Neuroscience

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52204

Tobias Ruck¹, Stefan Bittner^1,2, Lisa Epping¹, Alexander M. Herrmann¹, Sven G. Meuth^1,3

¹Department of Neurology, University of Münster, ²Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, ³Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

Introduction

monolayers צורת כלי דם במוח בתאי האנדותל (BMEC) שמהווה חלק בלתי נפרד של מחסום הדם-המוח-מחסום מאוד מיוחד (BBB). BMECs הם מחוברים על ידי חלבוני junctional המצורפים קרום במרתף. יחד עם pericytes, תאי שריר חלק, רגלי סוף astrocytic ותאי דם במחזור הם לבנות את היחידה שנקרא עצבים וכלי הדם (NVU) ^1. נגד הרעיון הקודם של מחסום בלתי חדיר בין העצבים-המערכת-המרכזית (CNS) בדם ו, NVU הוא ממשק דינמי, מאוד ספציפי ופיקוח השולט על המעבר של נוזלים, מולקולות ותאים בין כלי דם במוח ומערכת העצבים המרכזיים ² . תפקוד לקוי או חוסר ויסות של NVU עשוי ליזום ו / או לתרום למגוון רחב של עצבים וכלי דם, מחלות זיהומיות, דלקתיות או ניוונית של מערכת העצבים המרכזית, כגון שבץ איסכמי, HIV-אנצפלופתיה, טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון ^3-6 באלצהיימר או ב.

_content "> monolayer BMEC הוא סגור היטב על ידי מורכב junctional היווה של הדוק (TJ) וadherens צמתים ^7. ההתנגדות החשמלית הגבוהה וחדירות paracellular הנמוכה של BBB (AJ) מבוססים בעיקר על חלבוני TJ ^8. TJS הם מתחמים שהוקמו על ידי החלבונים הטרנסממברני של משפחת claudin וoccludin, שהנם צמודים לשלד התא של תאי האנדותל על ידי מולקולות מתאם, כגון zonulaoccludens (ההסתדרות הציונית) חלבוני ZO1-3 ^4. צמתים Adherens בעיקר שנאספו על ידי חלבון הקרום נפרד -cadherin כלי דם האנדותל (VE), אשר קשור לשלד התא באמצעות catenins ^8.

האיטום ההדוק של BBB מונע מעבר חופשי של מצעים ותאים בין הדם לCSF. יוצאים מכלל זה הם מולקולות lipophilic, קטנות עם משקל מולקולרי <400 Da, אשר מסוגל לחצות את BBB על ידי דיפוזיה בתיווך שומנים ^9. המעבר של גדולים ו / אומולקולות הידרופילי, כגון גלוקוז, חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים ותרופות רבות מוגבלת למערכות מבוקרות מאוד transcellular תחבורת ^10, אשר יכול להיות מסווגת לחמש קטגוריות עיקריות: תחבורה בתיווך מוביל, הובלת יון, תחבורת זרימה פעילה, קולטן בתיווך תחבורה, ותיווך caveolae תחבורה ^4. מערכות טרנספורטר אלה מסייעים לשמור על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית, אשר נדרש עבור דור אות מדויק, התמרה ואינטגרציה. יתר על כן, BMECs מסוגל לשלוט באופן פעיל את המעבר של מולקולות שונות על ידי הביטוי של מגוון רחב של ectoenzymes. אנזימים אלה הם נקודות על פני התא ולשנות מצעים במשק ומחוצים ספציפיים פוגעים או מאפשרים את המעבר של ¹¹ BBB.

ואילו מערכת העצבים המרכזית נחשבת כאיבר חיסוני הרשאות לזמן ארוך, ממצאים חדשים מורים על מערכת ולא דינמית וחזק מוסדרת של surv חיסוניeillance של מערכת העצבים המרכזית. BMECs מעורב באופן ביקורתי ברגולציה של גלגול תא חיסוני. על ידי הביטוי של selectins על הלימפוציטים משטחם באופן סלקטיבי מושרה לצרף לאנדותל באופן רופף. הפרשת כמוקינים שנתקלים עם קולטן ספציפי על כדוריות דם לבנות מובילה לביטוי או שינויי קונפורמציה של integrins ויקוציטים, כגון LFA-1 (פונקצית הלימפוציטים קשור אנטיגן-1) וVLA-4 (אנטיגן-4 מאוד מאוחר). Integrins לתווך הידבקות חברה באמצעות קשירת counterreceptors אנדותל, למשל VCAM-I (מולקולת הידבקות תא וכלי דם),-אני ICAM (מולקולת הידבקות אינטר) המאפשר הגלגול לתוך parenchyma המוח בין אם באמצעות BMECs של ^12-14 BBB. אלה וממצאים אחרים מדגישים את התפקיד הפעיל של האנדותל עצמו בהסדרת נדידת תאים חיסונית.

