Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering av Primary murine Brain mikrovaskulære Cells

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52204

Introduction

Brain mikrovaskulære endotelceller (BMEC) danner monolag som er en integrert del av høyt spesialiserte blod-hjerne-barrieren (BBB). BMECs er innbyrdes forbundet ved synaptiske proteiner festet til en basalmembran. Sammen med pericytes, glatte muskelceller, astrocytic end føtter og sirkulerende blodceller bygge de opp den såkalte nevrovaskulær enhet (NVU) 1. Mot den tidligere oppfatningen av en ugjennomtrengelig barriere mellom blod og sentral-nervøse-system (CNS), er nvu en dynamisk, meget spesifikk og regulert grensesnitt som styrer overgangen av væsker, molekyler og celler mellom cerebrale blodkar og CNS 2- . En dysfunksjon eller dysregulering av nvu kan igangsette og / eller bidra til en rekke nevrovaskulære, infeksiøse, inflammatoriske eller degenerative sykdommer i CNS, som for eksempel iskemisk slag, HIV-encefalopati, multippel sklerose, Alzheimers eller Parkinsons sykdom 3-6.

_content "> The BMEC enkeltlag er tett forseglet av en junctional kompleks bestående av stramt (TJ) og adherens veikryss (AJ) 7. Den høye elektrisk motstand og den lave paracellulære permeabilitet av BBB er i hovedsak basert på TJ proteiner 8. De TJs er komplekser dannet av transmembrane proteiner av claudin og occludin familien, som er knyttet til cytoskjelettet av de endoteliale celler ved adapter molekyler, slik som de zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 4. Adherens knutepunktene er hovedsakelig satt sammen av den integrerte membranprotein vascular endothelial (VE) -cadherin, som er knyttet til cytoskjelettet via catenins 8.

Den stramme tetting av BBB hindrer fri utveksling av underlag og celler mellom blod og CSF. Unntak fra denne regelen er lipofile, små molekyler med en molekylvekt <400 Da, som er i stand til å krysse BBB av lipid-mediert diffusjon 9. Passering av større og / ellerhydrofile molekyler, slik som glukose, aminosyrer, peptider, proteiner, og mange medikamenter er begrenset til strengt kontrollerte transcellulær transport systemer 10, som kan klassifiseres i fem hovedkategorier: bærer-mediert transport, ionetransport, aktiv effluks transport, reseptor-mediert transport, og caveolae-mediert transport fire. Disse transportørsystemer hjelpe å opprettholde homeostase i CNS, noe som er nødvendig for en nøyaktig signalgenerering, transduksjon og integrasjon. Videre BMECs er i stand til aktivt å styre overgangen av distinkte molekyler med ekspresjon av en rekke ectoenzymes. Disse enzymene er lokalisert på celleoverflaten og endre spesifikke endogene og eksogene substrater hindrer eller tillater overgang av BBB-11.

Mens CNS ble ansett som et immun-privilegert organ for en lang tid, nyere funn tyder på en ganske dynamisk og tett regulert system av immun overleillance i CNS. De BMECs er kritisk involvert i reguleringen av immunceller sjelevandring. Ved ekspresjon av selektiner på deres overflate lymfocytter blir selektivt løselig indusert til å feste til endotelet. Utskillelsen av kjemokiner som støter med spesifikke reseptorer på leukocytter fører til ekspresjon eller konformasjonelle forandringer av leukocytt-integriner, for eksempel LFA-1 (lymfocytt-funksjon-assosiert antigen 1) og VLA-4 (meget sent antigen-4). Integrinene mediere en fast adhesjon ved å binde deres motreseptorer endotelceller, for eksempel VCAM-I (vaskulær celleadhesjonsmolekyl), ICAM-I (intercellular adhesjonsmolekyl) som muliggjør trans inn i hjernen parenchyma mellom eller gjennom BMECs av BBB 12-14. Disse og andre funn understreker den aktive rollen til endotelet i seg selv ved regulering av immuncellemigrering.

Videre BMECs som en del av nvu er involvert i reguleringen av den cerebrale blodstrøm linked til lokale nevronale metabolske krav. Ved astrocytic stimulering endoteliale celler produserer vasoaktive substanser som for eksempel nitrogenoksyd som fører til avslapping av vaskulære glatte muskelceller 15.

