Protocol
चूहों का उपयोग सभी प्रयोगों संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए।
माउस प्रयोगों के लिए 1. सामान्य टिप्पणी
- रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत चूहों रखें और उन्हें भोजन और पानी यथेच्छ के लिए उपयोग कर सकें।
नोट: प्रतिरक्षाविज्ञानी पैटर्न उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि यह प्रयोगात्मक समूहों में उम्र और लिंग-मिलान चूहों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
2. तैयार करना और एक्टिवेशन ओवीए विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं (ओटी-आई)
- मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने से पहले 5 दिनों के रूप में नीचे वर्णित OT-मैं टी कोशिकाओं की उत्तेजना प्रदर्शन।
नोट: 5 एक्स 10 5 सक्रिय प्रेरक सीडी 8 + OT-मैं टी-कोशिकाओं (सीडी 8 + टी कोशिकाओं MHC-मैं अणुओं के संदर्भ में केवल ओवीए 257-264 पेप्टाइड पहचानने ट्रांसजेनिक चूहों की) टुकड़ा प्रति आवश्यक हैं एकाग्रता 5 एक्स 10 5 प्रयोग में चुना गया थाकोशिकाओं को एक ही समय में, टुकड़ा में पलायन और शुरू है कि एक बार एक अच्छी सेल सेल बातचीत के पक्ष में करने के लिए इष्टतम एक के रूप में सहयोगी, कोशिकाओं की राशि एकल कोशिका 8,18 गिनती की अनुमति के एक overreaction प्रेरित करने के लिए बहुत अधिक नहीं है। - ओटी-मैं टी कोशिकाओं संवर्धन के लिए मध्यम तैयार करें। 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 10 मिमी HEPES, 2 मिमी एल glutamine के साथ 50 माइक्रोन 2-मर्केप्टोइथेनाल, 1% अनावश्यक अमीनो एसिड और 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन 500 मिलीलीटर DMEM अनुपूरक। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर।
- संदर्भ 16 के अनुसार ओटी-मैं ट्रांसजेनिक चूहों की तिल्ली निकालें। तैयार माध्यम में उन्हें स्थानांतरित।
- 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर एक 70 माइक्रोन झरनी और सेंट्रीफ्यूज निलंबन के माध्यम से spleens mashing द्वारा एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है।
- लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए 5 मिनट के लिए 5 एमएल अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) बफर (150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, 0.1 मिमी EDTA, पीएच 7.3) के साथ सेल निलंबन सेते हैं।
- Incubati बंद करोफिर 10 मिलीलीटर मध्यम और सेंट्रीफ्यूज इसके साथ पर ऊपर वर्णित है।
- मध्यम में सेल निलंबन पतला और संख्या की गणना। प्लेट 3 10 x 7 कोशिकाओं के घनत्व में कोशिकाओं / अच्छी तरह से में एक 12 अच्छी तरह से थाली और प्रधानमंत्री उन्हें ऊष्मायन से ओवीए 257 के साथ - 264 (SIINFEKL; 1 एनएम) और इंटरल्यूकिन 2 (आईएल -2) (500 आइयू / एमएल) के लिए पांच दिन।
- चार दिनों के बाद, 500 आइयू की एकाग्रता में / एमएल फिर आईएल -2 जोड़ें।
- उत्तेजना के बाद, निर्माता के निर्देशों के बाद एक नकारात्मक चयन के आधार माउस सीडी 8 + टी सेल अलगाव किट का उपयोग करके सेल निलंबन से ओटी-मैं टी कोशिकाओं को शुद्ध। शुद्धीकरण सीडी 4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC वर्ग द्वितीय, टेर-119, और TCRγ के खिलाफ एंटीबॉडी के एक कॉकटेल का उपयोग करके सभी गैर-सीडी 8 + कोशिकाओं की कमी पर आधारित है / δ तो शुद्ध सीडी 8 + टी कोशिकाओं की क्षालन के लिए चुंबकीय कॉलम का उपयोग करके निकाल दिया जाता है।
नोट: इस procedu में महत्वपूर्ण कदमपुन बनाती द्वारा संकेत कर रहे हैं: यह गुच्छों की उपस्थिति क्षालन कदम के दौरान स्तंभ ब्लॉक सकता है क्योंकि प्रतिक्रिया केवल एकल कक्षों शामिल है कि महत्वपूर्ण है; Byotin कॉकटेल जोड़ने से पहले सेल की गिनती नमूना की शुद्धता की डिग्री के लिए महत्वपूर्ण है और प्रक्रिया unspecific एंटीबॉडी बाइंडिंग कम करने के लिए बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
ओटी-मैं टी कोशिकाओं के साथ तीव्र मस्तिष्क स्लाइस और सह संस्कृति 3. तैयारी
- तीव्र मस्तिष्क की तैयारी करने से पहले 19, 200 मिमी सुक्रोज, 20 मिमी पाइप, 2.5 मिमी KCl, 1.25 मिमी नाह 2 पीओ 4, 10 मिमी MgSO 4, 0.5 2 CaCl और 10 मिमी डेक्सट्रोज का उपयोग कर placedine ठंडा शारीरिक खारा समाधान तैयार स्लाइस और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) 125 मिमी NaCl, 2.5 KCl, का उपयोग करके 1.25 नाह 2 पीओ 4, 24 मिमी 3 NaHCO, 2 मिमी MgSO 4, 10 मिमी डेक्सट्रोज 2 मिमी 2 CaCl,। Usin से 7.35 के लिए प्रत्येक समाधान के पीएच को समायोजित करेंजी NaOH के। ACSF के पीएच समायोजन से पहले, समाधान 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के एक मिश्रण के साथ bubbled किया जाना चाहिए।
- समाधान पूर्व शांत करते हैं।
- 8 चतनाशून्य - (10 सप्ताह पुरानी चूहों जैसे, C57BL 5.0 isoflurane%, 5.0% halothane या इंतज़ार आईपी के माध्यम से 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन xylazine इंजेक्षन का उपयोग करते हुए नियंत्रण या साँस लेना के साथ ट्रांसजेनिक ODC-ओवीए चूहों के रूप में 17/6 संज्ञाहरण के लिए। संज्ञाहरण के स्तर का आकलन और उन्हें एक बार सिर काटना करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग करें और संस्थागत पशु की देखभाल के अनुसार चूहों euthanize और इच्छामृत्यु के लिए समिति मापदंड का उपयोग करें।
- उदर की स्थिति में माउस रखो। कीटाणुरहित और sagittally खोपड़ी में कटौती। , Sagitally कपाल हड्डी ओपन के एक स्कूप की मदद से जल्दी से मस्तिष्क को हटाने और गोंद का उपयोग करके एक vibratome की थाली पर यह तय कर लो।
- तैयार placedine ठंडा शारीरिक खारा समाधान के साथ थाली भरें।
- Vibratome के साथ 300 माइक्रोन राज्याभिषेक स्लाइस काटें।
नोट: इस प्रक्रिया का पता हैएन कम से कम 8 घंटा 19-21 के एक समय के अंतराल के भीतर कार्यात्मक सेलुलर अध्ययन के लिए उपयुक्त व्यवहार्य बरकरार ऊतक नमूनों उपज के लिए। दरअसल, पहले से ही छह घंटे के बाद शुरू होने वाले इस समय अवधि के बाद, तैयारी कम गुणवत्ता, संभावित कार्रवाई पीढ़ी और प्रसार जैसे बुनियादी और कार्यात्मक गुणों में अर्थात् परिवर्तन को दर्शाता है। - सेक्शनिंग के बाद, ACSF के साथ भरा एक 12 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में तुरंत एक टुकड़ा हस्तांतरण।
- टुकड़ा प्रति सावधानी से 5 एक्स 10 5 OT-मैं टी कोशिकाओं जोड़ें।
- एक मशीन में अप करने के लिए 8 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए स्लाइस सेते हैं।
- ऊष्मायन अवधि, फसल स्लाइस और बाद अक्टूबर यौगिक ऊतक टेक का उपयोग करके उन्हें एम्बेड और तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज। मूल्यांकन, जैसे करने के लिए आगे ऊतकीय अध्ययन के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरोनल संरचना (उदाहरण के लिए, का उपयोग करते हुए विरोधी MAPII या विरोधी synaptophysin एंटीबॉडी) या apoptosis (स्टोर उन्हें जैसे, विरोधी कस्पासे 3 एंटीबॉडी और विरोधी NeuN विरोधी का उपयोग करनिकायों) मानक प्रक्रियाओं के अनुसार।
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Representative Results
Oligodendrocyte निर्देशित सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क स्लाइस की ऊष्मायन के बाद, oligodendrocytes के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स में apoptosis (आंकड़े 2A और 1C, क्रमशः) से गुजरना। Apoptosis के histological लक्षण (जैसे, कस्पासे -3, TUNEL) जल्द से जल्द ऊष्मायन के तीन घंटे के बाद पता लगाया जा सकता है। ऊष्मायन अवधि तैयारी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों की एक अच्छी गुणवत्ता की गारंटी करने के क्रम में अब 8 घंटा से अधिक नहीं होना चाहिए। Apoptotic कोशिकाओं सभी मेलिनकृत क्षेत्रों में प्रमुखता के साथ टुकड़ा भर में पाया जा सकता है। संरचनात्मक अखंडता और apoptotic न्यूरॉन्स के लिए टुकड़ा की अनुकरणीय ऊतकीय धुंधला चित्रा 1 ए सी में दिखाया गया है।
परिणाम मापदंडों का आकलन करने के लिए ब्याज की हैं जो ऊष्मायन के दौरान अलग-अलग समय अंक हैं। हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन एक विशिष्ट समय पाठ्यक्रम के बाद अर्थात्, सेल सेल बातचीत समय 0 पर, फिर 3, 4 और 6 घंटा (अधिकतम बातचीत मनाया गया), विश्लेषण करती पैरामीटर शामिल हैंबातचीत शुरू कर दिया। अक्सर बहुत संक्षेप में वर्णन किया गया हैं लागू किया जा सकता है, जो ऊतकीय विश्लेषण से परे कुछ विशिष्ट assays के:
टी सेल वसूली और विश्लेषण
8 घंटा अप करने के लिए एक ऊष्मायन अवधि के बाद, टी कोशिकाओं स्लाइस से बरामद किया जा सकता है और इस तरह के साइटोकाइन उत्पादन या प्रसार के रूप में इंट्रासेल्युलर प्रेरक अणुओं के सापेक्ष मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। टी कोशिकाओं को पुन: प्राप्त करने के लिए, स्लाइस यंत्रवत् अलग थे और हर प्रयोगात्मक हालत के लिए एक साथ जमा। प्रकोष्ठों 2500 rpm पर इंटरफ़ेस से 30 मिनट के लिए एक 30% से 50% Percoll (Amersham, फ्रीबर्ग, जर्मनी) के बाद घनत्व ढाल centrifugation अलग थे। इस तरह, यह उदाहरण सीडी 8 के लिए, धोया और हम इस प्रोटोकॉल में, पता करना चाहते हैं अध्ययन के आधार पर बदलती जो एंटीबॉडी का एक अलग संख्या और प्रकार का उपयोग तकनीक (FACS) प्रवाह cytometry का उपयोग कर तुरंत दाग थे जो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव है + 18।
चित्रा -1 के रूप में दिखाया न्यूरोनल स्वास्थ्य और कार्यक्षमता के बारे में जानकारी, इस तरह की कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) पीढ़ी के रूप में न्यूरॉन्स की बुनियादी गुणों का मूल्यांकन करने के लिए, electrophysiological रिकॉर्डिंग जैसे प्रदर्शन से मूल्यांकन किया जा सकता है।
चित्रा 1. टुकड़ा के morphological संरचना के रूप में अच्छी तरह से प्रतिनिधि का परिणाम है। ऊष्मायन के बाद एक टुकड़ा 8 घण्टे की (ए) के morphological संरचना। स्केल बार 10 माइक्रोन इंगित करता है। MAPII (हरा) और synaptophysin (लाल) धुंधला के लिए सह-धुंधला से पता चला (बी) न्यूरॉन्स synaptically जुड़े रहते हैं। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) हिप्पोकैम्पस एक में apoptotic कोशिकाओं (कस्पासे -3, लाल) और न्यूरॉन्स (NeuN, हरा) के प्रतिनिधि तस्वीरfter 6 घंटा ऊष्मायन। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) एक murine cortical न्यूरॉन में depolarizing वर्तमान चरणों का पालन न्यूरोनल कार्रवाई संभावित पीढ़ी की एकल कोशिका पैच दबाना रिकॉर्डिंग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. एकाधिक stainings प्रोटोकॉल का specifity आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया। (ए) NogoA (लाल) के सह-धुंधला, परिपक्व oligodendrocytes (ODCs) और Caspase3 (apoptosis को, हरा) के लिए एक मार्कर ODCs CD8 + टी कोशिकाओं द्वारा हमला कर रहे हैं कि पता चलता है। Caspase3 (लाल) GFAP, glial कोशिकाओं (हरा) के लिए एक मार्कर के साथ सह-सना हुआ है जब (बी) इंटरेक्शन परिणाम नकारात्मक है। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) Specificiप्रोटोकॉल के Ty बाएं से शुरू, Caspase3 (लाल) के साथ neuronal कोशिकाओं के सह-धुंधला (नीला DAPI) द्वारा समर्थित है: गुम्मट जानवर, गुम्मट जानवरों है OTI-मैं टी कोशिकाओं से अवगत कराया, ODC-अंडाणु और ODC-अंडाणु OTI-मैं टी कोशिकाओं से अवगत कराया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
विभिन्न पशु मॉडल एमएस जैसे सूजन demyelinating विकारों के रोग सुविधाओं को संबोधित करने के लिए पिछले दशकों में वर्णित किया गया है। विवो माउस और चूहे मॉडल व्यापक रूप से इस बीमारी के pathophysiological सुविधाओं की नकल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, अर्थात्, demyelination और remyelination प्रक्रियाओं के परिणामों का विश्लेषण और सूजन और neurodegeneration की intermingled प्रकरणों की। फिर भी, केवल एक पूर्व vivo दृष्टिकोण सटीक अंतर्निहित तंत्र काटना करने देता है।
तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी भी एक व्यापक रूप से वितरित मॉडल है और विश्वसनीय और replicable के रूप में माना जा सकता है। सेल बातचीत - अलगाव और oligodendrocyte-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऊष्मायन के साथ संयोजन में, यह विशेष रूप से तंत्र और एक प्रतिरक्षा सेल हमले और सेल के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के मामले में, विशिष्ट प्रयोगात्मक सवालों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य पूर्व vivo दृष्टिकोण से जाना जाता है और व्यापक रूप से कर रहे हैं22 का इस्तेमाल किया लेकिन अर्थात् OT-मैं टी कोशिकाओं के संपर्क में अवगत कराया है या नहीं गुम्मट में Caspase3 immunoreactivity की पुष्टि करने, विभिन्न "बहिष्कार" सह stainings प्रदर्शन से चुनौती दी जा सकती है कि लक्ष्य की विशिष्टता में हमारे प्रोटोकॉल की नवीनता (चित्रा -2 देखें) ।
तैयारी के दौरान कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं प्रयोगों methodologically सही प्रदर्शन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए विचार, अर्थात् प्रयोगात्मक सेटिंग, में रखा जाना चाहिए; आंतरिक वैधता, अलगाव और इस्तेमाल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए विश्लेषण (FACS) प्रवाह cytometry, जैसे के माध्यम से एक नियमित आधार पर नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, मस्तिष्क स्लाइस की जाँच के जीवन शक्ति अत्यधिक की सिफारिश की है। प्रयोगात्मक समूहों उम्र और लिंग-मिलान किया जाना चाहिए। प्रयोगों को हमेशा के पशु कल्याण नियमों के अनुपालन में किया जाना चाहिए।
प्रोटोकॉल के कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रस्तुत मॉडल हैएक पूर्व vivo दृष्टिकोण और पूरी तरह स्व-प्रतिरक्षित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र संबंधी विकार के जटिल प्रतिरक्षात्मक स्थिति नकल करने के लिए अनुकूल नहीं है। यह भी मॉडल केवल सीडी 8 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संचालित का उपयोग करता है कि विचार किया जाना चाहिए। सीडी 4+ टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं को एक कम प्रमुख भूमिका निभाते हैं। इन प्रकार की कोशिकाओं को संबोधित जब अन्य oligodendrocyte-विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार का उपयोग कर वैकल्पिक प्रोटोकॉल पर विचार किया जाना चाहिए। उम्मीद की ऊतकीय खोज oligodendroglial (2A चित्रा देखें) और neuronal apoptosis के (चित्रा 1C देखें) है। वैकल्पिक रूप से, अन्य प्रकार की कोशिकाओं में apoptosis जैसे, astroglial या न्यूरोनल विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक सिस्टम का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। इस विशिष्ट प्रोटोकॉल में astroglial कोशिकाओं में Caspase3 की immunoreactivity के कारण प्रणाली (चित्रा 2B) की विशिष्टता के लिए नकारात्मक था।
वर्णित प्रोटोकॉल एक बुनियादी न्यूरो के रूप में माना जा सकता हैप्रतिरक्षाविज्ञानी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और अन्य अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है। विशिष्ट सीडी 4 + टी कोशिकाओं और - प्रायोगिक प्रक्रिया को आसानी से अलग विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार (जैसे, माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) का उपयोग के साथ संयोजन में बदलती मस्तिष्क स्लाइस (जैसे, विभिन्न ट्रांसजेनिक चूहों उपभेदों) द्वारा अन्य प्रोटोकॉल को लागू किया जा सकता है मस्तिष्क oligodendroglial और neuronal apoptosis के पर उनके प्रभाव का पता C57BL / 6 चूहों से तैयार स्लाइस)। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की इन विट्रो सक्रियण विशिष्ट प्रतिरक्षाविज्ञानी सवाल (टी एच 1 या टी एच 17 कोशिकाओं) में जैसे, ध्रुवीकरण के लिए अलग किया जा सकता है।
कभी कभी, मस्तिष्क स्लाइस में बढ़ाया या कम apoptosis के एक प्रयोगात्मक चुनौती हो सकती है। समस्या निवारण के लिए कुछ सिफारिशें की हैं:
सबसे पहले, मस्तिष्क स्लाइस की गुणवत्ता हमें का पीएच मान, परासारिता और ऑक्सीकरण की स्थिति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तैयारी के समय की अत्यधिक निर्भर हैएड समाधान। यह परिस्थितियों स्वतंत्र प्रयोगों के बीच तुलना कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता एक नियमित आधार पर नियंत्रित किया जाना चाहिए। इष्टतम प्रतिजन एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं। प्रयोगों की स्थापना का इस्तेमाल किया जब प्रतिजन का अनुमापन पर विचार करें।
ऊपर वर्णित है, का उल्लेख किया प्रोटोकॉल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र अखंडता पर आगे प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार (जैसे, सीडी 4+ टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं) के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन तरीकों ऊतकीय विश्लेषण अच्छी तरह से मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप oligodendroglial और neuronal कोशिकाओं पर उनके प्रभाव को अलग करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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