יתר על כן, BMECs כחלק מNVU מעורב בוויסות של זרימת דם המוחי linked לדרישות המטבוליות עצביות מקומיות. על גירוי astrocytic תאי האנדותל לייצר חומרי vasoactive כגון תחמוצת חנקן שמובילה להרפיה של תאי שריר חלק בכלי דם ^15.

אנגיוגנזה ונוירוגנזה בפיתוח, כמו גם בדפוסים מקבילים תכנית המוח הבוגרת ופיתוח ולשתף את נכסים רבים של רגולציה ^{1, 4.} תאי האנדותל מעורבים באופן ביקורתי בתהליכים אלה ^{16, 17.}

לסיכום, BMECs מספק תכונות חיוניות כדי להצדיק פיתוח ותפקודה תקין של מערכת העצבים המרכזית. תפקוד לקוי של BBB קשור להפרעות רבות נוירולוגים חמורות. עם זאת, רק מעט מאוד מטרות זוהו בממשק המוח-כלי דם לטיפול ספציפי ויעיל ^18. פשוט במודלים חוץ גופית היה בשימוש כדי להבין את המנגנונים מעורבים בתפקוד ורגולציה של מערכות פיזיולוגיות מורכבות עבור loזמן ng. הבידוד כפי שתואר על ידי כתב היד הזה והמחקר במבחנה של BMECs העכברי, בהתחשב במגוון הרחב של נוקאאוט-זני עכבר ספציפי, עשוי לספק הבנה נוספת של פונקצית BBB ורגולציה בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological פתיחת אפיקים טיפוליים חדשים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הרשויות המקומיות ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; רקלינגהאוזן, גרמניה") ומתנהלים על-פי החוק הגרמני של הגנה על בעלי חיים.

1. הערות כלליות לניסויים בעכבר

לבצע את כל הניסויים באמצעות עכברים בהתאם להנחיות הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהתאמה.
שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ותאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים.
השתמש בעכברים לגיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי בגלל מאפיינים ביולוגיים יכולים להשתנות עם גיל ומין.
ככל שניתן לנסות ולצמצם, לחדד או להחליף ניסויים בבעלי חיים.

2. הכנת שיפוע Percoll

לערבב 19 מיליליטר של 1x PBS עם 1 מיליליטר 10x PBS, 1 FCS מיליליטר ו -10 מיליליטר Percoll.
בצע STEלהרגיז סינון בצינור זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת תא האנדותל בינוני והציפוי של צלחות תרבית תאים

בינוני תא האנדותל:
1. הכנת 500 מיליליטר בינוני: (. כ -20%) מערבבים 400 מיליליטר DMEM בינוני (. כ 80%) עם 100 PDS מיליליטר, 0.25 ml bFGF (. 20 מיקרוגרם / מיליליטר; כ 0.05%), 0.5 מיליליטר הפרין (100 μl / מיליליטר;. כ 0.1%) ו -0.5 מיליליטר pyrumycin (4 מ"ג / מיליליטר;. כ 0.1%). להוסיף pyrumycin רק למדיום תרבות תא בשימוש ב2 הימים הראשונים של התרבות.
2. בצע סינון סטרילי בתוך שפופרת זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
ציפוי של צלחות תרבית תאים:
1. ל1 מיליליטר של תמיסת ציפוי, להכין פתרון של DDH 500 μl ₂ O, 400 IV μl קולגן (0.4 מ"ג / מיליליטר) ו -100 μl פיברונקטין (0.1 מ"ג / מיליליטר).
2. מכסה את פני השטח של EAC כלגם שעות של צלחת תרבית תאים עם פתרון הציפוי. אחסן את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.

4. בידוד של תאי האנדותל Murine מוח כלי הדם (MBMEC)

להקריב 10 עכברים בוגרים (8-12 שבועות, C57BL / 6) נקע בצוואר רחם. לאחר מכן לבודד את העכבר-המוח וחנות ב 5 מיליליטר של PBS (אזהרה:! עבודה סטרילית).
הסר מוח נובע, cerebella וthalami עם מלקחיים. לנתק את קרומי המוח על ידי גלגול בזהירות את מוחם על נייר סופג סטרילית. לאסוף forebrains קרומי המוח-חופשיים.
העבר את המוח לצינור 50 מיליליטר פלקון המלא 13.5 מיליליטר של DMEM.
לרכך את הרקמה, ראשון עם טפטפת 25 מיליליטר, ולאחר מכן עם פיפטה 10 מיליליטר עד התקשורת הופכת להיות חלבית.
אז לעכל את הרקמה בתערובת של 0.6 collagenase CLS2 מיליליטר (10 מ"ג / מיליליטר בDMEM) ו0.2 מיליליטר DNAse (1 מ"ג / מיליליטר PBS) בDulbecco של הנשר בינוני (DMEM) השתנה עבור שעה 1 ב 37 ° C על מסלול לנערr ב 180 סל"ד.
להוסיף 10 מיליליטר של DMEM מתווסף ההשעיה ו צנטריפוגות רקמת התאים XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
supernatant בטל (אזהרה:! הגלולה היא קלה לאבד)
כדי להסיר את המיאלין, resuspend את הכדור עם טפטפת 25 מיליליטר ב -25 מיליליטר של BSA-DMEM (20% w / v) (כ. 25 פעמים), ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
מחק את השכבה העליונה המיאלין (החלבית) עם פיפטה פסטר זכוכית שבורה בקוטר גדול יותר, ולאחר מכן למחוק את שכבת BSA עם פיפטה פסטר נורמלית.
Resuspend גלולה ב9 מיליליטר DMEM ולהוסיף 1 מיליליטר collagenase / dispase (ריכוז סופי הוא 1 מ"ג / מיליליטר) ו -0.1 מיליליטר DNAse. לעכל את הפתרון עבור שעה 1 ב 37 ° C על שייקר מסלולית ב 180 סל"ד (אזהרה: לא להשתמש בפיפטה resuspend - יכולים ללכת לאיבוד תאים).
במהלך העיכול, צנטריפוגה פתרון Percoll להקים שיפוע הצפיפות באמצעות ultracentrifuge ב3,000 XG עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס, עם ההאצה, wiבלם thout.
להוסיף 10 מיליליטר של DMEM להשעית התא מתעכלת. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. ואז להשליך את supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מיליליטר של DMEM.
הוסף את תאי resuspended בזהירות על גבי שיפוע Percoll ו צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות ב 4 ° C, ללא האצה ובלימה. הערה: התאים גלויים כענן בשלבי הביניים.
קח כ. 12 מיליליטר של שלבי ביניים עם תאים בעזרת מחט סטרילית ארוכה ולמקם אותו ב-50 מיליליטר פלקון חדש עם 5 מיליליטר של DMEM.
צנטריפוגה התאים שוב XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן resuspend גלולה במדיום תא האנדותל (השתמש כ. 0.2 מיליליטר של מדיום לסנטימטר 1 ² פני השטח של צלחת תרבית תאים).
הסר פתרון ציפוי מצלחות תרבית תאים מצופים (ראה שלב 3.2) ולשטוף היטב כל עם PBS סטרילי בשני שלבי שטיפה ברציפות.
לשמור על תרביות תאי אנדותל במדיום סלולארי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור סטרילי. לשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. פיצול תאים בנקודת מפגש של 90%.

Representative Results

מייד לאחר בידוד, BMECs העכברי ותאים לזהם ליצור קונגלומרטים צף במדיום תרבות תא (איור 1 א, יום 0). הטיפול בpyrumycin מוביל לבחירה של BMECs העכברי שכן הם מבטאים רמות גבוהות של מובילים בזרימת כגון P-גליקופרוטאין מוביל להתנגדות ביחס לרעלים. תאי זיהום הם הרבה יותר רגישים לpyrumycin cytotoxicity תיווך ^19. במהלך התהליך של בחירת pyrumicin, תאים מזהמים להיכנס מוות של תאים אפופטוטיים או נימקי, ואילו MBMECs מתחיל לצרף לקולגן IV / צלחות פיברונקטין מצופה תרבית תאים (איור 1 א, 1 היום ויום 2). עד שהיום 5, MBMECs להתרבות לצפיפות של כ. 80-90%. הם מאופיינים במראה האופייני דמוי כישור. בנקודת מפגש, הם יוצרים monolayer של תאי קשר עכבות שאינן חופפים צפופים, מיושר אורכית ו( איור 1 א, יום 5). על ידיבחירת pyrumicin, טוהר גבוה של עד 99% MBMEC הוא הגיע, כפי שהודגם על ידי סמן אנדותל תאי CD31 (PECAM1; איור 1). MBMECs יוצר בחוזקה monolayers האטום מחובר על ידי חלבוני צומת הדוקים. אחרי 7 - 8 ימים של תרבות, שכבות תאי אנדותל לבנות את הערכים יציבים להתנגדות חשמלית (לכת ערכים טיפוסיים בין 20-30 Ω x ² _{סנטימטר).} והקיבול (איור 1 ג ') בנקודת זמן זו מבחני תפקודיים כגון תאי ד' ניסויי הגירה ^{3, 20,21} וחדירות בדיקות, למשל עם אוונס כחול או Dextran, יש לבצע.

איור 1. מורפולוגיים ומאפיינים פונקציונליים של Murine BMECs. (א) במהלך BMECs התרבותי שנצפה על ידי מיקרו אור שידור בזמן הנציגscopy מעל 5 ימים. סרגל קנה מידה חל על כל התמונות. מכתים immunofluorescence (ב ') לCD31 סמן תא אנדותל ביום 5. CD31 (ירוק) ו DAPI (כחול). תאים (ג) היו precultured במשך 5 ימים ולאחר מכן הועברו למערכת אוטומטית ל ניתוח של מאפייני biophysical (התנגדות וקיבוליות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

תפקוד לקוי של דם למוח-מכשול הוא סימן היכר של מחלות של מערכת העצבים המרכזית מזיקות שונות, למשל פירוט של BBB בטרשת נפוצה באופן נרחב מאפשר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תאי מערכת חיסון אוטוריאקטיבים ומאפשר מפגש והרס של oligodendrocytes. בשבץ איסכמי שיבוש BBB והיווצרות הבאה של בצקת במוח הם גורמים קריטיים המשפיעים על צמיחת אוטם משנית וההישרדות הכוללת של חולים ^6. יתר על כן, על ידי שינויים של BBB באזורים מרוחקים נגעים איסכמיים מוקד יכולים לגרום לשינויים פונקציונליים נרחבים של המוח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס הם במידה רבה לא ידועים ^5. בניגוד לכך, הצפיפות הגבוהה והמגוון של מובילים בזרימת בBMECs הפונקציונלי מפחיתים את הריכוז של תרופות מועילות כגון chemotherapeutics לממאירויות מוח או אנטיביוטיקה לטיפול במחלות זיהומיות. לכן, הבנה עמוקה יותר של הדם-המוח-ברRier לתפקד בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological נדרש לפתח סוכנים תרופתיים שמסוגלים לווסת באופן ספציפי את תפקוד המחסום בכיוון המועדף ^21. אמין במודלים חוץ גופית של BBB הם כלים הכרחיים כדי לחקור את מנגנוני הרגולציה בBBB.

שורות תאי אנדותל המוח הונצחו רבות הוקמו והועסקו כבמודלים חוץ גופית BBB ^22. שורות תאים אלה מציעים יתרונות מסוימים על פני BMECs העיקרי כפי שהם גדלים מהר יותר ולשמור על מאפייני BBB מסוימים על פני מספר קטעים. עם זאת, שורות תאי אנדותל לא יכולות להחליף באופן מלא לתאים ראשוניים תכונות חשובות כמו משתנות שמתערבבים עם אפשרות ההעברה של ממצאים ניסיוניים למצב in vivo. לדוגמא, שורת תאי אנדותל מוח העכברית bEnd.5 מבטא רמות נמוכות רק של חלבוני צומת הדוקים מופצים discontinuously המוביל לגבוה paracחדירות ellular ^23. BEnd.3, עוד שורת תאים המשמשת לעתים קרובות עכברית אנדותל המוח, מדגימה צמתים צפופים ורציפים מופצים הדוקים, התנגדות Transendothelial גבוהה, כמה מובילים בזרימת וחדירות paracellular נמוכות. עם זאת, שכבות תאי bEND.3 לעומת BMECs העיקרי חסרות אפליה של ממש ביחס לחלחול של transcellular מסוים ומצעי paracellular ^24.

בהכנות של תרביות תאים ראשוניות, תאי זיהום יכולים להפריע באופן משמעותי עם התוקף של ממצאים ניסיוניים. בפרוטוקול המתואר, pyrumicin משמש כסוכן סלקטיבית לתאי אנדותל כדי להשיג טוהר גבוה. עם זאת, בקרת איכות רגילה של תרבית התאים נחוצה באופן בלתי נמנע להבטחת לניסויים אמינות. ישנן מספר שיטות לבקרת איכות, חוץ ממאפיינים טיפוסיים מורפולוגי של תאי האנדותל (ראה איור 1 א '), transendotheliaהתנגדות l עשויה להימדד או הביטוי של סמן תא אנדותל כגון CD31 (ראה איור 1) או גורם פון Willebrand (vWF) עשוי להיות מוערך.

מספר תאי אנדותל מוח המבודדים ממוח עכבר אחד הוא יחסית נמוך ולהגדיר את תרבות תאים תקינה לניסויים רבים, מוחם של כמה עכברים צריך להיות ויקווה. מניסיוננו, לפחות 10 עכברים צריכים לשמש לניסוי אחד שעשויה להיות גורם מגביל בהתאם למשאבים של מתקן בעלי החיים בהתאמה. כדי למנוע הטיה או גורמים מבלבלים, עכברים רק עם רקע גנטי וסביבתי זהה יש ייקוו. בניגוד לכך, שור והכנות תא אנדותל המוח חזיריות מספקים מספר רב של תאי האנדותל פנוי במוח במוח אחד. עם זאת, מלבד הרבייה לא מסובכת ודיור, רפרטואר הרחב והולך וגובר של עכברים הטרנסגניים זמינים הופך עכברי העיקרי BMECs כאידאלמודל ללמוד לתפקד דם-המוח-גדר.

כמה ממצאים מרכזיים הנוגעים לתפקידי BBB והמנגנונים המולקולריים שבבסיס הגיעו ממחקרים במערכות תרבית רקמת 2D. לאחרונה, מערכות תרבות 3D פותחו ^25, שבו תאי אנדותל ממוקמים בתוך מטריצת הקולגן המאפשרת להם ליצור לום ורשתות צינורי. מערכות תרבית תאים החדשות אלה מאפשרים לעוד יותר מדויקים רבייה של תהליכים וכלי דם באורגניזם שלם in vivo. מעורבותם של תאים נוספים של מערכות תרבית תאי NVU ב3D, כגון pericytes והאסטרוציטים עשויה לחולל מהפכה לומדת בתפקוד דם-מוח-מחסום במבחנה; לאחרונה דגמים הראשונים פותחו ^26.

יש כמה המלצות לפתרון בעיות. קודם כל העבודה סטרילית הוא חיוני לאיכות של תרבית תאי אנדותל. שנית, pyrumycin יש להוסיף רק לתאהתרבות בינונית המשמש ב2 הימים הראשונים של תרבות, יישום עוד עלול להוביל למוות מוגבר MBMEC תא ותפקוד מחסום באיכות נמוכה. שלישית, יש להשתמש באנזימים המיושמים בפרוטוקול זה ומאוחסנים בהתאם להוראות היצרן; אחרת התפקוד התקין שלהם עלול להיות בסכנה. יתר על כן, הציפוי של צלחות תרבית תאים עשוי להיות מתוקן אם תאי האנדותל אינם מייחסים. ריכוזים של פיברונקטין וקולגן עשויים להיות שונה או חלבוני מטריצה אחרים עשויים להתווסף לפתרון הציפוי. לבסוף, גיל, מין, עונה של השנה והתנאים סביבתיים במתקן בעלי החיים הם גורמים חשובים שעשויות להשפיע על איכות בידוד MBMEC וההשוואתיות של ניסויים. יש להבטיח כי תנאים דומים בין ניסויים בלתי תלויים.

הפרוטוקול המתואר צריך להיחשב כשיטת neuroimmunological בסיסית לבודד BMECs העכברי. התאים המבודדים יכולים להיות uSED למגוון רחב של יישומים, כדי להעמיק לתוך פונקצית BBB, כגון מבחני הגירה, גן ומחקרי ביטוי חלבון, הערכות אלקטרו או ניסויי חדירות. כאמור לעיל, מערכות תרבית תאי 3D של BMECs עשויות לספק הזדמנויות חדשות לחקור את המנגנונים המורכבים מעורבים בוויסות של BBB בהקשר של NVU. לכן, הבידוד של תאי האנדותל עיקריים יישאר טכניקה לא יסולא בפז בתחום מחקר BBB בעתיד.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר (IZKF) מינסטר הקליני (SEED 12/03, SB), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), תאים-בתנועה האשכול של אקסלנס (1003 EXC - CIM), אוניברסיטת מינסטר (לSB וSGM) ועל ידי קרונה-Fresenius-Stiftung השאר (2012_A88 לSB וSGM). אנו מודים ליקה בלום לאיורים מעולים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture