Abstract
Metilación de la lisina es una modificación post-traducción emergentes y se ha identificado en varias proteínas histonas y no histonas, donde juega un papel crucial en el desarrollo de células y muchas enfermedades. Aproximadamente se identificaron 5.000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas, que son fijados por unos decenas de lisina methyltransferases proteína. Esto sugiere que cada PKMT methylates múltiples proteínas, sin embargo hasta ahora sólo uno o dos sustratos se han identificado varias de estas enzimas. Analiza la especificidad de sustrato de arreglo péptido Para abordar este problema, hemos introducido de PKMTs. Matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar la especificidad de PKMTs porque metilación de varios sustratos con diferentes secuencias se puede probar en un array. Hemos sintetizado arrays de péptidos en la membrana de celulosa usando un sintetizador Intavis SPOT y analizado la especificidad de los distintos PKMTs. Basándose en los resultados, para varias de estas enzimas, s novelaubstrates pudieron ser identificados. Por ejemplo, para NSD1 mediante el empleo de arrays de péptidos, mostramos que metila K44 de H4 en lugar de la H4K20 informado y además H1.5K168 es el sustrato altamente preferido sobre el H3K36 anteriormente conocido. Por lo tanto, las matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar bioquímicamente los PKMTs.
Introduction
En las últimas dos décadas, varios informes han demostrado la importancia de las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) en el desarrollo celular y varias enfermedades como el cáncer, pero recientemente la proteína metilación de la lisina se ha convertido en una otra PTM vital. Mientras histona inicialmente metilación de la lisina se encontró que era una marca esencial de la cromatina, el trabajo más tarde también mostró lisina metilación de varias proteínas no histonas 1-4. La transferencia secuencial de los grupos metilo de la S-adenosil-L-metionina al grupo ε-amino de residuos de lisina es catalizada por una familia de enzimas llamada proteína de lisina methyltransferases (PKMTs) que contiene más de 60 proteínas en el genoma humano. PKMTs fueron descubiertos inicialmente como enzimas histona modificación que metilan residuo de lisina específico, pero informes posteriores demostraron que también podían methylate proteínas no histonas 5. Hasta ahora, se han identificado aproximadamente 5,000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas 6
Arrays de péptidos se utilizan ampliamente herramientas para el análisis bioquímico de anticuerpos, enzimas modificadoras de péptidos y el mapeo de sitios de interacción proteína-proteína (anticuerpo-antígeno, receptor-ligando) 7-9. Se necesitan varios cientos de péptidos para such aplicaciones. Diferentes métodos están disponibles para la síntesis de péptidos, entre ellos Peptide Synthesis sobre resina se utiliza muy comúnmente, pero tiene limitaciones en el rendimiento y es relativamente caro. Estos problemas se resolvieron con la introducción del método de síntesis SPOT por Frank y sus colegas 10. El método de síntesis SPOT permite la síntesis de varios cientos de péptidos en paralelo y en promedio es barato en comparación con la síntesis de resina. Los péptidos sintetizados sobre membrana de celulosa se pueden utilizar ya sea directamente para diversas aplicaciones o péptidos se puede escindir de la membrana y se utiliza como péptidos libres en solución o ensayos para preparar microarrays de péptidos 10-13.
