Protocol
Todos los experimentos con ratones se deben realizar de acuerdo con las directrices del respectivo comité de cuidado de los animales y el uso institucional.
1. Comentarios generales para experimentos con ratones
- Mantenga los ratones en condiciones libres de patógenos y les permitirá el acceso a alimentos y agua ad libitum.
NOTA: Es importante la utilización de ratones por edad y sexo en los grupos experimentales porque los patrones inmunológicos pueden variar con la edad y el género.
2. Las células T específicas de OVA Preparación y activación de CD8 + (OT-I)
- Realice la estimulación de las células T OT-I como se describe a continuación 5 días antes de la preparación de cortes de cerebro.
NOTA: 5 x 10 5 efectoras CD8 + activadas OT-I células T (células T CD8 + de ratones transgénicos que reconocen sólo el OVA 257-264 péptido en el contexto de moléculas MHC-I) se necesitan por rebanada La concentración 5 x 10 5 fue elegido experimentoaliado como uno óptima para favorecer una buena interacción célula-célula una vez que las células comienzan a migrar a la rebanada y, al mismo tiempo, la cantidad de células no es demasiado alta para inducir una reacción exagerada de una sola célula lo que permite contar 8,18. - Preparar el medio para el cultivo de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM con 5% de suero de ternera fetal (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 micras 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos no esenciales y 25 mg / ml de gentamicina. Almacenar el medio a 4 ° C hasta su uso.
- Retirar el bazo de OT-I ratones transgénicos como por referencia 16. Transferirlos al medio preparado.
- Generar suspensión de células individuales por maceración bazos a través de un filtro de 70 micras y se centrifuga la suspensión a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
- Incubar suspensión de células con 5 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) tampón (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH 7,3) durante 5 min para lisar las células rojas de la sangre.
- Deje de incubatien 10 ml con medio y se centrifuga de nuevo como se describió anteriormente.
- Diluir la suspensión celular en medio y calcular números. Células de la placa a una densidad de 3 x 10 7 células / pocillo en una placa de 12 pocillos y se les prime por incubación con OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) y la interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 días.
- Después de 4 días, añadir IL-2 a una concentración de 500 UI / mL de nuevo.
- Después de la estimulación, purificar OT-I células T de suspensión celular mediante el uso de un ratón basado selección negativa kit de aislamiento de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación se basa en el agotamiento de todas las células no-CD8 + mediante el uso de un cóctel de anticuerpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Clase II, Ter-119, y TCRγ / δ que luego son desechados por el uso de columnas magnéticas para la elución de las células T CD8 + purificados.
NOTA: Los pasos críticos en este procedire se indican por los fabricantes: es importante que la reacción implica sólo células individuales debido a la presencia de grupos podría bloquear la columna durante la etapa de elución; contando de la celda antes de añadir el cóctel Byotin es importante para el grado de pureza de la muestra y el procedimiento se debe realizar en hielo para minimizar los enlaces de anticuerpos no específicos.
3. Preparación de rodajas de cerebro agudo y co-cultivo con células T OT-I
- Antes de la preparación de cerebral aguda rebana 19, preparar la solución salina placedine fisiológica enfriada con hielo usando sacarosa 200 mM, tubos de 20 mm, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de dextrosa NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl 2 y 10 mM y el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) utilizando NaCl 125 mM, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM de dextrosa. Ajuste el pH de cada solución a 7,35 por using NaOH. Antes de ajustar el pH de ACSF, solución debe burbujeó con una mezcla de 95% O 2 y 5% de CO 2.
- Pre-enfriar las soluciones.
- Anestesie 8 - 10 semanas de edad ratones (por ejemplo, ratones C57BL / 6 como control o ratones transgénicos ODC-OVA 17 con la inhalación usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano o inyectar 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal a través de xilazina ip Espere para la anestesia y utilizar una pizca dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia y decapitar a la vez. La eutanasia a los ratones como por el cuidado de animales institucional y utilizar criterios del comité para la eutanasia.
- Ponga el ratón en posición ventral. Desinfectar y cortar el cuero cabelludo sagital. Abra el hueso craneal sagital, retire el cerebro rápidamente con la ayuda de una cuchara y fijarlo en el plato de un vibratome utilizando pegamento.
- Llene la placa con la solución salina preparada placedine enfriado con hielo fisiológica.
- Cortar 300 micras cortes coronales con la vibratome.
NOTA: Este procedimiento se conocen para producir muestras de tejido intactas viables adecuados para estudios celulares funcionales dentro de un intervalo de tiempo de al menos 8 hr 19-21. En efecto, después de este período de tiempo, ya partir después de las 6 horas, la preparación muestra una menor calidad, es decir, cambios en las propiedades básicas y funcionales como la acción potencial de generación y propagación. - Después de seccionar, transferir una rebanada de inmediato en cada pocillo de una placa de 12 pocillos lleno de ACSF.
- Añadir con cuidado 5 x 10 5 células OT-I T por rebanada.
- Incubar las rebanadas para un máximo de 8 horas en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
- Después del período de incubación, las rebanadas de cosecha e integrarlos mediante OCT compuesto tejido-tek y congelarlos en nitrógeno líquido. Almacenar a -20 ° C para otros estudios histológicos a por ejemplo, evaluar la estructura neuronal (por ejemplo, usando anti-MAPII o anticuerpos anti-sinaptofisina) o apoptosis (por ejemplo, utilizando anti caspasa-3-anticuerpos y anti-NeuN contracuerpos) de acuerdo con procedimientos estándar.
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Representative Results
Después de la incubación de secciones de cerebro con células T de oligodendrocitos dirigida CD8 +, oligodendrocitos, así como las neuronas sufren apoptosis (Figuras 2A y 1C, respectivamente). Signos histológicos de la apoptosis (por ejemplo, la caspasa-3, Tunel) pueden ser detectados más temprano después de 3 horas de incubación. El período de incubación no debe ser de más de 8 horas con el fin de garantizar una buena calidad de la preparación y resultados reproducibles. Las células apoptóticas se pueden encontrar en todo el sector con preponderancia en zonas mielinizadas. Tinción histológica ejemplar de la rebanada para la integridad estructural y las neuronas apoptóticas se representa en la Figura 1A-C.
Hay diferentes puntos de tiempo durante la incubación que son de interés para la evaluación de los parámetros de resultados. Un curso de tiempo típico realizado en nuestro laboratorio incluye parámetros de análisis, a saber, las interacciones célula-célula en el tiempo 0, a continuación, 3, 4 y 6 hr (la interacción máxima observada) después deinteracción comenzó. Algunos ensayos típicos más allá de los análisis histológicos que a menudo se pueden aplicar se describen muy brevemente:
La recuperación y el análisis de las células T
Después de un período de incubación de hasta 8 horas, las células T pueden ser recuperados de las rebanadas y se pueden evaluar para analizar parámetros relativos a las moléculas efectoras intracelulares tales como la producción de citoquinas o la proliferación. Con el fin de recuperar las células T, las rebanadas se disociaron mecánica y agruparon para cada condición experimental. Las células fueron aisladas de la interfaz de un 30% a 50% de Percoll (Amersham, Freiburg, Alemania) después de la centrifugación en gradiente de densidad durante 30 minutos a 2500 rpm. De esta manera, es posible obtener células mononucleares que se lavaron y se tiñeron inmediatamente usando técnicas de citometría de flujo (FACS) utilizando un número diferente y tipo de anticuerpos que varían dependiendo del estudio que queremos abordar, en este protocolo, por ejemplo CD8 + 18.
Información acerca de la salud y la funcionalidad neuronal puede evaluarse mediante la realización de la grabación por ejemplo electrofisiológico, para evaluar las propiedades básicas de las neuronas tales como los potenciales de acción (AP) generación, como se muestra en la Figura 1D.
Figura 1. estructura morfológica de la rebanada, así como resultados representativos. (A) estructura morfológica de una rebanada 8 hr después de la incubación. La barra de escala indica 10 micras. (B) Las neuronas están interconectadas sinápticamente según lo revelado por co-tinción para MAPII (verde) y sinaptofisina (rojo) tinción. La barra de escala representa 10 micras. (C) Imagen Representante de células apoptóticas (caspasa-3, rojo) y las neuronas (NeUN, verde) en el hipocampo de unespués de 6 horas de incubación. La barra de escala representa 10 micras. (D) las grabaciones de células individuales patch-clamp de acción neuronal potencial de generación siguientes pasos actuales de despolarización en una neurona cortical murino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Múltiples coloraciones realizaron para evaluar la especificidad del protocolo. (A) Co-tinción de NogoA (rojo), un marcador de oligodendrocitos maduros (ODC) y caspase3 (apoptosis, verde) muestra que los DDC son atacados por las células T CD8 +. (B) Interacción resultado es negativo cuando caspase3 (rojo) es co-teñidas con GFAP, un marcador de células gliales (verde). Barra de escala representan 10 micras. (C) specificiTy del protocolo es apoyado por el co-tinción de las células neuronales (DAPI, azul) con caspase3 (rojo), comenzando desde la izquierda: animales WT, WT animales expuestos a células T OTI-I, ODC-óvulos y ODC OVA- expuestos a células OTI-I T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Diferentes modelos animales se han descrito en las últimas décadas para abordar las características patológicas de trastornos desmielinizantes inflamatorias como la esclerosis múltiple. En vivo modelos de ratón y de rata son ampliamente utilizados para imitar las características fisiopatológicas de la enfermedad, es decir, el análisis de las consecuencias de los procesos de desmielinización y remielinización y de episodios entremezcladas de inflamación y neurodegeneración. Sin embargo, sólo un enfoque ex vivo permite diseccionar los mecanismos subyacentes exactas.
Preparación de rodajas de cerebro agudos es también un modelo ampliamente distribuido y puede ser considerado como fiable y reproducible. En combinación con el aislamiento y la incubación de las células inmunitarias de oligodendrocitos específica, que puede ser utilizado para tratar preguntas experimentales específicas, especialmente en términos de estudiar el mecanismo y la cinética de un ataque inmune célula y célula - célula interacciones. Otros enfoques ex vivo son conocidos y ampliamenteutiliza 22 pero la novedad de nuestro protocolo en la especificidad del objetivo que puede ser impugnada mediante la realización de diferentes "exclusión" compañeros de coloraciones, es decir, la verificación de la inmunorreactividad caspase3 en WT expuestos o no expuestos a células OT-I T (véase la Figura 2C) .
Algunos puntos críticos durante la preparación se deben tomar en consideración, a saber, los parámetros experimentales, para asegurar que los experimentos se llevan a cabo metodológicamente correcto; la validez interna, el aislamiento y la estimulación de las células inmunes utilizados deben ser controlados de forma regular a través de por ejemplo, citometría de flujo (FACS) análisis. Por otra parte, es muy recomendable comprobar la vitalidad de rodajas de cerebro. Los grupos experimentales deben ser la edad y el sexo. Los experimentos siempre deben realizarse en cumplimiento de la normativa de bienestar animal.
Algunas limitaciones del protocolo deben ser tenidos en cuenta. Lo más importante, el modelo presentado esun enfoque ex vivo y no es adecuado para imitar completamente la compleja situación inmunológica de trastornos del sistema nervioso central autoinmunes. También se debe considerar que el modelo utiliza sólo CD8 + de células T impulsado respuesta inmunológica. Las células T CD4 + y células B juegan un papel menos prominente. Protocolos alternativos que utilizan otros subtipos de células inmunes-oligodendrocitos específica se deben considerar al abordar estos tipos de células. El hallazgo histológico esperado es oligodendroglial (véase la figura 2A) y la apoptosis neuronal (véase la Figura 1C). Alternativamente, la apoptosis de otros tipos de células se puede lograr usando, por ejemplo, astroglial o células inmunes específicas de antígeno neuronales y sistemas transgénicos. En este protocolo específico la inmunorreactividad de caspase3 en las células astrogliales fue negativo debido a la especificidad del sistema (Figura 2B).
El protocolo descrito puede ser considerado como un neuro básicaenfoque experimental inmunológica y pueden ser modificados para otras aplicaciones. El procedimiento experimental se puede aplicar fácilmente a otros protocolos de diferentes cortes de cerebro (por ejemplo, diferentes cepas de ratones transgénicos) en combinación con diferentes subtipos de células inmunes específicas de antígeno (por ejemplo, usar la glicoproteína de mielina de los oligodendrocitos (MOG) - las células T CD4 + específicas y rodajas de cerebro preparados a partir de ratones C57BL / 6 para hacer frente a sus efectos sobre oligodendroglial y la apoptosis neuronal). In vitro la activación de las células inmunes se pueden variar para preguntas inmunológicos específicos (por ejemplo, la polarización en T H 1 o T H 17 células).
A veces, la apoptosis potenciada o reducida en rodajas de cerebro podría ser un desafío experimental. Algunas recomendaciones para la solución de problemas son:
Al principio, la calidad de cortes de cerebro es altamente dependiente del tiempo de preparación así como el valor pH, la osmolaridad y la oxidación de estado de nosotrossolución ed. Se debe asegurar que las condiciones son comparables entre los experimentos independientes. Además, la activación de las células inmunes debería ser controlada en una base regular. La concentración óptima de antígeno puede variar. Considere la posibilidad de una titulación del antígeno utilizado al establecer los experimentos.
Como se describió anteriormente, el protocolo mencionado se puede utilizar como punto de partida para analizar el efecto de otros subtipos de células inmunes (por ejemplo, células T CD4 +, células B) en la integridad del sistema nervioso central. Estos enfoques son especialmente adecuados para la separación de sus efectos sobre las células oligodendrogliales y neuronales como el análisis histológico se puede evaluar a fondo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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