Protocol
كل التجارب باستخدام الفئران يجب أن يتم تنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية منها رعاية الحيوانات واستخدامها.
1. التعليقات العامة للتجارب ماوس
- الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
ملاحظة: من المهم استخدام الفئران السن والمطابقة الجنس في المجموعات التجريبية لأنماط المناعية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس.
2. CD8 + T-خلايا إعداد وتفعيل OVA محددة (OT-I)
- أداء تحفيز خلايا OT-I T كما هو موضح أدناه 5 أيام قبل إعداد شرائح الدماغ.
ملاحظة: 5 × 10 5 المستجيب تنشيط CD8 + OT-I T-خلايا (CD8 + T-خلايا الفئران المعدلة وراثيا الاعتراف فقط الببتيد OVA 257-264 في سياق جزيئات MHC-I) وهناك حاجة لكل شريحة تركيز 5 × 10 5 تم اختيار التجربةحليف واحدة الأمثل لصالح جيدة التفاعل خلية خلية أخرى أن الخلايا تبدأ يهاجرون إلى شريحة، وفي الوقت نفسه، كمية من الخلايا ليست مرتفعة جدا للحث على رد فعل مبالغ فيه السماح خلية واحدة العد 8،18. - إعداد المتوسطة لزراعة OT-I T-الخلايا. تكملة 500 مل DMEM مع 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 10 ملي HEPES، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية و 25 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- إزالة الطحال من OT-I الفئران المعدلة وراثيا وفقا لمرجعية 16. نقلها إلى متوسطة على استعداد.
- توليد تعليق خلية واحدة من يهرس الطحال من خلال 70 ميكرومتر مصفاة وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 ° C.
- احتضان تعليق الخلية مع 5 مل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) عازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي KHCO 3، 0.1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.3) لمدة 5 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
- وقف incubatiعلى مع 10 مل المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
- تمييع تعليق خلية في المتوسط وحساب الأرقام. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 7 خلايا / جيد في لوحة 12-جيدا ومنهم الوزراء من قبل الحضانة مع OVA 257-264 (SIINFEKL، 1 نانومتر) وانترلوكين 2 (IL-2) (500 وحدة دولية / مل) ل 5 أيام.
- بعد 4 أيام، إضافة IL-2 عند تركيز 500 وحدة دولية / مل مرة أخرى.
- وبعد أن التحفيز، وتنقية OT-I T-الخلايا من التعليق الخلية باستخدام مجموعة مختارة الماوس السلبي القائم CD8 + T عدة عزل خلايا التالية تعليمات الشركة الصانعة. ويستند تنقية على استنزاف جميع CD8 + غير الخلايا باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD4، CD11b، CD11c و، CD19، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC من الدرجة الثانية، تير-119، وTCRγ / δ التي يتم بعد ذلك التخلص منها باستخدام أعمدة المغناطيسية لشطف من CD8 + T-خلايا النقاء.
ملاحظة: الخطوات الهامة في هذا proceduيشار إلى إعادة كتبها المصنوعات: من المهم أن رد الفعل ينطوي على الخلايا واحد فقط لأن وجود كتل يمكن منع العمود خلال الخطوة شطف. عد من الخلية قبل إضافة كوكتيل Byotin المهم للحصول على درجة نقاوة العينة ويجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء على الجليد للحد من الارتباطات الأجسام المضادة غير محددة.
3. إعداد الحاد الدماغ شرائح والمشارك الثقافة مع OT-I T-خلايا
- قبل إعداد الدماغ الحاد شرائح 19، وإعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة باستخدام 200 ملي السكروز، 20 أنابيب ملي، و 2.5 ملي بوكل، 1.25 ملي ناه 2 PO 4، 10 ملي MgSO 4، 0.5 CaCl 2 و 10 ملي سكر العنب والسائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) باستخدام 125 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1.25 ناه 2 PO 4، 24 ملي NaHCO 3، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 10 ملم سكر العنب. ضبط درجة الحموضة من كل حل ل7.35 كتبها النقيبز هيدروكسيد الصوديوم. قبل ضبط درجة الحموضة من ACSF، لا بد من فقاعات الحل مع خليط من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- قبل تبريد الحلول.
