Neuroscience

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52204

Tobias Ruck¹, Stefan Bittner^1,2, Lisa Epping¹, Alexander M. Herrmann¹, Sven G. Meuth^1,3

¹Department of Neurology, University of Münster, ²Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, ³Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

Introduction

高度に専門化血液脳関門（BBB）の一部である脳微小血管内皮細胞（BMEC）フォームの単層。 BMECsは基底膜に付着し、接合部タンパク質によって相互接続されている。一緒に周皮細胞、平滑筋細胞、星状細胞エンドフィート、それらは、いわゆる神経血管単位^{（NVU）1を}構築循環する血液細胞と混合する。血液および中枢神経--系（CNS）との間に不透過性バリアの以前の概念に対して、NVUは脳血管およびCNS ²の間の流体、分子および細胞の転移を制御し、動的な非常に特異的で、安定化インタフェースです。 NVUの機能不全または調節不全は、開始および/ または虚血性脳卒中、HIV-脳症、多発性硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病など^3-6 CNSの神経血管、感染性、炎症性または変性疾患、種々のに寄与し得る。

_content "> BMEC単層が緊密に接合部複合体により封止されているタイト（TJ）から構成され、接合（AJ）をアドヘレン^7。高い電気抵抗とBBBの低い傍細胞透過性は、主にTJ蛋白質⁸に基づいています。のTJであるこのようzonulaoccludens（ZO）タンパク質などのアダプター分子によって内皮細胞の細胞骨格に連結されているクローディンとオクルディンファミリーの膜貫通タンパク質によって形成された複合体ZO1-3 ⁴アドヘレン接合は、主に内在性膜タンパク質によって組み立てられる。カテニン⁸を介して細胞骨格にリンクされている血管内皮（VE）カドヘリン、。

BBBの密封は、血液およびCSFの間で基板および細胞の自由な交換を防ぐことができます。この規則の例外は、脂質媒介拡散⁹によってBBBを横切ることができる分子量<400 Daの、親油性、小分子である。より大きいおよび/または通路例えば、グルコース、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および多くの薬剤のような親水性分子は、5つの主要なカテゴリーに分類することができる、高度に制御された経細胞輸送システム¹⁰に限定される：担体輸送、イオン輸送、能動排出輸送、受容体媒介輸送、およびカベオラ媒介輸送^4。これらの輸送体系は、正確な信号の生成、形質導入および統合のために必要とされるCNSの恒常性を維持するのに役立ちます。また、BMECsも積極ectoenzymes、様々の発現により明確な分子の遷移を制御することができる。これらの酵素は阻害しまたはBBB ¹¹の移行を可能にする特定の内因性および外因性の基質を細胞表面に局在し、変更されている。

CNSは、長い時間のための免疫特権臓器と考えられたのに対し、最近の知見は、免疫survのではなく、ダイナミックで厳密に調節システムを提案CNSのeillance。 BMECsは決定的に免疫細胞の遊走の調節に関与する。その表面リンパ球上のセレクチンの発現によって選択的に緩く内皮に付着するように誘導される。白血球上の特異的受容体との遭遇ケモカインの分泌は、式またはそのようなLFA-1などの白血球インテグリンのコンホメーション変化をもたらす（リンパ球機能関連抗原-1）およびVLA-4（非常に遅く抗原4）。インテグリンは、間に、またはBBB ^12-14のBMECsを通して脳実質内への遊出を可能にするそれらの内皮counterreceptors、 例えば VCAM-I（血管細胞接着分子）、ICAM-I（細胞間接着分子）を結合することにより、強固な接着を媒介する。これらおよび他の知見は、免疫細胞の遊走の調節における内皮細胞自体の積極的な役割を強調する。

さらに、BMECs NVUの一部が脳血流liの調節に関与しているよう地元のニューロンの代謝要求にnked。星状細胞の刺激内皮細胞に血管平滑筋細胞の弛緩¹⁵に至る酸化窒素などの血管作動性物質を産生する。

開発において、ならびに成体の脳を示し平行パターニングおよび開発における規制^1,4の多くの特性を共有し、血管新生および神経発生。内皮細胞は、これらのプロセス^16,17に決定的に関与している。

要約すると、BMECsは、CNSの適切な発達と機能を保証するために不可欠な機能を提供する。 BBBの機能不全は、多くの重篤な神経疾患にリンクされています。しかし、ごく少数の標的は、特異的かつ効率的な治療の¹⁸脳血管系界面において同定されている。 in vitroモデルは、簡略化のために見よ機能と複雑な生理的システムの調節に関与するメカニズムを理解するために使用されているngの時間。分離は、この原稿と特定のマウスノックアウト-株の様々な特定のネズミBMECs のin vitro研究により記載されるように、新たな治療の道を開く生理学的および病態生理学的条件下で、BBB機能および調節のさらなる理解を提供するかもしれない。