Síntesis SPOT es una variante de la síntesis de péptidos en fase sólida, que utiliza una membrana de celulosa como un soporte sólido y emplea el Fmoc-química estándar 10-13. Por lo tanto, la síntesis de cadenas peptídicas comienza en el extremo C-terminal y procede haciael extremo N-terminal en contraste con la síntesis biológica en los ribosomas. Las membranas de celulosa están funcionalizados para la unión de la primera activado ácidos amino (Fig. 1). El método SPOT se basa en la entrega secuencial de aminoácidos activados en una gotita de disolvente a lugares definidos en la membrana usando un sistema de pipeteo automatizado. La gota de líquido se dispensa en la membrana porosa donde forma una mancha de humedad circular, que posteriormente actúa como un reactor abierto para las reacciones químicas en la síntesis de péptidos. El tamaño del punto se determina por el volumen dispensado y la capacidad de absorción de la membrana, múltiplos de tales puntos están dispuestos como arrays. La escala de la síntesis se correlaciona con el tamaño del punto y la capacidad de carga de la membrana. La distancia entre los puntos y la densidad de arrays se gestionan mediante la variación de los tamaños de punto. Membrana de celulosa tiene varias ventajas como fase sólida en la síntesis de péptidos, es barato, tolerante a la chemicals, utilizados en la síntesis de péptidos y estables en soluciones acuosas y fácil de manejar. Además, su naturaleza hidrofílica lo hace adecuado para varios sistemas de ensayo biológico. Síntesis SPOT puede llevarse a cabo de forma manual o automatizado (para 1000s de péptidos) en función del número requerido de péptidos. Un sintetizador SPOT totalmente automatizado desde Intavis (Köln, Alemania) se utiliza para nuestras aplicaciones. Permite la síntesis de péptidos en cantidades diferentes y de diferente longitud. Los péptidos lineales se sintetizaron regularmente con ácido longitud de 15 a 20 amino, en los péptidos de adición de hasta 42 aminoácidos también se pueden preparar por paso a paso la síntesis 14,15. Sin embargo, aumentar el número de aminoácidos conduce a reducciones en los rendimientos de acoplamiento en general, que afecta a la calidad de los péptidos. Debido a la baja cantidad de péptidos por punto, los productos son a menudo difíciles de purificar y la calidad de los péptidos individuales no se pueden evaluar fácilmente. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de Pept SPOTarrays IDE deben ser confirmadas ya sea con péptidos sintetizados por métodos estándar en mayor escala, que pueden ser purificados y analizados de acuerdo a los estándares en la síntesis de péptidos o por la síntesis de las proteínas que contienen las secuencias de péptidos deseados. Aún así, encontramos la síntesis SPOT ser altamente fiable y resultados generalmente para ser reproducible. Síntesis SPOT no se limita a proteinogenic aminoácidos, varios ácidos disponibles comercialmente aminoácidos modificados también pueden ser utilizados para la síntesis, lo que permite péptidos para ser modificados antes y después de la escisión final del grupo de protección de cadena lateral y, además, también permite la incorporación de aminoácidos fosforilados, metilados o acetilados 11.
Bibliotecas de péptidos inmovilizados sintetizados por el método de SPOT se pueden utilizar directamente para muchos ensayos biológicos y bioquímicos. Empleamos arrays de péptidos que comprenden 300-400 péptidos para investigar la especificidad de sustrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatión, las matrices de péptidos se incuban con el respectivo PKMT y etiquetado [metil- 3 H] -AdoMet en un tampón apropiado. La metilación del sustrato respectivo se analizó siguiendo la transferencia enzimática de los grupos metilo de AdoMet marcados radiactivamente en el sustrato péptido mediante autorradiografía (Fig. 3). Por este procedimiento, las matrices de péptidos permiten el estudio de metilación de diferentes sustratos peptídicos al mismo tiempo. Una ventaja importante de este método es que todos los péptidos están metiladas en la competencia, de modo que durante la fase lineal de la cinética de metilación, la metilación relativo de cada péptido es proporcional a la constante de velocidad catalítica dividido por la constante de disociación (k cat / K D) de la enzima por el sustrato peptídico respectiva. Por lo tanto, la cantidad de radiactividad incorporada en cada lugar se correlaciona directamente con la actividad enzimática hacia el péptido particular. Utilizando elresultados de un experimento de metilación matriz de péptido, el perfil de especificidad de la PKMT se pueden definir y basándose en este nuevo sustratos pueden ser afirmados. Arrays de péptidos permiten la validación rápida y eficiente costo de la metilación de nuevos sustratos en el nivel de péptido. Para esto, se preparan las matrices que contienen los nuevos sustratos predichos junto con péptidos modificados que contienen un Ala en lugar de Lys en los sitios diana, así como péptidos de control positivos y negativos. Finalmente, los nuevos sustratos se pueden preparar como proteínas junto con mutantes, en los que el objetivo Lys está reemplazado por Ala y la metilación puede ser confirmada a nivel de proteína. Dependiendo de los resultados, esto es seguido por los estudios biológicos que abordan posibles funciones de la metilación de los sustratos proteicos recién descritos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación del péptido Arrays
- Programación de la secuencias peptídicas
- Diseñar secuencias de péptidos para la síntesis utilizando el software MultiPep Spotter. Introduzca las secuencias de péptidos en los códigos de una sola letra.