- تخدير 8 - 10 أسابيع الفئران القديم (على سبيل المثال، C57BL / 6 عن السيطرة أو المعدلة وراثيا ODC-OVA الفئران 17 مع استنشاق باستخدام 5.0٪ الأيزوفلورين، 5.0٪ هالوثان أو حقن 100 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم عن طريق زيلازين الملكية الفكرية انتظر للتخدير واستخدام قرصة أخمص القدمين إلى تقييم مستوى التخدير واقطع رؤوسهم في آن واحد. الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام معايير لجنة للقتل الرحيم.
- ضع الماوس في موقف بطني. تطهير فروة الرأس وقطع sagittally. فتح عظم الجمجمة sagitally، وإزالة الدماغ بسرعة مع مساعدة من مغرفة وإصلاحه على لوحة من vibratome باستخدام الغراء.
- ملء لوحة مع استعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة.
- قطع 300 ميكرون شرائح الاكليلية مع vibratome.
ملاحظة: هذا الإجراء هو أعلمن لتسفر قابلة للحياة عينات الأنسجة سليمة مناسبة للدراسات الخلوية وظيفية في غضون فترة زمنية لا يقل عن 8 ساعة 19-21. وبالفعل، وبعد هذه الفترة الزمنية، بدءا بالفعل بعد 6 ساعات، وإعداد يظهر انخفاض الجودة، وهي التغيرات في الخصائص الأساسية والوظيفية مثل عمل الجيل المحتملين والانتشار. - بعد باجتزاء، ونقل شريحة واحدة على الفور في كل بئر من لوحة 12-جيدا مليئة ACSF.
- إضافة بعناية 5 × 10 5 خلايا OT-I T لكل شريحة.
- احتضان شرائح لمدة تصل إلى 8 ساعات في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
- بعد فترة الحضانة، وشرائح الحصاد وتضمين عليها باستخدام أكتوبر مجمع الأنسجة تيك وتجميدها في النيتروجين السائل. تخزينها في -20 ° C لمزيد من الدراسات النسيجية لمثل تقييم بنية الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مكافحة MAPII أو أضداد synaptophysin) أو موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، وذلك باستخدام معاداة كاسباس 3 الأجسام المضادة والمعادية للNeuN المضادةالهيئات) وفقا للإجراءات القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد مرور فترة الحضانة من شرائح الدماغ مع CD8 + T-خلايا الموجه دبقية قليلة التغصن، قليلة التغصن وكذلك الخلايا العصبية تخضع لموت الخلايا المبرمج (أرقام 2A و 1C، على التوالي). علامات النسيجية من موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، كاسباس 3، في Tunel) يمكن أقرب الكشف بعد 3 ساعات من الحضانة. لا ينبغي أن يكون فترة حضانة أطول من 8 ساعات لضمان نوعية جيدة من الإعداد والنتائج استنساخه. الخلايا أفكارك ويمكن الاطلاع على جميع أنحاء شريحة مع رجحان في المناطق مياليني. ويصور تلطيخ النسيجي المثالي من شريحة لسلامة الهيكلية والخلايا العصبية أفكارك في الشكل 1A-C.
هناك نقاط زمنية مختلفة خلال الحضانة التي تهم لتقييم المعلمات النتيجة. دورة المرة نموذجي أجريت في مختبرنا يتضمن المعلمات يحلل، وهي التفاعلات خلية خلية في وقت 0، ثم (لاحظ تفاعل القصوى) 3 و 4 و 6 ساعات بعد بدأ التفاعل. بعض المقايسات نموذجية وراء التحليلات النسيجية التي كثيرا ما يمكن تطبيقها وصفها باختصار شديد:
انتعاش T-الخلية وتحليل
بعد فترة حضانة تصل الى 8 ساعة، T-خلايا يمكن استردادها من شرائح ويمكن تقييم لتحليل المعلمات النسبية لجزيئات المستجيب داخل الخلايا مثل إنتاج السيتوكينات أو انتشار الأسلحة النووية. من أجل استرداد خلايا تي، تم فصلها شرائح ميكانيكيا وتجميع معا لكل حالة تجريبية. تم عزل خلايا من واجهة 30٪ إلى 50٪ Percoll (أمرشام، فرايبورغ، ألمانيا) بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة لمدة 30 دقيقة في 2،500 دورة في الدقيقة. وبهذه الطريقة، فمن الممكن للحصول على خلايا وحيدات النوى التي تم غسلها وملطخة فورا باستخدام التدفق الخلوي التقنيات (FACS) باستخدام عدد مختلف ونوع من الأجسام المضادة التي تختلف تبعا لدراسة نريد أن تتناول، في هذا البروتوكول، على سبيل المثال CD8 + 18.
"jove_content"> العصبية أضرار جانبية وظائف
ويمكن تقييم المعلومات حول الصحة العصبية وظائف عن طريق أداء الكهربية تسجيل على سبيل المثال، لتقييم الخصائص الأساسية من الخلايا العصبية مثل إمكانات العمل (الجزائرية) جيل، كما هو مبين في الشكل 1D.
الشكل 1. هيكل الصرفي من شريحة وكذلك نتائج ممثلة. (A) هيكل الصرفي من شريحة 8 ساعة بعد الحضانة. يشير مقياس شريط 10 ميكرون. مترابطة (ب) الخلايا العصبية synaptically كما يتضح من شارك في تلطيخ لMAPII (الخضراء) وsynaptophysin (الحمراء) تلطيخ. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. (C) الصورة التمثيلية للخلايا أفكارك (كاسباس 3، الأحمر) والخلايا العصبية (NeuN والأخضر) في قرن آمون لfter 6 ساعات الحضانة. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. (D) تسجيلات خلية واحدة التصحيح، المشبك عمل الخلايا العصبية الجيل المحتملة التالية الخطوات الحالية إزالة إستقطاب في الخلايا العصبية القشرية الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. stainings متعددة لتقييم أداء خصوصية فيما البروتوكول. (A) المشارك تلطيخ NogoA (الأحمر)، وهي علامة للحصول قليلة التغصن الناضجة (ODCs) وCaspase3 (موت الخلايا المبرمج والأخضر) تبين أن ODCs وهاجم من قبل خلايا CD8 + T. (B) نتيجة التفاعل هو سلبي عندما Caspase3 (الأحمر) هو الملون والتعاون مع GFAP، وهي علامة للحصول على الخلايا الدبقية (الأخضر). شريط النطاق تمثل 10 ميكرومتر. (C) Specificiويدعم تاي من البروتوكول من قبل المشارك تلطيخ الخلايا العصبية (دابي والأزرق) مع Caspase3 (الحمراء)، بدءا من اليسار: WT الحيوانات والحيوانات WT تتعرض لI OTI خلايا T، ODC-أوفا وشركة التنمية النفطية-أوفا تتعرض لخلايا OTI-I T. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت نماذج حيوانية مختلفة على مدى العقود الماضية لمعالجة الميزات المرضية من الاضطرابات المزيل للالتهابات مثل MS. في الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع الماوس والفئران نماذج لمحاكاة السمات الفيزيولوجية المرضية للمرض، أي تحليل النتائج المترتبة على عمليات إزالة الميالين وعودة الميالين والحلقات المختلطة من الالتهاب وتنكس عصبي. ومع ذلك، فقط نهج المجراة سابقا يسمح لتشريح الآليات الكامنة بالضبط.
إعداد شرائح الدماغ الحادة هو أيضا نموذج وزعت على نطاق واسع، ويمكن اعتبارها موثوقة وقابلة للتكرار. في تركيبة مع العزلة وحضانة الخلايا المناعية دبقية قليلة التغصن محددة، ويمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة التجريبية محددة، وخاصة من حيث دراسة آلية وحركية من المناعة هجوم خلية وخلية - خلية التفاعلات. ومن المعروف خارج الحي المناهج الأخرى وعلى نطاق واسعتستخدم 22 ولكن لحداثة بروتوكول لدينا في خصوصية الهدف الذي يمكن الطعن عن طريق أداء مختلفة "الإقصاء" شارك في stainings، وهي التحقق من مناعية Caspase3 في WT المكشوفة أو لم تتعرض لخلايا OT-I T (انظر الشكل 2C) .
ينبغي اتخاذ بعض النقاط الحرجة أثناء إعداد بعين الاعتبار، وهي إعدادات التجريبية، لضمان أن يتم تنفيذ التجارب الصحيح منهجيا. لصحة الداخلية والعزلة وتنشيط الخلايا المناعية المستخدمة يجب أن يسيطر على أساس منتظم عبر مثل التدفق الخلوي التحليلات (FACS). وعلاوة على ذلك، ينصح بشدة فحص حيوية شرائح الدماغ. وينبغي أن تكون المجموعات التجريبية السن والمطابقة الجنس. وينبغي دائما أن أجرى تجارب في الامتثال للوائح الرفق بالحيوان.
تحتاج الى بعض القيود المفروضة على بروتوكول لأن يوضع في الاعتبار. الأهم من ذلك، هو النموذج المقدمليست مناسبة هذا النهج خارج الحي وتحاكي تماما الوضع المناعي معقدة من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية. وينبغي أيضا أن يعتبر أن يستخدم نموذج فقط CD8 + T-خلية مدفوعة استجابة مناعية. CD4 + T-الخلايا والخلايا البائية تلعب دورا أقل بروزا. وينبغي النظر في بروتوكولات بديلة باستخدام أنواع فرعية أخرى الخلايا المناعية دبقية قليلة التغصن محددة عند تناول هذه الأنواع من الخلايا. العثور النسيجي المتوقع oligodendroglial (انظر الشكل 2A) والخلايا العصبية (انظر الشكل 1C). بدلا من ذلك، يمكن أن يتحقق موت الخلايا المبرمج من أنواع الخلايا الأخرى التي تستخدم على سبيل المثال، أو الخلايا العصبية astroglial مستضد معين المناعة والأنظمة المعدلة وراثيا. في هذا بروتوكول معين كان مناعية من Caspase3 في الخلايا astroglial سلبية نتيجة لخصوصية النظام (الشكل 2B).
ويمكن اعتبار بروتوكول صفها بأنها العصبية الأساسييجوز تعديل المنهج التجريبي المناعية وغيرها من التطبيقات. الإجراء التجريبي يمكن تطبيقها بسهولة على البروتوكولات الأخرى من خلال تغيير شرائح الدماغ (على سبيل المثال، تختلف سلالات الفئران المعدلة وراثيا) في تركيبة مع مختلف أنواع فرعية الخلايا المناعية مستضد معين (على سبيل المثال، استخدم بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG) - CD4 + T-محدد الخلايا و شرائح الدماغ المحضرة من C57BL / 6 الفئران لمعالجة آثارها على oligodendroglial وموت الخلايا المبرمج العصبية). في المختبر تنشيط الخلايا المناعية يمكن أن تختلف عن الأسئلة المناعية محددة (على سبيل المثال، والاستقطاب إلى T H 1 أو T H 17 خلايا).
في بعض الأحيان، موت الخلايا المبرمج تعزيز أو تخفيض في شرائح الدماغ قد يكون تحديا التجريبية. بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها هي:
في البداية، ونوعية شرائح الدماغ تعتمد بشكل كبير من الوقت اللازم لإعداد وكذلك قيمة الرقم الهيدروجيني، الأسمولية والأكسدة وضع لناإد الحل. يجب التأكد من أن الظروف قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة. وعلاوة على ذلك، يجب السيطرة على تنشيط الخلايا المناعية على أساس منتظم. قد تختلف تركيز المستضد الأمثل. النظر في المعايرة للمستضد تستخدم عند وضع التجارب.
كما هو موضح أعلاه، فإن بروتوكول المذكورة يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لتحليل تأثير المزيد من أنواع فرعية الخلايا المناعية (على سبيل المثال، CD4 + T-الخلايا، خلايا B-) على سلامة الجهاز العصبي المركزي. هذه المناهج هي مناسبة خاصة لفصل آثارها على الخلايا العصبية كما oligodendroglial والتحليل النسيجي يمكن تقييمها بدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
