AdoMet para identificar o subconjunto daqueles que são metilados no nível péptido (Fig. 5C). Como acompanhamentos, matrizes de péptidos que podem ser preparados incluem variantes de péptidos, em que o alvo de lisina é substituído por alanina, para confirmar que a metilação tem lugar no local previsto. Em seguida, as proteínas alvo ou subdomínios deles contendo a lisina alvo pode ser produzido de forma recombinante e a metilação também testados no nível da proteína. Finalmente, dependendo dos resultados, acompanhar os experimentos podem i nvestigate se também ocorre a metilação em células e que biológica papel que ele tem.
Figura 1:. Esquema de síntese de peptídeos pelo método SPOT em membrana de celulose por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Exemplo de uma matriz de peptídeo corados com azul de bromofenol para confirmar a síntese de peptídeos por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Esquema do experimento peptídeo matriz metilação; matrizes de péptidos foram metilados pela incubação com PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. Depois da radioatividade transferido para cada ponto é detectado por auto-radiografia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo resultados obtidos com o NSD1 PKMT A) Exemplo de um péptido matriz de especificidade de substrato para NSD1 usando o H3 (31-49) como sequência molde.. O eixo horizontal representa a sequência de H3 e o eixo vertical representa os aminoácidos, através da qual a linha correspondente está mutado. A primeira linha contém peptídeos comsequência original. B) consolidação dos resultados de três experimentos matriz peptídeo metilação independentes com NSD1, os dados foram em média, os resultados de todos os três experimentos após C) Distribuição de normalização. de erros padrão para os dados médios de metilação mostrados no painel B. Reproduzido de Kudithipudi et al. (2014) com algumas modificações 19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. A descoberta de novos substratos PKMT A) Discriminação de factores NSD1 para o reconhecimento de resíduos de aminoácido nas posições junto ao alvo lisina (K36 na experiência mostrada aqui). Os dados mostram que NSD1 prefere resíduos aromáticos na -2 pOSIÇÃO (considerando K36 como posição 0). Resíduos hidrofóbicos são reconhecidos ao -1 e duas posições, embora com diferenças distintas em detalhes. No local 1 são preferidos resíduos básicos e amidas. Em outros locais algumas preferências fraca, mas não de leitura específica resíduo forte foi detectada. B) de tela de uma busca exemplo em Scansite, usando o perfil de especificidade determinada para NSD1. C) matriz Peptide SPOT contendo vários novela previu NSD1 substratos juntamente com positiva (H3K36 ) e controles negativos (H3K36A). Alguns dos novos alvos baseia-se fortemente metilado (alguns deles anotado), em outros casos, as previsões não pôde ser verificada. Painel A e C é reproduzido a partir Kudithipudi et al. (2014) com algumas modificações 19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Base | 1 M Oxyma Pure em NMP -> 2,13 g Oxyma Pure em 15 ml de NMP |
| Activator | 2,4 ml de N, N '-diisopropilcarbodiimida em 15 ml de NMP |
| Nivelamento Mistura | 20% de anidrido acético em DMF -> 6 ml de anidrido acético em 30 ml de DMF |
| A desprotecção de Fmoc | 20% de piperidina em DMF - 200 ml> em 1000 ml de DMF |
| Sidechain desprotecção | 900 ul triisopropilsilano + 600 mL DDH 2 O em 30 ml de TFA |
| Coloração | 0,02% de azul de bromofenol em DMF |
Tabela 1: Misturas químicas e a sua composição utilizada no protocolo.
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Discussion
Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza 21 esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domínios proteicos ou com péptidos purificados sintetizados por métodos convencionais. Além disso, a outra desvantagem importante de matrizes SPOT é que a maior parte do tempo eles não podem ser reutilizados para efectuar vários ensaios com uma matriz.
Para aumentar a eficiência da síntese com os aminoácidos de baixa estabilidade, como a arginina protegida, é importante fazê-los fresco para cada 5 ciclos. Em reacções enzimáticas ou de estudos de ligação de proteína é frequentemente observado que a periferia da mancha de péptido tem more intensidade do sinal do que o centro ("efeito da mancha anelar"). Este efeito pode ser devido à alta densidade de péptidos na parte central do lugar e, em seguida, ele pode ser resolvido pelo decrescimento da síntese de péptidos 22. Para mais resolução de problemas de peptídeo síntese do manual da máquina e serviço de empresa deve ser consultado. Se metilação não é observada, os péptidos de controlo positivo (isto é, péptidos que se sabe ser metilado pela enzima sob investigação) deve ser adicionado à membrana.
Suplente de matrizes SPOT, matrizes micro peptídicas de alta densidade 23 estão disponíveis, mas eles são mais caros e requerem equipamento especial para uso. Além disso, a quantidade de péptido por mancha é menor, o que requer processos de leitura mais sensíveis. Arrays de proteínas também estão disponíveis para estudar estas funções 24,25, mas são mais difíceis de preparar porque cada proteína individual necessita de ser expresso e purificado eo enrolamento de proteínas na matriz deve ser mantida. Uma vantagem adicional de arrays de péptidos é possível a introdução de modificações pós-translacionais durante a síntese e a facilidade de teste mutacional dos papéis de resíduos de aminoácidos individuais.
É um ponto de partida essencial para este protocolo, para ter pelo menos um péptido identificado, que é metilado pela enzima sob investigação. Condições de metilação e tampões têm que ser optimizado, bem como a concentração da metiltransferase. Cursos de exemplares de tempo de metilação tem que ser determinada para evitar metilação completa do melhor substrato, o que causará a perda de gama dinâmica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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