Péptido 1: TARKSTGGKA - Generar alanina o arginina pie bibliotecas con un comando específico (.replace, A) para detectar los aminoácidos importantes que se requieren para el reconocimiento de un sustrato definido. Por ejemplo, en el siguiente ejemplo, la primera línea es la secuencia de tipo salvaje y de la segunda línea de cada aminoácido en un péptido se altera secuencialmente a alanina.
sustituir, A
TARKSTG
Un -ARKSTG
T- A -RKSTG
TA A -KSTG
TARGET A -STG
TARK- Un -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Utilice comandos similares (.replace R,.reemplazar N etc.) como se describe en 1.1.2 con todos los residuos de aminoácidos naturalmente disponibles (eventualmente omitiendo cisteína, metionina y triptófano, debido a que estos residuos son propensos a la oxidación y, a veces menor rendimiento de síntesis) para sintetizar una matriz de péptido para la determinación del consenso sustrato motivo de secuencia para una enzima.
NOTA: Como se muestra en la Figura 4A, el eje horizontal representa la secuencia de péptido dado y el eje vertical representa los aminoácidos que se seleccionan para el comando. Similar a la secuencia mostrada en 1.1.2, A en el eje vertical significa que un secuencialmente Ala reemplaza cada posición de la secuencia dada en la primera fila en la Fig. 4A. Del mismo modo secuencial arginina sustituye cada aminoácido en la segunda fila y así sucesivamente con los otros aminoácidos. Bibliotecas completas de matriz péptido se sintetizan mediante la sustitución sistemática de cada residuo en la secuencia de sustrato peptídico proporcionado con cada uno de ºe otros residuos de aminoácidos disponibles de forma natural, lo que ayuda a comprender la influencia de cada residuo en cada posición de la secuencia dada. - Alternativamente, la metilación de los sustratos peptídicos conocidos o previstos puede ser fácilmente verificada la síntesis de bibliotecas de péptidos con los péptidos diana de la PKMT junto con controles de metilación positivo y negativo (es decir, péptidos que se sabe que metilado o conocidos no ser metilado). Sintetizar péptidos mediante el intercambio de la lisina putativo objetivo a alanina para confirmar la metilación de la lisina de destino como se muestra a continuación mediante la programación manual.
Wild tipo péptido: LTGG K PRQFL
Péptido mutante: LTGG Un PRQFL
NOTA: El software también tiene secuencias de comandos inherentes para crear varias bibliotecas, como el mapeo de epítopos con un cambio de marco deseada de la secuencia para mapear los aminoácidos importantes que se requieren para una interacción.
- Diseñar secuencias de péptidos para la síntesis utilizando el software MultiPep Spotter. Introduzca las secuencias de péptidos en los códigos de una sola letra.
- Preparación de membrana, Amino Acids unaReactivos d
- Pre-hinchar la membrana SPOT en DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 min y luego se coloca la membrana húmeda sobre el bastidor sintetizador SPOT sin burbujas de aire o arrugas.
- Lavar la membrana tres veces con etanol al 100%. Secar las membranas completamente durante al menos 10 min antes de iniciar el programa de síntesis.
- En paralelo, recién preparar 0,5 M concentraciones de trabajo de aminoácidos protegidos con Fmoc comercialmente disponibles mediante su disolución en NMP y también preparar el activador y base como se describe en la Tabla 1.
- Asegúrese de que todos los contenedores de solución de residuos del sintetizador SPOT se vaciaron y rellenar los depósitos de disolvente con la DMF, etanol y piperidina.
NOTA: Ahora la máquina está lista para la síntesis.
- Manchas de la Primera Amino Acid
- Para generar el enlace amida con el grupo amino libre en la membrana, activar el grupo carboxi del aminoácido entrante adding el activador (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) y la solución de base (cianoacetato de etilo hidroxiimino) para el derivado de ácido amino.
- Detectar los volúmenes deseados de aminoácidos activados en la membrana funcionalizado amino-PEG usando el robot programable.
NOTA: este modo, el C-terminal del aminoácido se acopla al grupo amino de la membrana. - Repita este paso tres veces para asegurar un mejor acoplamiento del primer aminoácido activado. Incubar la membrana durante 20 min y luego se lava con DMF para eliminar aminoácidos desacoplados.