Protocol

全ての動物実験は、地方当局（ "; Fachbereich 87、Tiergesundheit、Tierschutz、LandesamtfürNatur、環世界ウントVerbraucherschutz NRWレックリングハウゼン、ドイツ"）によって承認されたと動物愛護のドイツの法律に基づいて実施しました。

マウス実験1.一般的なコメント

それぞれの施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従ってマウスを使用して、すべての実験を行う。
病原体を含まない条件下でマウスを維持し、食物および水を自由にアクセスできるようにすることを可能。
生物学的特性は、年齢や性別に応じて変化することができますので、実験群における年齢および性別をマッチさせたマウスを使用してください。
可能な限り動物実験を減らす洗練または交換してみてください。

パーコール勾配の調製

1ミリリットル10倍のPBS、1ミリリットルFCSおよび10ミリリットルのパーコールでの1X PBS 19ミリリットルを混ぜる。
サントを行うガラス管（：0.2μmのフィルター孔の直径）でろ過をrile。その後、4℃でソリューションを保存します。

内皮細胞培地および細胞培養プレートのコーティングの調製

内皮細胞培地。
1. 500mlの培地の調製：（約20％）を100mlのPDSを400ミリリットルDMEM培地（約80％）のミックスを0.25 mlのbFGF（20μg/ mlの、約0.05％）、0.5 mlのヘパリンを（100μl/ウェルmlであり、約0.1％）、0.5mlのpyrumycin（4 mg / mlの、約0.1％）。唯一の培養の最初の2日間において使用される細胞培養培地のためpyrumycin加える。
2. ガラス管（：0.2μmのフィルター孔の直径）で無菌濾過を行う。その後、4℃でソリューションを保存します。
細胞培養プレートのコーティング：
1. コーティング液1mlについては、500μlののddH ₂ O、400μlのコラーゲンIV（0.4 mg / ml）で100μlのフィブロネクチン（0.1mg / mlの）の溶液を調製する。
2. EACの全面を覆うコーティング溶液を用いて細胞培養プレートの時間十分。 4℃で一晩プレートを保管してください。

マウス脳微小血管内皮細胞（MBMEC）の4.絶縁

頚椎脱臼により - （12週齢、C57BL / 6〜8）10成体マウスを生け贄に捧げる。その後5mlのPBSでマウスの脳や店舗を隔離（警告：！仕事無菌）。
鉗子で脳茎、小脳や視床を削除します。慎重に滅菌吸取紙の上に脳を転がすことによって髄膜を取り外してください。その結果髄膜フリー前脳を収集します。
DMEMを13.5ミリリットルで満たされた50ミリリットルファルコンチューブに脳を転送します。
メディアが乳白色になるまで、10ミリリットルピペットで、最初の25ミリリットルピペットで、組織をミンチ。
そして、軌道上で37℃で1時間インキュベートしたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）0.6 mlコラゲナーゼCLS2た（10mg / mlのDMEM中で）0.2mlのDNアーゼ（PBS中1mg / ml）との混合物で組織を消化振る180 rpmでR。
DMEM 10 mlを加え、4℃で10分間、組織懸濁液を遠心1,000×gで細胞を添加した。
上澄みを捨てる（警告：ペレットが失うものは簡単です！）
ミエリンを削除するには、25ミリリットルのBSA-DMEM（約25倍）（20％w / v）の25mlのピペット、および4℃で20分間千×gで遠心分離してペレットを再懸濁します。
大径の割れたガラスパスツールピペットを用いて、上側ミエリン層（乳白色）を破棄し、その後、通常のパスツールピペットで、BSA層を捨てる。
9ミリリットルDMEM中でペレットを再懸濁し、1mlのコラゲナーゼ/ディスパーゼを0.1mlをDNA分解酵素（最終濃度を1mg / mlである）を追加します。 180 rpmでオービタルシェーカー上で37℃で1時間のためのソリューションのダイジェスト（警告を：再懸濁するためにピペットを使用していない - 細胞が失われる可能性があります）。
消化中に、加速度、のWiで、4℃で1時間3000×gで超遠心機を用いた密度勾配を設定するためにパーコール液を遠心ブレーキthout。
消化された細胞懸濁液にDMEMを10ミリリットルを追加します。遠心機で4℃で10分間千×gでサスペンション。その後、上清を破棄し、DMEMを2mlにペレットを再懸濁。
加速とブレーキなしで4℃で10分間700×gでパーコール勾配遠心の上に慎重に再懸濁した細胞を追加します。注：細胞が間期におけるクラウドとして表示されます。
約取る。長い滅菌針で細胞と間期の12ミリリットルのDMEM 5mlで新しい50ミリリットルファルコンに配置します。
4℃で10分間千×gで再び細胞を遠心します。その後（約使用。細胞培養プレートの媒体1単位cm ²面0.2 ml）を内皮細胞培地中でペレットを再懸濁する。
コーティングされた細胞培養プレートからコーティング溶液を除去し（ ステップ3.2参照）と、2つの連続した洗浄工程において、滅菌PBSで各ウェルすすぐ。
内皮における細胞培養を維持する細胞を37℃で培地および滅菌インキュベーター内で5％CO _2。 2〜3日ごとに培地を変更してください。 90％コンフルエンスで細胞を分割します。

Representative Results

単離直後、マウスBMECsと混入細胞は、細胞培養培地（ 図1A、0日目）に浮遊集塊を形成する。彼らはそのような毒素の相対抵抗をもたらすP-糖タンパク質のような排出トランスポーターの高レベルで発現するのでpyrumycinによる治療は、マウスBMECsの選択につながる。混入細胞媒介性細胞傷害¹⁹ pyrumycinはるかに受けやすい。 MBMECsはコラーゲンIV /フィブロネクチンコーティングした細胞培養プレート（ 図1A、1日目と2日目）にアタッチし始めるのに対し、pyrumicin選択の過程で、混入細胞は、アポトーシスまたは壊死性細胞死を入力してください。 5日目までは、MBMECsはおよその密度に増殖する。 80から90パーセント。これらは、典型的な紡錘状の外観によって特徴付けられる。合流で、彼らは密集し、長手方向に整列し、非重複接触禁止細胞（ 図1A、5日目）の単層を形成する。バイ（; 図1B PECAM1）は、内皮細胞マーカーCD31によって実証されるようにpyrumicin選択、最大99％までMBMECの高純度が達成される。 MBMECsはしっかりとタイトジャンクションタンパク質によって相互接続された密封された単分子層を形成する。培養8日後、内皮細胞層は、電気抵抗のための安定した値を構築する（20の間の典型的な値に到達する- - 30Ωのxセンチ^2）7の後に、キャパシタンス（ 図1C）は、無細胞のような、この時点では機能的アッセイ_。エバンスブルーまたはデキストランで例えば遊走実験^3、20,21および透過性テストは、実施すべきである。

図1.形態学的およびネズミBMECsの機能特性。送信光マイクロによって見培養BMECsの（A）代表経時変化5日間のSCOPY。スケールバーはすべての画像に適用される。内皮細胞マーカーCD31のための（B）免疫蛍光染色を5日目にCD31（緑色）及びDAPI（青色）で、（C）細胞を5日間前培養した後のための自動化システムに移した生物物理学的特性（抵抗と容量）の分析。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

血液脳関門の機能障害は、多発性硬化症におけるBBBの破壊など広範囲に自己反応性免疫細胞によるCNS浸潤を促進し、オリゴデンドロサイトの出会いや破壊を可能にする様々な有害なCNS疾患の顕著な特徴である。虚血性脳卒中では、BBBの破壊および脳浮腫のその後の形成は、二次梗塞の成長と患者⁶の全生存期間に影響を与える重要な要因である。さらに、遠隔地BBBの変化によって焦点虚血性病変は、脳の広範な機能的変化を誘導することができる。しかし、根本的な分子メカニズムは不明な点が多い^5。これとは対照的に、機能的BMECs高密度かつ排出トランスポーターの多様性は、そのような感染症のための脳の悪性腫瘍または抗生物質のための化学療法剤として有益な薬剤の濃度を低減します。そのため、血液脳バーをより深く理解生理学的および病態生理学的条件下でRIER機能は特に好ま方向²¹にバリア機能を調節することができる薬理学的薬剤の開発が求められている。 BBBのin vitroモデルにおける信頼性の高いは、BBBでの調節機構を研究するための不可欠なツールです。

多くの不死化された脳内皮細胞株を確立し、インビトロ BBBモデル²²として用いられてきた。彼らはより速く成長し、いくつかの継代にわたって一定のBBB特性を保つように、これらの細胞株は、プライマリBMECsにわたって特定の利点を提供します。しかし、内皮細胞株は完全にin vivoの状況に実験結果の転写混ざりなどの重要なプロパティが変更された初代細胞を代替することはできません。例えば、マウス脳内皮細胞株bEnd.5高paracにつながる不連続に分布するタイトジャンクションタンパク質の低いレベルのみを発現するellular透磁率^23。のbEnd、別の頻繁に使用されるマウス脳内皮細胞株は、緻密で連続的に分布し、タイトジャンクション、高内皮性、いくつかの排出トランスポーターと低傍細胞透過性を示している。しかし、のbEnd細胞層の主BMECsに比べ、一定の経と傍細胞基質²⁴の浸透に関して本当の差別を欠いている。

初代細胞培養の調製では、混入細胞が有意に実験結果の妥当性を妨げる可能性があります。記載されたプロトコルでは、pyrumicin高純度を達成するために、内皮細胞のための選択剤として使用される。それにもかかわらず、細胞培養物の定期的な品質管理は、必然的に信頼性のある実験のために保証するために必要とされる。内皮細胞の典型的な形態学的特性（ 図1Aを参照）、transendothelia以外の品質管理のためのいくつかの方法があり、lの抵抗を測定する場合や、そのようなCD31内皮細胞マーカーの発現（ 図1Bを参照）、またはフォンウィルブランド因子（vWF）が評価されるかもしれない。

一匹のマウスの脳から単離された脳内皮細胞の数が比較的低く、複数の実験のための適切な細胞培養を設定することで、いくつかのマウスの脳をプールしなければならない。我々の経験では、少なくとも10匹のマウスは、それぞれの動物施設のリソースに応じて制限する要因かもしれない一つの実験のために使用される必要がある。バイアスや交絡因子を避けるために、同一の遺伝的および環境的背景を持つマウスのみをプールする必要があります。対照的に、ウシおよびブタの脳内皮細胞調製物は、一脳内の利用可能な脳内皮細胞の大多数を提供する。しかし、合併症のない飼育や住宅、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーに加えて初代マウスBMECsは理想としてレンダリング血液脳関門の機能を研究するためのモデル。

BBB基礎となる分子機構の機能に関するいくつかの重要な知見は、二次元組織培養系における研究から来ている。最近では、三次元培養系は、内皮細胞が管腔と管状ネットワークを形成できるようにすることコラーゲンマトリックス内に配置されている^{図25に示すように、}開発されてきた。これらの新規な細胞培養系は、 インビボで無傷の生物における血管のプロセスのより正確な再現を可能にする。このような周皮細胞およびアストロサイトなどNVU 3Dで細胞培養系のさらなる細胞の関与は、血液脳関門の機能を研究するin vitroでの革命をもたらすかもしれない。最初のモデルは、最近^26を開発されてきた。

トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項があります。すべての無菌作業の最初は、内皮細胞培養物の品質に必須である。第二に、pyrumycinはセルのみのために追加する必要があります培養の最初の2日間に使用される培地は、長いアプリケーションが増加MBMEC細胞死および低品質のバリア機能につながるかもしれない。第三に、このプロトコルに適用される酵素は、製造業者の指示に従って使用して保存されるべきである。そうでなければそれらの適切な機能が損なわれる可能性があります。内皮細胞が付着しない場合はさらに、細胞培養プレートのコーティングが改正される可能性があります。フィブロネクチンおよびコラーゲンの濃度は、変更される場合があり、または他のマトリックスタンパク質は、コーティング溶液に添加してもよい。最後に、年齢、性別、季節および動物施設内の環境条件がMBMEC分離実験の比較可能性の品質に影響を与える可能性のある重要な要因である。これは、条件が独立した実験の間で同等であることを保証されるべきである。

記載されたプロトコルは、マウスBMECsを分離するための基本的な神経免疫法として考慮されるべきである。単離された細胞は、Uかもしれませんそのような移動アッセイ、遺伝子およびタンパク質発現の研究、電気生理学的評価または透過性実験としてBBB機能へのさらなる洞察を得るために、さまざまなアプリケーションのためのsed。上述したように、BMECsの三次元細胞培養系は、NVUの文脈におけるBBBの調節に関与する複雑な機構を研究するための新たな機会を提供するかもしれない。したがって、一次内皮細胞の単離は、将来的にBBB研究の分野で非常に貴重な技術のままである。

Acknowledgments

この作品は、ドイツ学術振興による臨床研究（IZKF）ミュンスターのための学際センター（SEED 03/12、SB）、（DFG）によってサポートされていました、細胞·イン·モーション·エクセレンスのクラスター（EXC 1003 - CIM）、ミュンスター大学（SB及びSGM）とそれ以外クローネ-フレゼニウス-財団（SB及びSGMへ2012_A88）による。私たちは、優れたイラスト平家ブルムに感謝します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture