Protocol
Tutti gli esperimenti che utilizzano topi devono essere effettuate in conformità con le linee guida del rispettivo cura degli animali e l'uso del comitato istituzionale.
1. Osservazioni generali per esperimenti del mouse
- Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro l'accesso a cibo e acqua ad libitum.
NOTA: E 'importante usare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché i modelli immunologiche possono variare a seconda dell'età e del sesso.
2. Preparazione e attivazione di OVA-specifiche cellule T CD8 + (OT-I)
- Eseguire la stimolazione di cellule OT-I T come descritto di seguito 5 giorni prima della preparazione fettine di cervello.
NOTA: 5 x 10 5 effettrici attivato CD8 + OT-I cellule T (CD8 + T-cellule di topi transgenici che riconoscono solo l'OVA 257-264 peptide nel contesto di molecole MHC-I) sono necessari per fetta della concentrazione 5 x 10 5 è stato scelto esperimentoalleati come quella ottimale per favorire una buona interazione cellula-cellula, una volta che le cellule iniziano a migrare nella fetta e, allo stesso tempo, la quantità di cellule non è troppo elevata per indurre una reazione eccessiva permettendo conteggio singola cella 8,18. - Preparare il supporto per la coltura di cellule T OT-I. Supplemento 500 ml DMEM con siero fetale bovino al 5% (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutammina, 50 mM 2-mercaptoetanolo, 1% aminoacidi non essenziali e 25 ug / ml di gentamicina. Conservare il mezzo a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Rimuovere la milza di OT-I topi transgenici come da riferimento 16. Trasferirle nel mezzo preparato.
- Generare sospensione singola cella da schiacciare milza attraverso un colino e centrifugare la sospensione di 70 micron a 300 xg per 5 minuti, 4 ° C.
- Incubare sospensione cellulare con 5 ml di ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7,3) per 5 minuti per lisare i globuli rossi.
- Smettere incubaticon il supporto 10 ml e centrifugare nuovamente come sopra descritto.
- Diluire sospensione cellulare in media e calcolare i numeri. Cellule piastra a una densità di 3 x 10 7 cellule / pozzetto in una piastra 12 pozzetti e prime loro da incubazione con OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) e interleuchina 2 (IL-2) (500 UI / ml) per 5 giorni.
- Dopo 4 giorni, aggiungere IL-2 ad una concentrazione di 500 UI di nuovo / ml.
- Successivamente alla stimolazione, purificare OT-I linfociti T di sospensione cellulare utilizzando un negativo del mouse basata selezione kit di isolamento delle cellule T CD8 + seguendo le istruzioni del produttore. La purificazione si basa sulla deplezione di tutti CD8 + cellule non utilizzando un cocktail di anticorpi contro CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC di classe II, Ter-119, e TCRγ / δ che vengono poi scartati utilizzando colonne magnetiche per l'eluizione delle cellule T CD8 + purificate.
NOTA: passaggi critici in questo Operazire sono indicati dalla fabbrica: è importante che la reazione coinvolge solo singole cellule perché la presenza di grumi potrebbe bloccare la colonna durante la fase di eluizione; contando della cella prima di aggiungere il cocktail Byotin è importante per il grado di purezza del campione e la procedura deve essere eseguita su ghiaccio per minimizzare binding anticorpi aspecifici.
3. Preparazione di acuta Fette cervello e co-coltura con cellule T OT-I
- Prima della preparazione di cerebrale acuto seziona 19, preparare la soluzione ghiacciata placedine fisiologica salina con il saccarosio 200 mM, 20 TUBI mM, 2,5 mM KCl, 1,25 destrosio 0,5 CaCl 2 e 10 mM mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, e liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) utilizzando 125 mM NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO mM 24 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM destrosio. Regolare il pH di ogni soluzione a 7,35 per using NaOH. Prima di regolare il pH del ACSF, soluzione deve gorgogliare con una miscela di 95% O 2 e 5% CO 2.
- Pre-raffreddare le soluzioni.
- Anestetizzare 8 - 10 settimane di età topi (ad esempio, C57BL / 6 come controllo o transgenici ODC-OVA 17 topi con inalazione usando 5,0% isoflurano, 5,0% alotano o iniettare 100 mg / kg ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina via ip Attendere per l'anestesia e utilizzare un pizzico punta a valutare il livello di anestesia e decapitare in una volta. Euthanize topi secondo la cura degli animali istituzionale e utilizzare criteri di commissione per l'eutanasia.
- Mettere il mouse in posizione ventrale. Disinfettare e tagliare il cuoio capelluto sagittale. Aprire l'osso cranico sagitally, rimuovere il cervello rapidamente con l'aiuto di una paletta e fissarla sulla piastra di vibratome utilizzando colla.
- Riempire la piastra con la soluzione salina preparata placedine ghiacciata fisiologico.
- Tagliare 300 micron fette coronali con vibratome.
NOTA: Questa procedura è saperen cedere campioni di tessuto intatta vitali adeguati studi cellulari funzionale all'interno di un intervallo di tempo di almeno 8 ore 19-21. Infatti, dopo questo periodo di tempo, a partire già dopo 6 ore, il preparato dimostra qualità ridotta, cioè cambiamenti nelle proprietà di base e funzionali come l'azione potenziale di generazione e propagazione. - Dopo il sezionamento, trasferire immediatamente una fetta in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti pieni di ACSF.
- Aggiungi attentamente 5 x 10 5 cellule OT-I T per fetta.
- Incubare fette fino a 8 ore in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Dopo il periodo di incubazione, fette di raccolta e incorporare mediante ottobre composto Tissue-Tek e congelarli in azoto liquido. Conservarli a -20 ° C per ulteriori studi istologici per esempio, valutare la struttura neuronale (ad esempio, utilizzando anti-MAPII o anti-sinaptofisina) o apoptosi (ad esempio, utilizzando anti-caspasi-3 anticorpi e anti-NeuN controorganismi) secondo le procedure standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo incubazione di fette di cervello con CD8 + T-cellule oligodendrociti-diretta, oligodendrociti nonché neuroni apoptosi (Figure 2A e 1C, rispettivamente). Segni istologici di apoptosi (ad esempio, caspasi-3, Tunel) possono essere rilevati prima dopo 3 ore di incubazione. Il periodo di incubazione non deve essere superiore a 8 ore per garantire una buona qualità della preparazione e risultati riproducibili. Le cellule apoptotiche possono essere trovati in tutto il fetta con preponderanza in aree mieliniche. Esemplare colorazione istologica della fetta per l'integrità strutturale e neuroni apoptotici è illustrato in Figura 1A-C.
Ci sono diversi momenti durante l'incubazione che sono di interesse per la valutazione dei parametri di risultato. Un corso tempo tipico eseguite nel nostro laboratorio comprende parametri analizza, vale a dire, le interazioni cellula-cellula al tempo 0, poi 3, 4 e 6 ore (l'interazione massima osservata) dopointerazione iniziato. Alcuni saggi tipici oltre le analisi istologiche che spesso possono essere applicati sono descritti brevemente:
Il recupero e l'analisi delle cellule T
Dopo un periodo di incubazione fino a 8 ore, le cellule T possono essere recuperati da fette e possono essere valutati per analizzare parametri relativi alle molecole effettrici intracellulari come la produzione di citochine o di proliferazione. Per recuperare le cellule T, le fette erano dissociate meccanicamente e raggruppate per ogni condizione sperimentale. Le cellule sono state isolate dall'interfaccia un Percoll (Amersham, Freiburg, Germania) dopo centrifugazione in gradiente di densità 30% al 50% per 30 min a 2500 rpm. In questo modo, è possibile ottenere cellule mononucleate che sono stati lavati e macchiati immediatamente utilizzando tecniche di citometria a flusso (FACS) usando un diverso numero e tipo di anticorpi che variano a seconda dello studio vogliamo affrontare, in questo protocollo, ad esempio CD8 + 18.
Informazioni su salute neuronale e funzionalità può essere valutata eseguendo elettrofisiologico es registrazione, per valutare le proprietà di base dei neuroni come potenziali di azione (AP) generazione, come mostrato nella Figura 1D.
Figura 1. struttura morfologica della fetta e risultati rappresentativi. (A) la struttura morfologica di una fetta 8 ore dopo l'incubazione. Bar Scala indica 10 micron. (B) I neuroni sono sinapticamente interconnessi come rivelato da co-colorazione per MAPII (verde) e sinaptofisina (rosso) colorazione. Bar Scala rappresenta 10 micron. (C) immagine Rappresentante di cellule apoptotiche (Caspase-3, rosso) e neuroni (NeuN, verde) nell'ippocampo unopo 6 ore di incubazione. Bar Scala rappresenta 10 micron. (D) le registrazioni cella singola patch-clamp di azione neuronale potenziale generazione seguenti operazioni correnti depolarizzanti in un neurone corticale murino. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. colorazioni multiple eseguite per valutare specificità del protocollo. (A) Co-colorazione NOGOA (rosso), un marker di oligodendrociti maturi (ODCs) e Caspase3 (apoptosi, verde) indica che ODCs sono attaccati dalle cellule T CD8 +. (B) Risultato Interaction è negativo quando Caspase3 (rosso) è co-macchiato di GFAP, un marker per le cellule gliali (verde). Bar Scala rappresenta 10 micron. (C) Specificity del protocollo è supportato dal co-colorazione delle cellule neuronali (DAPI, blu) con Caspase3 (rosso), partendo da sinistra: animali WT, animali WT esposti a cellule T OTI-I, ODC-Ova e ODC-Ova esposti a cellule OTI-I T. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diversi modelli animali sono stati descritti nel corso degli ultimi decenni, per affrontare le caratteristiche patologiche di disturbi demielinizzanti infiammatorie come MS. In vivo modelli di topo e ratto sono ampiamente utilizzati per simulare le caratteristiche fisiopatologiche della malattia, vale a dire, l'analisi delle conseguenze dei processi di demielinizzazione e rimielinizzazione e di episodi Interlacciati di infiammazione e neurodegenerazione. Tuttavia, solo un approccio ex vivo consente di sezionare gli esatti meccanismi sottostanti.
Preparazione di fette cerebrali acute è anche un modello ampiamente distribuito e può essere considerato affidabile e ripetibile. In combinazione con l'isolamento e l'incubazione delle cellule immunitarie specifiche oligodendrociti, può essere utilizzato per indirizzare specifiche domande sperimentali, soprattutto in termini di meccanismo e la cinetica di un attacco immunitario cellula e cellula studiare - interazioni cellulari. Altri approcci ex vivo sono noti e ampiamenteusato 22 ma la novità del nostro protocollo nella specificità del bersaglio che può essere impugnato eseguendo diversi "esclusione" co-colorazioni, cioè verifica della immunoreattività Caspase3 in WT esposti o non esposti alle cellule OT-I T (vedere la Figura 2C) .
Alcuni punti critici durante la preparazione devono essere presi in considerazione, cioè le impostazioni sperimentali, per garantire che gli esperimenti vengono eseguiti metodologicamente corretta; per la validità interna, l'isolamento e la stimolazione delle cellule immunitarie utilizzati dovrebbero essere controllati regolarmente via esempio, citometria a flusso analisi (FACS). Inoltre, la verifica di vitalità fettine di cervello è altamente raccomandato. Gruppi sperimentali devono essere per età e sesso. Gli esperimenti dovrebbero sempre essere eseguiti nel rispetto delle norme sul benessere degli animali.
Alcune limitazioni del protocollo devono essere tenuti in considerazione. La cosa più importante, il modello presentato èun approccio ex vivo e non è adatto per imitare perfettamente la complessa situazione immunologica di disturbi del sistema nervoso centrale autoimmuni. Va inoltre considerato che il modello utilizza solo CD8 + T-cellule guidato risposta immunologica. CD4 + T-cellule e le cellule B hanno un ruolo meno prominente. Protocolli alternativi che utilizzano altri sottotipi di cellule immunitarie specifiche per oligodendrociti devono essere considerati al momento di affrontare questi tipi di cellule. La scoperta istologico previsto è oligodendrogliale (vedi Figura 2A) e l'apoptosi neuronale (vedi Figura 1C). In alternativa, l'apoptosi di altri tipi di cellule può essere ottenuta utilizzando ad esempio, astrogliale o cellule immunitarie antigene-specifiche neuronali e sistemi transgenici. In questo protocollo specifico l'immunoreattività di Caspase3 in cellule astrogliali è negativo dovuto alla specificità del sistema (Figura 2B).
Il protocollo descritto può essere considerato come un neuro baseimmunologica approccio sperimentale e possono essere modificate per altre applicazioni. La procedura sperimentale può essere facilmente applicato ad altri protocolli da varie sezioni di cervello (per esempio, diversi ceppi di topi transgenici) in combinazione con diversi sottotipi di cellule immunitarie antigene-specifiche (ad esempio, utilizzare mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) - specifica cellule T CD4 + e fettine cerebrali preparati da topi C57BL / 6 di affrontare i loro effetti sulla oligodendrogliale e apoptosi neuronale). In vitro attivazione di cellule immunitarie possono essere variati per specifiche domande immunologici (ad esempio, in polarizzazione T H 1 o T H 17 cellule).
A volte, potenziati o ridotta apoptosi in fettine di cervello potrebbe essere una sfida sperimentale. Alcune raccomandazioni per la risoluzione dei problemi sono:
Inizialmente, la qualità di fette di cervello è fortemente dipendente di tempo di preparazione e pH, osmolarità e lo stato di ossidazione di noisoluzione ed. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra gli esperimenti indipendenti. Inoltre, l'attivazione delle cellule immunitarie dovrebbe essere controllata su base regolare. Concentrazione dell'antigene ottimale può variare. Consideriamo una titolazione dell'antigene utilizzato per stabilire gli esperimenti.
Come descritto sopra, il protocollo menzionato può essere utilizzato come punto di partenza per analizzare l'effetto di altri sottotipi di cellule immunitarie (ad esempio, cellule T CD4 +, cellule B) sulla integrità del sistema nervoso centrale. Questi approcci sono particolarmente adatti per la separazione dei loro effetti sulle cellule oligodendrogliali e neuronali come l'analisi istologica può essere valutato a fondo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