- El bloqueo de los espacios libres en zonas no al contado
NOTA: Después de que el acoplamiento del primer aminoácido C-terminal de todos los péptidos con el grupo amino de la membrana, los grupos amino entre las manchas y también algunos de los grupos amino dentro de las áreas de punto de no formar enlaces con los aminoácidos.- Bloquear estos grupos amino libres mediante la incubación con la solución de empaquetado (20% de anhídrido acético en DMF)durante 5 min.
NOTA: Esto evita el acoplamiento de los aminoácidos en los ciclos adicionales con la membrana en lugar de la cadena peptídica en crecimiento.
- Bloquear estos grupos amino libres mediante la incubación con la solución de empaquetado (20% de anhídrido acético en DMF)durante 5 min.
- La eliminación de Fmoc Grupo
- Tras el bloqueo, lavar la membrana con DMF 4 veces y luego se incuba con 20% de piperidina en DMF durante 20 min para eliminar el grupo de protección Fmoc.
NOTA: Este paso lleva a la eliminación de los grupos protectores de amino Fmoc y se llama desprotección. - Después, lavar la membrana dos veces con DMF y dos veces con etanol y deje que se seque.
NOTA: Ahora la membrana está listo para el acoplamiento de los siguientes aminoácidos.
- Tras el bloqueo, lavar la membrana con DMF 4 veces y luego se incuba con 20% de piperidina en DMF durante 20 min para eliminar el grupo de protección Fmoc.
- Elongación de la cadena
NOTA: La adición de cada aminoácido se denomina un ciclo. Aparte del acoplamiento del primer aminoácido, el ciclo comienza con la desprotección del grupo Fmoc del aminoácido acoplado y es seguida por el acoplamiento del grupo carboxilo activado de un ácido amino entrante para el grupo amino de la pep crecientecadena de marea.- Repetir los pasos 1.3 y 1.5 hasta que se consigue la longitud del péptido deseado.
- La tinción
NOTA: Después de que el ciclo final, los arrays de péptidos se tiñeron con azul de bromofenol para confirmar la exitosa síntesis de péptidos. Azul de bromofenol se une con los grupos amino libres de los péptidos. Manchas de péptidos muestran de color azul claro después de la tinción, pero la intensidad de las manchas varía en función de la secuencia del péptido. Esta tinción permite la confirmación de la completa eliminación de la piperidina, debido a que en presencia de azul de bromofenol piperidina no mancha los péptidos. Además, esto también ayuda a marcar los arrays de péptidos para su uso posterior.- Después de la desprotección del grupo Fmoc en el último ciclo de síntesis, se lava la membrana con DMF y etanol 100%. Luego, trate la membrana con azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol en DMF) durante un mínimo de 5 minutos hasta que se vuelva completamente azul.
- Después, lavar la membrana con DMF y ethanol seguido por secado durante 10 min. Ahora saca la membrana del sintetizador y realizar la desprotección de la cadena lateral (sección 1.8) manualmente. Si es necesario, fotografiar la membrana para documentar los resultados de la síntesis del péptido (Fig. 2).
- La desprotección de la cadena lateral
- Tratar las membranas con 20 a 25 ml de mezcla de desprotección de la cadena lateral que consiste en 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para escindir los grupos de protección de cadena lateral y reactivos scavenger (2,5% de agua y 2,5% triisopropilsilano) para proteger las cadenas laterales de aminoácidos a partir de modificación durante este paso. Tome un volumen suficiente de mezcla de desprotección para asegurarse de que cubra completamente la membrana en una caja herméticamente cerrada resistente a productos químicos y se incuba durante 1 a 2 horas mientras se agita suavemente.
- Lavar la membrana seis veces con 20 a 25 ml de DCM (diclorometano) durante 2 minutos cada uno y finalmente dos veces con etanol al 100% y se seca en un desecador durante la noche.
NOTA: Ahorala membrana puede ser utilizado para los experimentos. Un esquema de la síntesis de matriz de péptido se proporciona en la Figura 1.
2. Expresión y Purificación de Proteínas
- Expresión de proteínas de PKMTs como fusiones GST
- Utilizando técnicas estándar, clonar el gen que codifica la PKMT longitud completa o su dominio catalítico en un vector de expresión bacteriano (como pGEX-6P2) para expresarlo como proteína de fusión con GST.
- Transferir el vector con el PKMT deseada insertar en BL21 o BL21 codón más E. células de E. coli por el método de choque térmico o cualquier otro método.
- Preparar un pre-cultivo con 30 ml de medio Luria-Bertani (LB) en el día de expresión y se incuba a 37 ° C durante 7 a 8 horas con agitación continua.
- A continuación, transferir 10 ml de la pre-cultivo en unas 2 L grandes matraces con deflectores que contienen 1 L de medio LB y se incuba a 37 ° C en la incubadora con agitación continua hasta que el alcance de la culturaes una densidad óptica definida a 600 nm.
NOTA: Mientras que esto puede ser optimizado para cada proteína, inducimos rutinariamente a una OD 600 nm de aproximadamente 0,8. La temperatura de inducción tiene que ser optimizado para cada proteína individual, algunas proteínas mostrar buena expresión a las 22 ° C y algunos a temperaturas más altas. - Shift las células a la temperatura de inducción de 15 min, a continuación, inducir con 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido y permitir que el cultivo crezca durante 10-12 horas a la temperatura de inducción.
- Después recoger las células por centrifugación a 5000 xg durante 15 min y finalmente lavar el sedimento con 30 ml de tampón STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM y EDTA 0,1 mM) y se almacena a -20 ° C para su posterior uso.
- Protein Purification
- Descongelar el pellet de células y volver a suspender en 30 ml de tampón de sonicación (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM y 5% de glicerol) y perturbar por sonicación.
NOTA: Este buffer nECESIDADES para ser optimizado para cada proteína con el tiempo. - Centrifugar el lisado de células a 22.000 xg durante 1 hora y, posteriormente, recoger el sobrenadante y pasar a través de una columna que contiene 600 l de resina de glutatión Sepharose 4B.
- Lavar la columna con 50 ml de tampón de sonicación y junto con 100 ml de tampón de alta concentración de sal (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM y glicerol al 5%) para eliminar las proteínas unidas inespecíficamente. Se eluye la proteína unida con 5 ml de tampón de sal alta que contiene glutatión 40 mM.
- Se dializa la proteína eluida en 2 L de tampón de diálisis con baja glicerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM de DTT y 10% de glicerol) durante 2 horas y después en 20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM TDT y el 70% de glicerol durante 8 horas o toda la noche. Asegúrese de que todos los buffers de purificación son a 4 ° C y efectuar la purificación de proteínas en el cuarto frío para evitar la desnaturalización de las proteínas.
- Descongelar el pellet de células y volver a suspender en 30 ml de tampón de sonicación (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM y 5% de glicerol) y perturbar por sonicación.
3. Péptido matriz metilación
- Pre-incubación del péptido Arrays
- Realizar péptido matriz de metilación ya sea en una caja de tamaño apropiado o en una bolsa de plástico para evitar el desperdicio de enzima y caro AdoMet marcado radiactivamente. Preincubar la membrana péptido matriz en bolsa de plástico sellada que contiene el respectivo búfer metilación sin enzima y etiquetado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. El volumen de tampón depende del tamaño de la matriz, por ejemplo usar 8 ml de tampón de metilación para una matriz de perfil péptido especificidad completa. Optimizar la cantidad y concentración de la AdoMet para cada enzima.
- La metilación del péptido Arrays
- Desechar el tampón de pre-incubación y se incuba la membrana en 8 ml de tampón de metilación que contiene el respectivo PKMT y etiquetado [metil-3H] -AdoMet durante 1 a 2 h.
NOTA: La cantidad de enzima requerida para una reacción de metilación depende de la actividad de PKMT específica, iniciamos nuestros experimentos de cribado típicamente con 50 nM de la aleta de la enzimaconcentración al.
- Desechar el tampón de pre-incubación y se incuba la membrana en 8 ml de tampón de metilación que contiene el respectivo PKMT y etiquetado [metil-3H] -AdoMet durante 1 a 2 h.
- Lavado del péptido Arrays
- Después desechar el tampón de metilación en un recipiente de desechos radiactivos y lavar los arrays de péptidos de 5 veces con 20 ml de tampón que contiene bicarbonato de amonio 100 mM y 1% de SDS durante 5 minutos para eliminar la proteína unida. Deseche el tampón de lavado en un contenedor de residuos radiactivos.
- La detección de la señal radiactiva
- Después de los lavados se incuba la membrana durante 5 min en 10 ml de solución de Amplify (NAMP100V).
- Luego, deseche la solución amplificar en el contenedor de residuos radiactivos para disolventes orgánicos, sellar la matriz péptido en una bolsa de plástico y lo puso en un casete de autorradiografía.
- Coloque la película autorradiografía en la matriz de péptido en el cuarto oscuro. Cierre la bandeja cuidadosamente y exponerlo a -80 ° C durante el tiempo necesario. Luego, el desarrollo de la película para analizar los resultados. Captura de la imagen Pares de veces con diferentes exposition veces para evitar la saturación de los sustratos peptídicos fuertemente metilados.
4. Procesamiento y Análisis de Datos
- Análisis densitométrico de spot Intensidades
- Escanear la película en un escáner convencional y analizar las intensidades de terreno por densitometría. Para ello, utilice un programa comercial ImageJ (que es gratuito) o.
NOTA: Nosotros usamos software Phoretix para esta tarea.
- Escanear la película en un escáner convencional y analizar las intensidades de terreno por densitometría. Para ello, utilice un programa comercial ImageJ (que es gratuito) o.
- Normalización y de promedio de los resultados de diferentes membranas
- Llevar a cabo los experimentos de metilación de matriz péptido al menos por triplicado. Normalizar las intensidades escaneados para cada experimento de extracción de fondo y ajuste de la actividad en un sustrato de referencia 1.0. La media de los datos correspondientes a los puntos individuales y reportarlos como valores medios y las desviaciones estándar.
- Análisis de Datos y Visualización
- Representar gráficamente los datos en 2D usando un esquema de escala de grises o de color para indicar la actividad relativa. Haga esto wiº Excel o Sigmaplot como se muestra aquí. Además, preparar un gráfico de la distribución de las desviaciones estándar de los experimentos repetidos para analizar la calidad de los datos.
- Para comparar y mostrar la precisión del reconocimiento de cada residuo en el péptido sustrato cuantitativamente, calcular la preferencia relativa de la PKMT para cada aminoácido en la posición i x por un factor de discriminación D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Donde v i es la tasa de metilación de la variante de péptido llevar aminoácido en la posición i y x <v j ≠ i> es la tasa media de metilación de los 19 péptidos que llevan un aminoácido diferente j ≠ i en la posición x (incluyendo el secuencia de tipo silvestre).
NOTA: El factor de discriminación definido por esto depende del nivel de fondo. Si sólo un residuo es aceptado en una cierta posición con un fondo de 3%, una discriminaciónse obtiene el factor de 32,3. No preferencia en una posición resulta en un factor de discriminación de 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arrays de péptidos se utilizaron con éxito para caracterizar bioquímicamente la especificidad de PKMTs, y se identificaron varios novela histonas y no histonas sustratos de PKMT por este enfoque 5,16-19. Definir el espectro de sustrato correcto de una PKMT (o cualquier enzima) es un paso esencial para la comprensión de su mecanismo molecular y funciones celulares.
Como un ejemplo de la aplicación del método de matriz de metilación SPOT péptido, se describen los resultados del análisis de la especificidad de la NSD1 PKMT 19. Anterior a nuestro trabajo, esta enzima se describe a metilato varios sustratos, incluyendo la histona H3 en K36 y la histona H4 en K20, sino también el factor de transcripción de la familia p65 NF-kB en K218 y K221. Fig. 4A muestra un ejemplo de una reacción de metilación de una matriz de péptido con NSD1. Para estos experimentos, una matriz de péptido grande basado en el H3 (31-49) secuencia se sintetizó que contiene toda posiblealteraciones de aminoácidos individuales de la secuencia original para probar la significancia de cada aminoácido para la interacción NSD1 y metilación. En total, 380 péptidos se sintetizaron (20 posibles aminoácidos x 18 residuos, más una secuencia H3 original en cada fila). El eje horizontal representa la secuencia del péptido y en la dirección vertical se indica el aminoácido que se altera en el péptido correspondiente. Por ejemplo, el punto en la línea 17 columna 4 contiene una treonina en la tercera posición en lugar de la glicina que está presente en la secuencia de tipo salvaje (Fig. 4A). De tal manera, se generan mutaciones puntuales para probar la preferencia de NSD1 para cada aminoácido nativo en cada posición en el sustrato peptídico. La metilación con NSD1 mostró que actúa específicamente sobre H3K36 y tiene preferencias a cada lado de la lisina objetivo 34-38.
La Figura 4B representa la consolidación de la matriz de metilación de tres péptidosexperimentos con NSD1. La información cuantitativa que fue adquirido de los arrays de péptidos individuales y los resultados se normalizaron y promedió como se describe anteriormente. Las desviaciones estándar de las medias individuales muestran que los datos son altamente reproducible. En general alrededor del 85% de los péptidos más pequeños que muestra SDs 20% y más del 97% de los sustratos peptídicos demostraron SDs menor que 30% (Fig. 4C). Además, también se calculó el factor de discriminación para determinar con precisión la contribución de cada aminoácido en las posiciones probadas. Como se ha descrito proporciona la descripción cuantitativa del péptido leyó y la preferencia de los aminoácidos en la posición específica (Fig. 5A). Nuestros datos muestran que NSD1 prefiere residuos aromáticos en la posición -2 (teniendo en cuenta K36 como la posición 0) (F> Y> G); residuos hidrofóbicos en -1 (I> L> V); residuos básicos en 1 (R> QKNM), donde no se puede tolerar residuos hidrofóbicos o aromáticos; y hydresiduos rophobic en 2 (V> IA> P). En otros lugares (como -3, 3 o 6), NSD1 prefiere algunos aminoácidos, pero se detectó ningún residuo sólido lectura específica.
Sobre la base de este perfil, sustratos potenciales de péptidos novedosos se pueden encontrar mediante búsquedas de bases de datos como el uso de Scansite 20 (Fig. 5B). Estos péptidos se prepararon en una matriz de SPOT incluyendo los controles positivos y negativos y se incubaron con NSD1 y radiactivamente etiquetados AdoMet para identificar el subconjunto de ellos que están metiladas a nivel de péptido (Fig. 5C). Como seguimiento de UPS, las matrices de péptidos se pueden preparar, que incluyen variantes de péptidos, en el que la lisina de destino se sustituye por alanina, para confirmar que la metilación se lleva a cabo en el sitio predicho. Entonces, las proteínas diana o subdominios de ellos contienen la lisina objetivo se pueden producir de forma recombinante y la metilación también probaron a nivel de proteínas. Finalmente, dependiendo de los resultados, el seguimiento de los experimentos puedo nvestigate si la metilación también se produce en las células y que biológica papel que tiene.
Figura 1:. Esquema de la síntesis de péptidos por el método SPOT sobre membrana de celulosa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Ejemplo de una matriz de péptido teñido con azul de bromofenol para confirmar la síntesis de péptidos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Figura 3: Esquema del experimento péptido matriz metilación; arrays de péptidos se metilado por incubación con PKMT y etiquetados [metil- 3 H] -AdoMet en un tampón apropiado. Posteriormente la radioactividad transferida a cada punto se detecta por autorradiografía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de resultados obtenidos con el NSD1 PKMT A) Ejemplo de una matriz de péptido especificidad de sustrato para NSD1 usando el (31-49) secuencia como molde H3.. El eje horizontal representa la secuencia de H3 y el eje vertical representa los aminoácidos por la que se muta la fila correspondiente. La primera fila contiene péptidos consecuencia original. B) La consolidación de los resultados de 3 experimentos independientes array péptido de metilación con NSD1, los datos se promediaron los resultados de los tres experimentos después de la normalización. C) Distribución de los errores estándar para los datos de metilación promedio que se muestran en el panel B. Reproducido de Kudithipudi et al., (2014) con algunas modificaciones 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. El descubrimiento de nuevos sustratos PKMT A) factores de discriminación de NSD1 para el reconocimiento de residuos de aminoácidos en las posiciones junto a la lisina objetivo (K36 En el experimento mostrado aquí). Los datos muestran que NSD1 prefiere residuos aromáticos en el -2 pOSICIÓN (considerando K36 como posición 0). Residuos hidrofóbicos se registran por el -1 y 2 posiciones, aunque con diferencias distintivas en detalles. En el sitio 1 se prefieren residuos básicos y amidas. En otros sitios se detectó algunas preferencias débiles, pero ningún residuo sólido lectura específica. B) Captura de pantalla de un ejemplo de búsqueda en Scansite, utilizando el perfil de especificidad determinada para NSD1. C) variedad de péptidos SPOT contiene varias novedades, predicho NSD1 sustratos junto con positivo (H3K36 ) y controles negativos (H3K36A). Algunos de los nuevos objetivos hendidas fueron fuertemente metiladas (algunos de ellos anotados), en otros casos, las predicciones no pudieron ser verificados. Panel A y C se reproduce desde Kudithipudi et al. (2014) con algunas modificaciones 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Base | 1 M Oxyma puro en NMP -> 2,13 g Oxyma pura en 15 ml de NMP |
| Activador | 2,4 ml de N, N -Diisopropylcarbodiimide 'en 15 ml de NMP |
| Mezcla de límite | 20% de anhídrido acético en DMF -> 6 ml de anhídrido acético en 30 ml de DMF |
| La desprotección Fmoc | 20% de piperidina en DMF -> 200 ml en 1000 ml de DMF |
| La desprotección de la cadena lateral | 900 l triisopropilsilano + 600 l ddH2O en 30 ml de TFA |
| La tinción | 0,02% de azul de bromofenol en DMF |
Tabla 1: mezclas químicas y su composición utilizada en el protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Síntesis SPOT como se describe aquí es un poderoso método para asignar sitios de interacción proteína-proteína e investigar el reconocimiento de sustrato de enzimas peptídicas modificar. Sin embargo, la síntesis SPOT todavía tiene ciertos inconvenientes, porque aunque se informó de los péptidos sintetizados por el método SPOT tener más de 90% de pureza 21 esto es difícil de confirmar en cada caso. Por lo tanto, los resultados tienen que ser reproducida por otros métodos, por ejemplo, el uso de dominios de la proteína o con péptidos purificados sintetizados por métodos estándar. Además, otro inconveniente importante de arrays SPOT es que la mayoría de tiempo no pueden ser reutilizados para llevar a cabo varios ensayos con una sola matriz.
Para aumentar la eficiencia de la síntesis con aminoácidos de baja estabilidad, como la arginina protegida, es importante para hacerlos fresca por cada 5 ciclos. En las reacciones enzimáticas o estudios de unión a proteínas que se observa a menudo que la periferia de la mancha péptido tiene more intensidad de la señal que el centro ("efecto de la mancha anular"). Este efecto puede ser debido a la alta densidad de péptidos en la parte central de la mancha y entonces puede ser resuelto por reducción de escala de la síntesis del péptido 22. Para mayor resolución de problemas de síntesis de péptidos manual de la máquina y servicio de la compañía debe ser consultado. Si no se observó metilación, péptidos de control positivo (es decir, péptidos conocidos por ser metilado por la enzima objeto de investigación) deben añadirse a la membrana.
Suplente de arrays SPOT, péptidos de alta densidad micro arrays 23 están disponibles, pero son más caros y requieren un equipo especial para el uso. Además, la cantidad de péptido por spot es menor, lo que requiere procedimientos de lectura más sensibles. Arrays de proteínas también están disponibles para estudiar estas funciones 24,25, pero son más difíciles de preparar, ya que cada proteína individual necesita ser expresada y purificada yel plegamiento de proteínas en la matriz debe ser mantenido. Una ventaja adicional de las matrices de péptidos es la posible introducción de modificaciones posteriores a la traducción durante la síntesis y la facilidad de las pruebas mutacional de las funciones de los residuos de aminoácidos individuales.
Es un punto de partida esencial para este protocolo, para tener al menos un péptido identificado, que está metilado por la enzima objeto de investigación. Condiciones de metilación y tampones tienen que ser optimizado, así como la concentración de la metiltransferasa. Cursos de tiempo ejemplares de metilación se han determinado para evitar la metilación completa de la mejor sustrato, lo que provocará la pérdida de rango dinámico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