Angiogenese og neurogenesis i utviklings så vel som i den voksne hjernen showet parallelt mønster og utvikling og deler mange egenskaper av regulering 1, 4. Endotelceller er kritisk involvert i disse prosessene 16, 17.

Oppsummert BMECs gi viktige funksjoner for å garantere en riktig utvikling og funksjon av CNS. BBB dysfunksjon er knyttet til mange alvorlige nevrologiske lidelser. Imidlertid har bare svært få mål blitt identifisert på hjernen-blodkar grensesnitt for en spesifikk og effektiv behandling 18. Forenklet in vitro-modeller har blitt brukt for å forstå mekanismene som er involvert i funksjon og regulering av komplekse fysiologiske systemer for en long tid. Isolasjonen som beskrevet av dette manuskriptet og in vitro studie av mus BMECs, gitt den store variasjonen av spesifikke muse knockout-stammer, kan gi en videre forståelse av BBB funksjon og regulering under fysiologiske og patofysiologiske forhold åpner opp nye terapeutiske muligheter.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av de lokale myndighetene ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Tyskland") og gjennomført i henhold til den tyske loven om dyrevern.

1. Generelle kommentarer til Muse Experiments

  1. Utføre alle eksperimenter med mus i samsvar med retningslinjene i de respektive Institutional Animal Care og bruk komité.
  2. Hold mus henhold patogenfrie forhold og sette dem i stand til å ha tilgang til mat og vann ad libitum.
  3. Bruk alders- og kjønns matchet mus i eksperimentelle grupper fordi biologiske egenskaper kan variere med alder og kjønn.
  4. Når det er mulig prøve å redusere, forbedre eller erstatte dyreforsøk.

2. Utarbeidelse av Percoll® Gradient

  1. Bland 19 ml av 1 x PBS med 1 ml 10 x PBS, 1 ml FCS og 10 ml Percoll.
  2. Utfør sterile filtrering i et glassrør (diameter av filter porene: 0,2 um). Etterpå lagre oppløsningen ved 4 ° C.

3. Utarbeidelse av endotelet Cell Medium og Coating av cellekultur Plates

  1. Endotelceller medium:
    1. Fremstilling av 500 ml medium: (. Ca. 20%) Bland 400 ml DMEM-medium (. Ca. 80%) med 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 pg / ml; ca. 0,05%), 0,5 ml heparin (100 ul / ml;. ca. 0,1%) og 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. ca. 0,1%). Legg pyrumycin bare for cellekulturmedium som brukes i de første to dagene av kultur.
    2. Utføre sterilfiltrering i et glassrør (diameter av filter porene: 0,2 um). Etterpå lagre oppløsningen ved 4 ° C.
  2. Belegg av cellekulturplater:
    1. Til 1 ml av beleggoppløsningen, fremstille en løsning av 500 ul DDH 2 O, 400 pl kollagen IV (0,4 mg / ml) og 100 ul fibronektin (0,1 mg / ml).
    2. Dekke hele overflaten av each brønn i cellekulturplaten med beleggløsningen. Oppbevar plate ved 4 ° C over natten.

4. Isolering av murine Brain mikrovaskulære endotelceller (MBMEC)

  1. Sacrifice 10 voksne mus (8-12 uker gamle, C57BL / 6) ved halshugging. Etterpå isolere mus-hjerner og butikk i 5 ml PBS (Påminnelse: Arbeid sterilt).
  2. Fjern hjernen stammer, cerebella og thalami med en tang. Ta av hjernehinnene ved forsiktig rulle hoder på et sterilt blotting papir. Samle de resulterende meninges frie forhjernene.
  3. Overfør hjernen til en 50 ml Falcon rør fylt med 13,5 ml DMEM.
  4. Finhakk vev, først med en 25 ml pipette, deretter med en 10 ml pipette til media blir melke.
  5. Deretter fordøye vevet med en blanding av 0,6 ml kollagenase CLS2 (10 mg / ml i DMEM) og 0,2 ml DNAse (1 mg / ml i PBS) i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) i 1 time ved 37 ° C på en orbital rister ved 180 rpm.
  6. Tilsett 10 ml DMEM tilsatt til vevsuspensjon og sentrifuger cellene ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  7. Kast supernatant (Påminnelse:! PELLET er lett å miste)
  8. For å fjerne myelin, resuspender pelleten med en 25 ml pipette i 25 ml BSA-DMEM (20% w / v) (ca. 25 ganger), og sentrifuger ved 1000 xg i 20 min ved 4 ° C.
  9. Kast den øvre myelin lag (melkeaktig) med et knust glass Pasteur pipette med større diameter, og deretter kaste den BSA lag med en normal Pasteur pipette.
  10. Resuspender pelleten i 9 ml DMEM og tilsett 1 ml kollagenase / dispase (endelig konsentrasjon er 1 mg / ml) og 0,1 ml DNAse. Fordøye løsning for 1 time ved 37 ° C på en orbital shaker ved 180 rpm (påminnelse: ikke bruk pipetten til å suspendere - celler kan gå tapt).
  11. Under fordøyelsen, sentrifuger Percoll-løsning for å sette opp densitetsgradient ved hjelp av en ultrasentrifuge ved 3000 x g i 1 time ved 4 ° C, med akselerasjon, without brems.
  12. Tilsett 10 ml DMEM til det spaltede cellesuspensjon. Sentrifuger suspensjonen ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C. Deretter kaste supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml DMEM.
  13. Legg de resuspenderte cellene forsiktig på toppen av Percoll-gradient og sentrifuger ved 700 xg i 10 min ved 4 ° C uten akselerasjon og bremsen. Merk: Cellene er synlig som en sky på inter.
  14. Ta ca. 12 ml av inter med celler med en lang steril nål og legg den i en ny 50 ml Falcon med 5 ml DMEM.
  15. Sentrifuger cellene på nytt ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C. Etterpå resuspender pelleten i endotelial cellemedium (bruke ca. 0,2 ml medium per 1 cm2 overflate av cellekulturplate).
  16. Fjern beleggsløsningen fra belagte cellekulturplater (se trinn 3.2) og skyll godt med hver steril PBS i to påfølgende vasketrinn.
  17. Opprettholde cellekulturer i endothelialcellemedium ved 37 ° C og 5% CO2 i en steril inkubator. Endre medium hver to til tre dager. Dele celler på 90% samløpet.

Representative Results

Umiddelbart etter isolering, murine BMECs og forurensende celler danner konglomerater som flyter i cellekulturmediet (figur 1A, dag 0). Behandlingen med pyrumycin fører til et utvalg av murine BMECs siden de uttrykker høye nivåer av effluks-transportører som P-glykoprotein som fører til en relativ motstand mot giftstoffer. Kontaminerende celler er mye mer mottakelig for pyrumycin mediert cytotoksisitet 19. Under prosessen med pyrumicin utvalg, forurensende celler inn apoptotisk eller nekrotisk celledød, mens MBMECs begynner å feste til kollagen IV / fibronektin belagt cellekulturplater (figur 1A, dag 1 og dag 2). Inntil dag 5, de MBMECs proliferere til en tetthet på ca.. 80-90%. De er kjennetegnet ved de typiske spindel-formet utseende. Ved samløpet, danner de et monolag av tettpakkede, langsgående linje og ikke-overlappende kontakt-hemmet celler (figur 1A, dag 5). Avpyrumicin valg, en høy renhet på opp til 99% er nådd MBMEC som demonstrert av endoteliske cellemarkør CD31 (PECAM1, figur 1B). De MBMECs danne Tettsittende monolag er koblet sammen via trange veikryss proteiner. Etter 7-8 dagers dyrking, de endoteliale cellelag bygge opp stabile verdier for elektrisk motstand (rekkende typiske verdier mellom 20 - 30 Ω cm x 2). Og kapasitans (figur 1C) På dette tidspunkt punkt funksjonelle analyser såsom celle- migrasjons eksperimenter 3, 20,21 og permeabilitetstester, f.eks med Evans blå eller dekstran, bør utføres.

Figur 1
Figur 1. morfologiske og funksjonelle egenskaper murine BMECs. (A) Representant tid løpet av dyrkede BMECs så ved overføring lys microkopi over 5 dager. Skala bar gjelder for alle bilder. (B) Immunfluorescens farging for endotel-cellemarkør CD31 på dag 5. CD31 (grønn) og DAPI (blå). (C) Cellene ble dyrket i 5 dager og deretter overført til et automatisert system for analyse av biofysiske egenskaper (motstand og kapasitans). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Blod-hjerne-barrieren dysfunksjon er et kjennetegn på ulike skadelige CNS sykdommer, for eksempel et sammenbrudd av BBB i multippel sklerose omfattende letter CNS invasjon av autoreaktive immunceller og gjør møtet og ødeleggelse av oligodendrocytter. I hjerneinfarkt avbrudd av BBB og den påfølgende dannelse av hjerneødem er kritiske faktorer som påvirker sekundærinfarkt vekst og total overlevelse av pasienter 6. Videre, ved forandringer av BBB i fjerntliggende områder fokale iskemiske lesjoner er i stand til å indusere omfattende funksjonelle forandringer i hjernen. Men de underliggende molekylære mekanismene er i stor grad ukjent fem. I motsetning til dette, den høye tetthet og mangfoldet av effluks-transportører i funksjonelle BMECs reduserer konsentrasjonen av nyttige medikamenter slik som kjemoterapeutika for hjerne maligniteter eller antibiotika for smittsomme sykdommer. Derfor, en dypere forståelse av blod-hjerne-barRier funksjon under fysiologiske og patofysiologiske betingelser er nødvendig for å utvikle farmakologiske midler som er i stand til spesifikt å regulere barrierefunksjon i den favoriserte retningen 21. Pålitelig in vitro modeller av BBB er uunnværlig verktøy for å studere reguleringsmekanismer på BBB.

Mange udødeliggjort hjernen endothelial cellelinjer har blitt etablert og ansatt som in vitro BBB-modeller 22. Disse cellelinjene tilby visse fordeler fremfor primær BMECs som de vokser raskere og holde visse BBB-egenskaper over flere passasjer. Imidlertid kan endothelial cellelinjer ikke fullt ut erstatte primærceller som viktige egenskaper er endret som blander seg med overførbarheten av eksperimentelle funn til in vivo situasjon. For eksempel, det murine hjerne endotel-cellelinje bEnd.5 uttrykker bare lave nivåer av diskontinuerlig fordelte stramme koblings proteiner som fører til høy paracellular permeabilitet 23. BEnd.3, en annen hyppig brukt murine hjerne endotelceller linje, demonstrerer tette og kontinuerlige distribuerte tett veikryss, en høy transendothelial motstand, flere efflux transportører og lav paracellulære permeabilitet. Imidlertid bEND.3 cellelag sammenlignet med primære BMECs mangler en virkelig diskriminering med hensyn til gjennomtrengning av visse transcellulær og paracellulær 24 substrater.

I preparater av primære cellekulturer, kan kontaminerende celler i betydelig grad interfererer med gyldigheten av eksperimentelle funn. I den beskrevne protokoll, blir pyrumicin anvendes som et selektivt middel for endoteliale celler for å oppnå høy renhet. Ikke desto mindre er en vanlig kvalitetskontroll av cellekulturen uunngåelig nødvendig for å garantere for pålitelig eksperimenter. Det finnes flere metoder for kvalitetskontroll, foruten typiske morfologiske egenskapene til endotelceller (se figur 1A), den transendothelial motstanden kan måles eller ekspresjon av endotelial cellemarkør slik som CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand faktor (vWF) kan bli evaluert.

Antallet hjerne endotel-celler isolert fra en musehjerne er relativt lav, og for å sette opp en passende cellekultur for flere forsøk, hjernen av flere mus har til å bli slått sammen. I vår erfaring, minst 10 mus trenger å anvendes for ett eksperiment som kan være en begrensende faktor, avhengig av ressursene til den respektive dyrefasilitet. For å unngå skjevhet eller konfunderende faktorer, bør bare mus med en identisk genetisk og miljømessig bakgrunn samles. I motsetning til dette, okser og svin, hjerne endotel-cellepreparater tilveiebringe et stort antall hjerne endotel-celler som er tilgjengelige i en hjernen. Men foruten det ukomplisert avl og bolig, den brede og stadig økende repertoar av tilgjengelige transgene mus gjengir primær murine BMECs som en ideellmodell for å studere blod-hjerne-barrierefunksjon.

Flere viktige funn om funksjonene til BBB og de underliggende molekylære mekanismene har kommet fra studier i 2D vevkultursystemer. Nylig, har 3D-kultursystemer blitt utviklet 25, der endotelceller er plassert innenfor en kollagen matriks gjør dem i stand til å danne hulrom og rørformede nett. Disse nye cellekultursystemer gir mulighet for en enda mer nøyaktig reproduksjon av vaskulære prosesser i den intakte organismen in vivo. Involvering av ytterligere celler av nvu i 3D-cellekultursystemer, slik som pericytes og astrocytter kan revolusjonere in vitro studier av blod-hjerne-barrierefunksjon; første modellene har nylig blitt utviklet 26.

Det er noen anbefalinger for feilsøking. Først av alt sterile arbeids er avgjørende for kvaliteten av endotelial cellekultur. For det andre bør pyrumycin kun tilsettes for cellekulturmedium som brukes i de første to dagene av kultur, kanskje lengre søknad føre til økt MBMEC celledød og lav kvalitet barrierefunksjon. For det tredje bør de enzymene som er benyttet i denne protokollen brukes og lagres i henhold til produsentens instruksjoner; ellers sin rette funksjon kan være kompromittert. Videre kan belegget på cellekulturplater endres dersom endotelceller ikke feste. Konsentrasjoner av fibronektin og kollagen kan endres eller andre matriksproteiner kan tilsettes til belegningsløsningen. Til slutt, alder, kjønn, årstid og miljøforhold innenfor dyret anlegget er viktige faktorer som kan påvirke kvaliteten på MBMEC isolasjon og sammenlignbarhet av eksperimenter. Det bør sikres at forholdene er sammenlignbare mellom uavhengige eksperimenter.

Den beskrevne protokoll bør betraktes som en grunnleggende metode for å isolere neuroimmunological murine BMECs. De isolerte celler kan være used for en rekke programmer for å få ytterligere innsikt i BBB funksjon, for eksempel migrasjonsanalyser, gen og protein expression studier, elektrofysiologiske evalueringer eller permeabilitet eksperimenter. Som nevnt ovenfor, kan 3D-cellekultursystemer av BMECs gi nye muligheter for å studere de komplekse mekanismer som er involvert i reguleringen av BBB i sammenheng med den nvu. Derfor vil isoleringen av primære endotelceller forblir en uvurderlig teknikk innen BBB forskning i fremtiden.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den tverrfaglige Senter for klinisk forskning (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celler-i-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 - CIM), Universitetet i Münster (til SB og SGM) og av Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 til SB og SGM). Vi takker Heike Blum for de gode illustrasjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A9418 Bovine serum albumin
Collagenase CLS2 Worthington LS004176 High relative level of protease activity
Collagenase-dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV Sigma Aldrich C0543 From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM Sigma Aldrich D5030 Warm in 37 °C water bath before use
DNAse Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin Sigma Aldrich H3393 Anticoagulant
PDS First Link UK Ltd. 60-00-850 Plasma-derived serum
Percoll Sigma Aldrich P1644 Warm to room temperature before use
Pyrumycin Sigma Aldrich P8833 Should only be used in first 2 days of culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neuwelt, E. A., et al. Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology. Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).
  2. Ohtsuki, S., Terasaki, T. Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development. Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).
  3. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).
  4. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron. 57, 178-201 (2008).
  5. Stoll, G., et al. Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).
  6. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome. Stroke. 42, 1081-1089 (2011).
  7. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).
  8. Bazzoni, G., Dejana, E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).
  9. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).
  10. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).
  11. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).
  15. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).
  16. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, 562-566 (2010).
  17. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).
  18. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  19. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  20. Ruck, T., et al. CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation. PLoS One. 8, 81455 (2013).
  21. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  22. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).
  23. Watanabe, T., et al. Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).
  24. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, 95-112 (2003).
  25. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115, 5259-5269 (2010).
  26. Urich, E., et al. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Scientific reports. 3, (2013).

Tags

Nevrovitenskap Blood hjerne barrieren sentralnervesystemet endotelceller immuncelle smugling nevroinflammasjon neurodegeneration neurovascular enhet
Isolering av Primary murine Brain mikrovaskulære Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruck, T., Bittner, S., Epping, L.,More

Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (93), e52204, doi:10.3791/52204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter