Summary
FIM ऐसे सी के रूप में छोटे से चलती वस्तुओं को ट्रैक करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक उपन्यास, लागत प्रभावी इमेजिंग प्रणाली है एलिगेंस, planaria या ड्रोसोफिला लार्वा। साथ FIMTrack कार्यक्रम तेज और कुशल डाटा विश्लेषण देने के लिए बनाया गया है। साथ में, इन उपकरणों का व्यवहार लक्षण के उच्च throughput विश्लेषण अनुमति देते हैं।
Abstract
neuronal नेटवर्क समारोह का विश्लेषण व्यवहार लक्षण की एक विश्वसनीय माप की आवश्यकता है। आज़ादी से घूम रहा है जानवरों के व्यवहार को कुछ हद तक चर रहा है के बाद से, कई जानवरों सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण किया जाना है। यह बदले में हरकत पैटर्न के एक कंप्यूटर सहायता स्वचालित मात्रा का ठहराव की आवश्यकता है। लगभग पारदर्शी और छोटे चलती वस्तुओं की उच्च विपरीत छवियों को प्राप्त करने के लिए, FIM बुलाया निराश कुल आंतरिक प्रतिबिंब के आधार पर एक उपन्यास इमेजिंग तकनीक विकसित की गई थी। इस सेटअप में, जानवरों ही अंतर्निहित रेंगने सतह के साथ संपर्क के बहुत विशिष्ट स्थिति में अवरक्त प्रकाश के साथ प्रकाशित कर रहे हैं। इस पद्धति बहुत ही उच्च विपरीत छवियों में यह परिणाम है। बाद में, इन उच्च विपरीत छवियों स्थापित समोच्च ट्रैकिंग एल्गोरिदम का उपयोग संसाधित कर रहे हैं। इस आधार पर हम मात्रात्मक हरकत की एक विशाल विविधता का वर्णन करने के लिए आवश्यक सुविधाओं की एक संख्या को निकालने के लिए कार्य करता है जो FIMTrack सॉफ्टवेयर, विकसितविशेषताओं। इस सॉफ्टवेयर पैकेज के विकास के दौरान, हम आगे मॉड्यूल की आसान इसके अलावा अनुमति देने के लिए एक खुला स्रोत वास्तुकला के हमारे प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया। कार्यक्रम स्वतंत्र मंच चल रही है और डेटा विश्लेषण के माध्यम से उपयोगकर्ता मार्गदर्शक एक सहज ज्ञान युक्त जीयूआई के साथ है। सभी हरकत पैरामीटर मान आगे डेटा का विश्लेषण की अनुमति के सीएसवी फाइल के रूप में दिया जाता है। इसके अलावा, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में एकीकृत एक परिणाम दर्शक अंतःक्रियात्मक की समीक्षा करने और प्रोत्साहन एकीकरण के दौरान जरूरत हो सकती है, के रूप में उत्पादन को समायोजित करने का अवसर प्रदान करता है। FIM और FIMTrack की शक्ति ड्रोसोफिला लार्वा की हरकत का अध्ययन करके प्रदर्शन किया है।
Introduction
अधिकांश जानवरों के एक उच्च परिष्कृत और नियंत्रित तरीके से स्थानांतरित करने की क्षमता है। आनुवंशिक आधार अंतर्निहित हरकत नियंत्रण समझने के लिए यह मात्रात्मक अलग व्यवहार पैटर्न का आकलन करने के लिए अनिवार्य है। इस संबंध में, ड्रोसोफिला एक आदर्श मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं। आज़ादी से उड़ान ड्रोसोफिला की ट्रैकिंग tantalizing 1-4 लेकिन तब होती है अपेक्षाकृत कम गति पर दो आयामों में ड्रोसोफिला लार्वा की रेंगने और इस तरह आसानी से नजर रखी जा सकती है। उचित रोशनी के साथ संयुक्त कैमरा आधारित setups के छवियों 5 प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है। घटना या प्रेषित प्रकाश दोनों व्यवहार प्रयोगों 6,7 में कार्यरत है। हालांकि, की वजह लार्वा और लार्वा आंदोलनों के रेंगने सतह वफादार रिकॉर्डिंग के संभावित प्रकाश प्रतिबिंब की अर्द्ध पारदर्शी शरीर के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस तरह की समस्याओं को दूर करने के लिए, कुछ जटिल तरीकों को तैयार किया गया है। हाल ही में, अंधेरे क्षेत्र रोशनी अग्रभूमि / पृष्ठभूमि शेष भाग को बढ़ाने के लिए शुरू की गई थीRAST 8। कैमरा आधारित रिकॉर्डिंग, लेंस-कम ऑप्टिकल इमेजिंग और के लिए एक विकल्प के रूप में छवि संवेदक-कम पर चिप अधिग्रहण तकनीक 9-11 पेश किया गया है।
कई ट्रैकिंग कार्यक्रम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर 12 और कस्टम समाधान सहित, हाल ही में शुरू किया गया है। उच्च throughput ट्रैकिंग कार्यक्रम के लिए उदाहरण मल्टी कृमि ट्रैकर (एमडब्ल्यूटी) कर रहे हैं 13 और Multianimal चाल और ट्रैक (MAGAT) 8। टकराने जानवरों कई नए पशु पहचान करने के लिए नेतृत्व इतना है कि दोनों आम में, कि कई जानवरों के लिए एक भी खुले मैदान क्षेत्र में लगाया जा सकता है। इस सीमा को पार करने के लिए, एक बहु अच्छी तरह से सेटअप व्यक्तिगत कुओं में 14 में 12 पशुओं को अलग पेश किया गया था। एकल व्यक्तियों की हरकत की सटीक मात्रा का ठहराव एक माइक्रोस्कोप 15 के साथ संयोजन में एक जंगम ट्रैकिंग मंच का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इन सभी दृष्टिकोणों या तो लागत अक्षम हैं, कमी पर्याप्त पुनःसमाधान या उच्च throughput phenotyping के लिए काफ़ी समय भी।
हताश होकर कुल आंतरिक परावर्तन (FTIR) 16 (चित्रा 1) के आधार पर ऊपर उल्लेख किया सीमाओं को पार करने के लिए, हम विकसित किया है FIM (FTIR आधारित इमेजिंग विधि)। इस नई इमेजिंग दृष्टिकोण एक अभूतपूर्व उच्च विपरीत प्रदान करता है और यहां तक कि जानवरों 16 रेंगने की बहु रंग रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। इस काम के लिए और प्रभावी विधि के मूल सिद्धांत के लिए आसान है। एक एक्रिलिक गिलास प्लेट प्रकाश से भर जाता है (उदाहरण के लिए, 875 अवरक्त एनएम)। कारण एक्रिलिक शीशे और हवा के विभिन्न अपवर्तक सूचकांक करने के लिए, प्रकाश पूरी तरह से ग्लास / हवा सीमा पर परिलक्षित होता है। एक्रिलिक कांच का कोई हीटिंग 16 उल्लेख किया है। एक उच्च अपवर्तक सूचकांक के साथ वस्तुओं प्रकाश में बाढ़ आ गई तालिका स्पर्श, तभी इन वस्तुओं में प्रवेश प्रकाश कर सकते हैं। जानवरों की सतह को छूने, तो प्रकाश परिलक्षित होता है और (चित्रा 1) के नीचे से कब्जा कर लिया जा सकता है। परिणाम में, केवल संपर्कपशुओं के क्षेत्र में एक समग्र काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ विस्तृत इमेजिंग की अनुमति देता है जो एक उज्ज्वल हाजिर, के रूप में प्रकट होता है। इस प्रकार, FIM-इमेजिंग कंप्यूटर दृष्टि एल्गोरिदम के लिए एकदम सही फिल्में रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है। FIM की सरल और मजबूत उपयोग अब तक पहुँचने में जटिल पशुओं के व्यवहार की विस्तृत उच्च throughput विश्लेषण लाता है और प्रसंस्करण जानकारी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, महक 8, 16; दृष्टि 17 या thermosensation 18।
गर्मी प्रोत्साहन एकीकरण और अंतर्निहित भौतिक सिद्धांतों के साथ 1. FIM सेटअप चित्रा। (ए) FIM सेटअप। रोशनी की तीव्रता सामने पैनल पर विनियमित किया जा सकता है। (बी) के एक गर्मी प्रोत्साहन देने के लिए, एक काले, एल्यूमिनियम प्लेट चित्रित दोनों पक्षों में गर्म और ठंडे पानी के साथ perfused, अगर सतह से ऊपर 2 मिमी रखा गया है जोखुद को 2 मिमी मोटी है। ढाल तापमान अंतर से गर्मी रेडिएटर प्लेट और अगर पर स्थापित है (सी) निराश कुल आंतरिक प्रतिबिंब के भौतिक सिद्धांत:। एक एक्रिलिक कांच की थाली अवरक्त प्रकाश से प्रकाशित किया जाता है। θ 1, θ 2, और θ 3 प्रकाश प्रतिबिंब कोण से संकेत मिलता है। एन ए, 1, 2 n और एन 3 एन क्रमशः वायु, एक्रिलिक गिलास, अगर और लार्वा की अपवर्तक सूचकांक निरूपित और असमानता n एक <एन 1 <2 n <एन 3 को पूरा करना। कारण अपवर्तन, प्रतिबिंब कोण संक्रमण के दौरान बदलता है। कोण महत्वपूर्ण कोण से नीचे है, प्रकाश है अब और प्रतिबिंबित नहीं होता है, परतों के माध्यम से पारित कर सकते हैं और नीचे से कब्जा कर लिया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सपाFIM ने विश्लेषण किया जा सकता है कि प्रक्रियाओं के ectrum व्यापक है। किसी भी आगे समायोजन के बिना, FIM इमेजिंग ड्रोसोफिला (चित्रा 5 ब) के सभी लार्वा चरणों की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या ड्रोसोफिला 19 वयस्क के पैर के निशान का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सी के इसी तरह, trajectories एलिगेंस या planarian flatworms की आवाजाही आसानी से (चित्रा 5C) दर्ज किया जा सकता है। फंगल hypha या रूट बाल विकास की भी विश्लेषण संभव 19 प्रकट होता है। हमारे वर्तमान FIM सेटअप में, 4 एक्स 16 अवरक्त प्रकाश उत्सर्जक डायोड (IR- एल ई डी) (चित्रा 1) ट्रैकिंग तालिका कहा जाता है, एक 32 X 32 सेमी 2 एक्रिलिक कांच की थाली में एकीकृत कर रहे हैं। आईआर-एल ई डी की तीव्रता आसानी से पल्स चौड़ाई मॉडुलन (PWM) के माध्यम से सर्किट से जुड़ा एक माइक्रो नियंत्रक द्वारा किया जा सकता है, जो ट्रैकिंग मेज पर वस्तुओं के वजन के आधार पर निकाला जाता है। FIM रोशनी की तीव्रता का एक व्यापक रेंज पर बहुत उच्च विपरीत छवियों पैदावार। महत्वपूर्ण बात है, यह जनरलपहले से ही कम समग्र अवरक्त irridation में उत्कृष्ट परिणाम erates।
एक अवरक्त फिल्टर के साथ एक कैमरा सेटअप में अतिरिक्त उत्तेजनाओं के एकीकरण की अनुमति देता है जो ट्रैकिंग मेज, नीचे रखा गया है। हीट उत्तेजनाओं को आसानी से एक गर्मी रेडिएटर थाली से लागू किया जा सकता है और प्रकाश उत्तेजनाओं एक एलसीडी प्रोजेक्टर से लागू कर रहे हैं। इसके अलावा odorants सरल पलकों 8 से ढ़ाल में समाहित किया जा सकता है। गर्मी ढाल प्रयोगों के लिए, गर्मी रेडिएटर थाली क्रमशः दोनों पक्षों पर गर्म और ठंडे पानी के साथ perfused है और लार्वा (चित्रा 1 बी) के ऊपर 2 मिमी रखा।
उच्च विपरीत, उच्च गुणवत्ता फिल्मों की पीढ़ी परिष्कृत कंप्यूटर आधारित छवि विश्लेषण के लिए संभावना को खोलता है, इस प्रकार हम छवियों से सुविधाओं का एक बड़ा सेट निकालने के लिए (चित्रा 2) FIMTrack सॉफ्टवेयर लागू किया है। पहले छह प्राथमिक सुविधाओं जानवर (चित्रा 3 ए) के समोच्च से परिभाषित किया गया। इन सुविधाओं के आधार रेखा प्रदानएक निश्चित समय बिंदु (3B चित्रा) में जानवरों के आकार और कुछ उत्तेजनाओं में अपनी स्थिति का वर्णन है, जो छह माध्यमिक सुविधाओं के आगे गणना के लिए। वर्तमान में, नौ तृतीयक सुविधाओं लौकिक पहलुओं को एकीकृत करने और इस प्रकार प्राथमिक और माध्यमिक सुविधाओं (चित्रा -3 सी) के साथ जानवर की हरकत को चिह्नित कर रहे हैं कि गणना कर रहे हैं।
चित्रा 2. FIMTrack सिंहावलोकन, एल्गोरिथम कार्यप्रवाह और लार्वा प्रतिनिधित्व। (ए) कैसे FIMTrack उपयोग करने के लिए। छवियों लोड कर रहे हैं। ग्रे मूल्य सीमा और एकल लार्वा को परिभाषित लार्वा आकार सीमा को सेट किया जाना चाहिए। लार्वा क्षेत्र [मिनट आकार, अधिकतम आकार] में होना चाहिए। ट्रैकिंग हाइलाइट बटन द्वारा शुरू किया गया है। (बी) ट्रैकिंग कार्यप्रवाह। प्रारंभ बटन क्लिक किया जाता है के बाद, पृष्ठभूमि छवि सीए हैlculated (समय के साथ कम से कम तीव्रता)। के रूप में लंबे समय के लिए छोड़ दिया फ्रेम के रूप में वहाँ, लार्वा ग्रे सीमा और मंत्री और अधिकतम आकार दहलीज पर आधारित खंडित कर रहे हैं। लार्वा अभ्यावेदन गणना कर रहे हैं सभी segmentations के लिए ((सी) के लिए तुलना)। प्रत्येक नया मॉडल एक वैध ट्रैक उपलब्ध है अगर एक दिया प्रक्षेपवक्र करने के लिए जुड़ा हुआ है। अंतिम सीमा तक पहुँच जाता है, को अंतिम रूप देने पोस्ट प्रोसेसिंग उत्पादन पीढ़ी द्वारा पीछा किया जाता है। (सी) लारवल प्रतिनिधित्व। जानवर एक सिर और एक पूंछ बिंदु (एच और टी) के होते हैं। इन बिंदुओं के बीच रीढ़ अंक के एक मनमाने ढंग से विषम संख्या मैं एक त्रिज्या R मैं के साथ सेट किया जा सकता है। इसके अलावा, जन मी और कोण γ झुकने मुख्य शरीर के केंद्र गणना कर रहे हैं। कई प्रस्ताव संबंधी मापदंडों बैंगनी लाइनों द्वारा sketched रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
FIMTrack द्वारा गणना 3. सुविधाएँ चित्रा। जानवरों के समोच्च के आधार पर (ए) प्राथमिक सुविधाओं। (बी) माध्यमिक सुविधाओं, प्राथमिक सुविधाओं पर आधारित है। (सी) तृतीयक सुविधाओं, लगातार फ्रेम और अतिरिक्त आदानों में प्राथमिक सुविधाओं के आधार पर इस बात का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।
Protocol
नोट: यहाँ, FIM के उपयोग के लिए स्वतंत्र चलती परिस्थितियों में और एक गर्मी उत्तेजना के प्रभाव में स्क्रीनिंग के लिए लार्वा हरकत का काम उच्च throughput विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया है। ऐसे घ्राण उत्तेजनाओं निर्भर हरकत या अनुरोध पर प्रदान की जाती हैं जो प्रोटोकॉल, के लिए सूक्ष्म परिवर्तन की जरूरत हो सकती रोलिंग या अन्य व्यवहार के उच्च संकल्प इमेजिंग के विश्लेषण के रूप में अन्य अनुप्रयोगों।
प्रयोगों के 1. सेट अप
- सांख्यिकीय सार्थक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कुल (आवश्यक एक घंटा समय) में जीनोटाइप के बारे में प्रति 100 लार्वा का प्रयोग करें। नोट: कई जीनोटाइप तुलना में और अलग अलग दिनों पर दर्ज किए जाने की जरूरत है मामले में, प्रति दिन जीनोटाइप प्रति लार्वा की एक ही नंबर दर्ज करते हैं।
- सबसे अनुप्रयोगों के लिए, पैरामीटर के विश्लेषण के लिए 10 हर्ट्ज पर रिकॉर्ड है। यदि आवश्यक हो तो उच्च संकल्प इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, इमेजिंग गति बदलती हैं।
- तीसरे instar लार्वा, अंडे बिछाने के बाद 120 घंटे के बारे में आचरण प्रयोगों की ट्रैकिंग के लिए। सुर बनाओसंस्कृतियों प्रयोगात्मक अवधि (4.3 देखें) में पर्याप्त लार्वा उपज है कि ई।
- गैर प्रोत्साहन अनुप्रयोगों के लिए, पारदर्शी अगर युक्त एक रेंगने सतह तैयार (धारा 2 देखें)। गर्मी ढाल आवेदन के लिए प्रोत्साहन रेंज में लार्वा को रोकने के लिए, एक प्रतिकूल नमक अगर बाधा (धारा 3 देखें) के साथ देखने के क्षेत्र के चारों ओर।
नोट: अन्य अनुप्रयोगों के विभिन्न सतहों आवश्यकता हो सकती है। - लगातार पर्यावरण की स्थिति (तापमान, प्रकाश, हवा का प्रवाह, हवा में नमी आदि) के साथ एक कमरे का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
2. रेंगने भूतल तैयारी (पारदर्शी अग्रवाल)
नोट: FIM सेटअप में एक अगर सतह एक नम रेंगने सतह प्रदान करने के लिए जोड़ा गया है। इसके अलावा, यह भी रोशनी गुणों में सुधार।
- विआयनीकृत ultrapure पानी में 0.8% खाना ग्रेड अगर उबाल लें। आवेदन की जांच के लिए 400 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
- एक अलग 33 सेमी x 33 सेमी एसी पर 50 डिग्री सेल्सियस (हाथ-गर्म) पर अगर डालोrylic ग्लास प्लेट। अगर की सतह तनाव और इस तरह तापमान अगर स्लैब की मोटाई को परिभाषित करेगा। 50 डिग्री सेल्सियस से कम, 2 मिमी मोटी अगर स्लैब प्राप्त कर रहे हैं। उबलते के बाद आंदोलन और बुलबुले से बचने के लिए लगातार डालना मत करो। के बारे में 4 घंटे के हर इमेजिंग अवधि के लिए नए सिरे से अगर स्लैब तैयार करें।
- स्वच्छ, प्रकार और पूर्व प्रयोग (जीनोटाइप प्रति एक पकवान) के लार्वा अभ्यस्त करने के लिए शेष 0.8% अगर समाधान के साथ मानक 6 सेमी पेट्री डिश भरें।
- एक प्रतिकूल अगर बाधा आवेदन के लिए आवश्यक है, के मामले में धारा 3 के लिए आगे बढ़ें।
- रिकॉर्डिंग के लिए एक विमान वर्ग सतह प्राप्त करने के लिए अगर स्लैब की परिधि के लगभग 2 सेमी बंद ट्रिम। अतिरिक्त अगर निकालें।
नोट: आकार आवेदन पर निर्भर है। - सीधे धीरे एक्रिलिक गिलास प्लेट के किनारे पर ग्लाइडिंग अगर जोर से ठंडा करने के बाद FIM सेटअप करने के लिए अगर स्लैब स्थानांतरण।
3. वैकल्पिक: Craw के लिए एक प्रतिकूल अग्रवाल बैरियर जोड़नालिंग भूतल (नमक अग्रवाल)
- विआयनीकृत ultrapure पानी में 3 एम NaCl के साथ 2.5% खाना ग्रेड अगर उबाल लें। एक गर्मी ढाल में स्क्रीनिंग के लिए 200 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
नोट: मात्रा आवेदन पर निर्भर करता है। - पहले से में एक 2 सेमी चौड़ा पायदान कट दृश्य (22 x 22 सेमी) के क्षेत्र के आसपास के रेंगने सतह डाला।
नोट: अलग बाधा रूपों और देखने के क्षेत्रों आवेदन के आधार पर आवश्यक हो सकता है। - ट्रैकिंग सतह से 0.1-0.3 सेमी उच्च नमक अगर साथ पायदान भरें।
4. फ्लाई हैंडलिंग
- रियर 65% हवा नमी में मानक मक्खी भोजन पर प्रयोग के समय के लिए समायोजित 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मक्खियों।
- पार के लिए, सीओ 2 के साथ 30 कुंवारी महिला मक्खियों और 8 पुरुषों anesthetize और 35 मिलीलीटर भोजन के साथ 130 मिलीलीटर संस्कृति शीशियों में उन्हें पार।
नोट: 35 मिलीलीटर भोजन के साथ एक 130 मिलीलीटर संस्कृति शीशी के बारे में 20-30 एल निकलेगा4 घंटे की इमेजिंग अवधि के भीतर तीसरे instar लार्वा खा लिया। सभी लार्वा instar चरणों के लिए इमेजिंग और ट्रैकिंग काम करता है। - देर तीसरे instar लार्वा आंदोलन ड्राइव और एक छोटे तूलिका का उपयोग कर शीशी दीवारों से सबसे बड़ी लार्वा इकट्ठा करने के लिए संस्कृति शीशियों में एक छोटी सी बूंद पानी।
- रिकॉर्डिंग से पहले 2-5 मिनट, आदत डालना और उन्हें साफ करने के लिए विआयनीकृत अल्ट्रा शुद्ध पानी में 0.8% खाना ग्रेड अगर युक्त एक पेट्री डिश के लिए एक वीडियो के लिए स्थानांतरण लार्वा।
5. रिकॉर्डिंग के लिए FIM इमेजिंग सेटअप (गैर प्रोत्साहन शर्तें) का समायोजन
- यदि आवश्यक हो तो कैमरे के लेंस फोकस और एपर्चर समायोजित करें। संबंधित कैमरे के लिए जोखिम समय निर्धारित करें।
नोट: ये सेटिंग एक प्रयोग के दौरान परिवर्तित करने की आवश्यकता नहीं है। - एक लार्वा इमेजिंग द्वारा अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए रोशनी की तीव्रता को समायोजित करें।
- रिकॉर्डिंग के दौरान कमरे निरंतर में पर्यावरण की स्थिति में रखें। दिशात्मक प्रकाश के साथ लार्वा को परेशान नहीं करने के लिए कमरे गहरा करें।
6. वैकल्पिक: रिकॉर्डिंग के लिए FIM इमेजिंग सेटअप (क्रमिक तापमान प्रोत्साहन शर्तें) का समायोजन
नोट: गर्मी ढाल डिवाइस शीर्ष साइट पर एक मैट काले रंग और अलग सामग्री के साथ एक 42 X 42 X 0.2 सेमी 3 एल्यूमिनियम प्लेट है। प्लेट दोनों सिरों पर calorifiers / कूलर और पंप करने के लिए लॉग इन दो अलग-अलग सर्किट से पानी के साथ perfused है (चित्रा 1 बी देखें)। तापमान -5 से 50 डिग्री सेल्सियस तक नियंत्रित किया जा सकता है।
- प्रयोगों के लिए पहले गर्मी ढाल डिवाइस एक घंटा चालू करें और संतुलित करने के लिए वांछित तापमान प्रोफाइल और घटकों को स्थापित करने की अनुमति देने के लिए सेटअप के ऊपर यह जगह।
- स्थापना के लिए एक नमक बाधा के साथ रेंगने सतह अगर स्थानांतरण।
- अगर अधिक रेडिएटर थाली प्लेस और (~ लार्वा ऊपर 1 मिमी) थाली और 2 मिमी रेंगने सतह के बीच अंतर को समायोजित।
- की एक रेखीय ढाल स्थापितकम से कम 0.8 डिग्री सेल्सियस 34 डिग्री सेल्सियस (लगभग। देखने के क्षेत्र में अवरोध से 2 सेमी) से 18 डिग्री सेल्सियस (लगभग। देखने के क्षेत्र में विपरीत स्थल पर बाधा से 2 सेमी) का समायोजन करके करने के लिए / सेमी 1 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी सर्किट के तापमान।
नोट: धातु की थाली के विभिन्न ढाल गुण अनुभव से पता लगाया जा करने की जरूरत है, जो अलग तापमान की आवश्यकता होती है। ये सेटिंग्स प्रयोगों के दौरान परिवर्तित करने की आवश्यकता नहीं है। - खंड 5 में वर्णित के रूप में सेटिंग्स समायोजित करें।
- रेंगने सतह 20 मिनट के लिए प्रयोगों से पहले ढाल में संतुलित करने की अनुमति दें। एक पाइरोमीटर के साथ तापमान ढाल का परीक्षण करें।
- धारा 8 के साथ आगे बढ़ें।
7. FIM इमेजिंग (गैर प्रोत्साहन शर्तें)
- धीरे आदी होना पेट्री डिश से 15 लार्वा को इकट्ठा करने और ट्रैकिंग सतह के केंद्र के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए एक छोटा सा गीला तूलिका का प्रयोग करें। खाद्य रहता है या बहुत ज्यादा स्थानांतरण नहीं हैपानी (7.8 देखें)।
- रिकॉर्ड 1 - 22 सेमी x 22 सेमी ट्रैकिंग क्षेत्र पर 50 लार्वा। (सांख्यिकीय कारणों जीनोटाइप के अनुसार कम से कम 100 व्यक्तियों के उपयोग के लिए) सबसे स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए वीडियो प्रति 15 जानवरों का प्रयोग करें।
- धीरे लार्वा अलग है और सभी लार्वा रिकॉर्डिंग से पहले सीधे स्थानांतरित करने के लिए शुरू कर दिया जब तक के बारे में 10-20 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
- गैर प्रोत्साहन स्थितियों के लिए प्रति सेकंड 10 तख्ते पर 2 मिनट के लिए लार्वा हरकत रिकार्ड। आउटपुट स्वरूप के रूप में असम्पीडित TIF छवियों का उपयोग करें।
- रिकॉर्डिंग के दौरान, उन्हें अभ्यस्त करने के लिए शीशियों से अगले वीडियो के लिए लार्वा इकट्ठा महत्वपूर्ण:। प्रकाश के साथ दर्ज लार्वा को परेशान मत करो।
- रिकॉर्डिंग के बाद, एक बड़े तूलिका के साथ लार्वा को हटाने और स्थानीय सुरक्षा और कानून के नियमों के अनुसार उन्हें त्यागें।
- लार्वा को हटाने के बाद, स्वच्छ और अल्ट्रा शुद्ध विआयनीकृत पानी से भर सतह moisturize करने के लिए तूलिका का उपयोग करें।
- महत्वपूर्ण: सभी समय पर नम सतह रखें लेकिन अत्यधिक मो बचनेhalos या रिकॉर्डिंग में लार्वा आसपास के बूंदों और परेशान नज़र रखने के रूप में देखा जा सकता है जो isture,।
8. वैकल्पिक: FIM इमेजिंग (क्रमिक तापमान प्रोत्साहन शर्तें)
- तापमान ढाल (धारा 6 को देखें) की स्थापना की है, के बाद (8.2 देखें) जैसे रेंगने सतह पर लार्वा रखने के बाद 20 सेकंड के भीतर रिकॉर्डिंग पल के लिए रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर तैयार करते हैं, वीडियो फ्रेम प्रति की संख्या निर्धारित करने और बचत पथ को परिभाषित।
- थोड़ा रेडिएटर थाली लिफ्ट और नमक की बाधा से 33 डिग्री सेल्सियस 2 सेमी पर लार्वा जगह है। आगे सामान्य निर्देश के लिए 6 और 7 को देखें। फिर रेडिएटर थाली लोअर और लार्वा सीधे स्थानांतरित करने के लिए शुरू कर दिया है के बाद सीधे 3-4 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग शुरू।
- रिकॉर्डिंग के बाद, सीधे, साफ लार्वा को हटाने और सतह moisturize। NaCl के प्रसार से बचने के लिए नमक अगर हाथ मत लगाओ।
- महत्वपूर्ण: सभी समय पर नम सतह रखें लेकिन बचनेhalos या रिकॉर्डिंग में लार्वा आसपास के बूंदों और परेशान नज़र रखने के रूप में देखा जा सकता है जो अत्यधिक नमी,।
- छवियों की बचत और अगले वीडियो के लिए तैयार करने से पहले नए जानवरों जबकि सभा, अगर सतह 1-2 मिनट के लिए मॉइस्चराइजिंग के बाद फिर से संतुलित करने की अनुमति दें। एक पाइरोमीटर हर 5 वीडियो का उपयोग तापमान ढाल नियंत्रण और अगर जरूरत (ट्रैकिंग सतह के संबंध में पानी का तापमान, ऊंचाई, और xy अभिविन्यास) तापमान डिवाइस को समायोजित।
लारवल हरकत की 9. ट्रैकिंग
नोट: अधिक जानकारी के FIMTrack (पूरक) के लिए संलग्न पुस्तिका का संदर्भ लें। एक कार्यक्रम के प्रवाह चार्ट के लिए यह आंकड़ा 2 देखें।
- पूर्वावलोकन विकल्प का उपयोग संबंधित प्रयोगों के लिए ट्रैकिंग मापदंडों को समायोजित करें।
- कैमरा और देखने के क्षेत्र के अनुसार सेमी प्रति पिक्सेल समायोजित करें।
- कैमरा सेटिंग के आधार पर प्रति सेकंड तख्ते को समायोजित करें।
- वें इतनी चमक थ्रेसहोल्ड समायोजित करेंसभी जानवरों में (प्रतिक्रिया पूर्वावलोकन में दी गई है) सही ढंग से पता चला रहे हैं।
- लार्वा क्षेत्र आकार थ्रेसहोल्ड समायोजित करें। पूर्वावलोकन में प्रतिक्रिया के विकल्प नोट: एकल जानवरों लाल रंग में डाला जाता है और प्रत्येक जानवर के क्षेत्र नीले रंग में दिया जाता है लार्वा टकराने, पीले रंग में डाला जाता है।
- नीचे सही में बटन का उपयोग करके ट्रैकिंग शुरू।
नोट: सफल नज़र रखने के बाद, लार्वा पटरियों और गणना की हरकत और मुद्रा सुविधाओं से युक्त एक सीएसवी फ़ाइल की विशेषता एक छवि छवि निर्देशिका में संग्रहीत किया जाता है। - ट्रैकिंग परिणाम की समीक्षा करने और मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए FIM परिणाम दर्शक मॉड्यूल (संपादित करें> परिणाम दर्शक ...) का प्रयोग करें। यदि आवश्यक हो, एक odorant स्रोत के लिए गर्मी ढाल या दूरी के सम्मान में उन्मुखीकरण रेंगने, प्रोत्साहन शासन जैसे के संबंध में डेटा का मूल्यांकन करने के लिए प्रोत्साहन क्षेत्रों को परिभाषित। अधिक विस्तृत विवरण के लिए मैनुअल (पूरक) का उपयोग करें।
डाटा के 10 मूल्यांकन
- एक्सेल, Matlab में सीएसवी फ़ाइल या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किसी भी अन्य कार्यक्रम आयात करें।
Representative Results
विभिन्न संकल्प गुणों के साथ कई अलग अलग कैमरों इमेजिंग के लिए (चित्रा 4) परीक्षण किया गया। एक उपयुक्त आईआर फिल्टर से लैस है, जहां सभी कैमरों। इस परीक्षा में सबसे कम कीमत कैमरे के कम संकल्प के अनुसार, देखने के क्षेत्र में 10 सेमी x 10 सेमी तक सीमित है। सबसे अच्छा परिणाम एक 4 मेगापिक्सेल (मध्य प्रदेश) कैमरे का उपयोग कर प्राप्त किया गया। इस तीसरे instar लार्वा लंबाई प्रति 100 पिक्सल के एक संकल्प की ओर जाता है और आसानी से आंतरिक संरचना को पहचान करने की अनुमति दी। इसके अतिरिक्त, जानवर के peristalsis को आसानी से (चित्रा -4 ए) निकाला जा सकता है। हालांकि, एक अभी भी FIMTrack से विश्लेषण किया जा सकता है जो कम महंगे कैमरे का उपयोग करते हुए उच्च विपरीत फिल्मों प्राप्त कर सकते हैं। 8 बिट की गहराई और 1392 X 1040 पिक्सल के एक संकल्प के साथ एक 1.4 सांसद कैमरे का उपयोग के बारे में आधी कीमत है और देखने के क्षेत्र में तीसरे instar लार्वा लंबाई प्रति 45 पिक्सल के एक संकल्प की अनुमति देता है। सिर लेकिन कोई अन्य आंतरिक संरचना पहचाना जा सकता है (चित्रा 4 बी)। ट्रैकिंग और क्रमाकुंचन का पता लगाने के लिए संभव है, लेकिन शुद्धता (4B चित्रा) से कम है।
1.4 सांसद कैमरा करने के लिए तुलनीय एक स्थानिक संकल्प के साथ एक और भी सस्ता 0.8 सांसद कैमरा के साथ, लार्वा सिर (चित्रा 4C) अब और ईमानदारी से मान्यता प्राप्त नहीं किया जा सकता। ट्रैकिंग और क्रमाकुंचन विश्लेषण संभव है, लेकिन वृद्धि हुई शोर के आधार पर अधिक घबराना भी शामिल है। हैरानी की बात है, यहां तक कि एक कम संकल्प यूएसबी वेब कैमरा (20 €, चित्रा 4D नीचे, 0.3 मेगापिक्सल कैमरा) लार्वा प्रक्षेप पथ की गणना करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता फिल्मों प्रदान करता है। क्रमाकुंचन क्षेत्र से गणना की जा सकती है, लेकिन माप बहुत शोर कर रहे हैं।
हमारे सेटअप में हम नियमित रूप से चार सांसद कैमरे का उपयोग करें। स्क्रीनिंग के लिए, इस कैमरे जाहिर उच्च throughput विश्लेषण संभव है इतना है कि एक साथ जानवरों की बड़ी संख्या का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है जो एक 22 सेमी x 22 सेमी अखाड़ा, निगरानी की अनुमति देता। इस सेटिंग का उपयोग करना, लार्वा लंबाई मैंअभी भी रिकॉर्डिंग और क्रमाकुंचन के विश्लेषण की अनुमति देता है जो 40 पिक्सल द्वारा प्रतिनिधित्व किया है। एक गर्मी ढाल में 15 लार्वा trajectories के एक अनुकरणीय छवि चित्रा 5A में दी गई है। इसके अलावा, एक मैक्रो लेंस के उपयोग के कई आंतरिक अंगों दिखाई देने लगते हैं और सिर मान्यता आगे (चित्रा 5 ब) में सुधार हुआ है, जहां बहुत उच्च संकल्प के साथ छवि लार्वा की अनुमति देता है। इसके अलावा इन एक विस्तृत श्रृंखला 20 के व्यवहार के आगे और अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक ही स्थापना आसानी से छवि सी रेंगने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस कीड़े (चित्रा 5C)।
चित्रा अलग कैमरों के लिए 4. FIM इमेजिंग और ट्रैकिंग का परिणाम है। बाएं (ए): 10 एफपीएस के साथ एक चार सांसद कैमरे का उपयोग कर लिया एक 10 सेमी x 10 सेमी ट्रैकिंग मंच पर रेंगने तीन लार्वा की FIM इमेजिंग। मिड:कतरन और एक एकल लार्वा की बड़े पैमाने पर प्रक्षेपवक्र के केंद्र। जानवर के क्षेत्र संकेत दिया है। अधिकार: लार्वा का क्षेत्रफल 100 तख्ते पर साजिश रची है। (ए) के बराबर है, लेकिन एक 0.8 सांसद कैमरा का उपयोग कर लिया लाल तीर काटा छवि का समय बिंदु इंगित करता है। (ए) के बराबर है, लेकिन एक 1.4 सांसद कैमरा का उपयोग कर लिया (बी)। (सी)। (डी) के बराबर ( ए), लेकिन एक 0.3 मेगापिक्सल कैमरे का उपयोग कर कब्जा कर लिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. गर्मी प्रोत्साहन, और उच्च संकल्प अनुप्रयोगों। (ए) हीट प्रोत्साहन आवेदन (1 चित्रा के लिए तुलना)। Trajectories फाई के माध्यम से गणना कीMTrack। (बी) के एक मैक्रो लेंस का उपयोग कर एक, तीसरे दूसरी और पहली instar लार्वा के उच्च संकल्प आवेदन छवि। तीसरे instar लार्वा लंबाई 2.5 एक्स 2.5 सेमी के दृश्य के एक क्षेत्र में 400 पिक्सल का प्रतिनिधित्व करती है। (सी) ए सी एलिगेंस कीड़ा FIM इमेजिंग का उपयोग कर लिया। स्केल सलाखों संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
व्यवहार तंत्रिका विज्ञान में यह मात्रात्मक जटिल व्यवहार लक्षण समझने के लिए अनिवार्य है। इस प्रकार, लोगों की बड़ी संख्या उच्च संकल्प पर मनाया और स्वचालित किया जाना चाहिए प्रक्रियाओं सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं। इधर, FIM इमेजिंग, जानवरों की एक विस्तृत श्रृंखला की हरकत पर नजर रखने के लिए साधन प्रदान करता है जो एक उपन्यास, सरल और मजबूत इमेजिंग सेटअप, वर्णित है। FIM इमेजिंग सेटअप की प्रभावकारिता ड्रोसोफिला लार्वा, planarian flatworms और सी का उपयोग कर परीक्षण किया गया था एलिगेंस कीड़े। FIM प्रौद्योगिकी जैसे मस्तिष्क, ट्रेकिआ, पेट या proventriculus के रूप में पशुओं का भी आंतरिक संरचना का पता लगाने के लिए आंतरिक रूप से उच्च विपरीत प्रदान करता है। वे स्वचालित रूप से पशु 19 के उन्मुखीकरण की पहचान करने के लिए सेवा कर सकते हैं कि इतना महत्वपूर्ण बात है, इन आंतरिक संरचना मजबूती के साथ की पहचान कर रहे हैं।
फिल्मों की गुणवत्ता रेंगने की सतह पर पानी की अत्यधिक मात्रा से प्रभावित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह करने के लिए महत्वपूर्ण हैअगर की नमी को नियंत्रित। सतह पर काफी पुराना अगर या बहुत अधिक पानी कलाकृतियों का कारण बन सकता है। इसी तरह, कोई हवाई बुलबुले रेंगने सतह में शामिल हैं जो सुनिश्चित करते हैं। सामान्य में, एक अच्छी तरह से तैयार अगर सतह 4 घंटे के लिए फिल्मों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।
कारण अंतर्निहित भौतिक सिद्धांतों के लिए FIM इमेजिंग एक शानदार छवि गुणवत्ता, जिसके परिणामस्वरूप लगभग शोर मुक्त छवि रिकॉर्डिंग उत्पन्न करता है। यह बदले में बाद में कंप्यूटर आधारित छवि विश्लेषण की सुविधा और उच्च throughput सक्षम बनाता है। हालांकि, कार्यप्रणाली सीधे अगर सतह से संपर्क करें कि जानवरों का विश्लेषण करने के लिए प्रतिबंधित है। ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर एक डोनट आकार के गठन जानवरों द्वारा चुनौती दी है। एक द्विआधारी सूचक डोनट आकार पहचानता है, एक गलत रीढ़ की गणना की जा सकती है।
कारण ट्रैकिंग तालिका दोहरे और तिहरे रंग इमेजिंग की मॉड्यूलर निर्माण करने के लिए पहुंच में है। इसके अलावा, अतिरिक्त उत्तेजनाओं (प्रकाश, odorants, बिजली या यांत्रिक उत्तेजनाओं) आसानी से किया जा सकता है डेलऊपर से ivered। FIM इमेजिंग की शक्ति का मिलान करने के लिए डिज़ाइन किया गया FIMTrack कार्यक्रम आसानी से ड्रोसोफिला लार्वा, सी ट्रैक करने के लिए अपनाया जा सकता है एलिगेंस या planarians। इस प्रकार और इसकी वजह से सरल और सस्ते निर्माण करने के लिए (http://FIM.uni-muenster.de देखें), FIM इमेजिंग बायोमेडिकल आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संभव है और विशेष रूप से तत्काल उच्च throughput अध्ययन की जरूरत है की अनुमति देता है।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
हम FIM सेटअप के निर्माण में मदद के लिए इस परियोजना को शुरू कर दी है, जो एस थॉमस, जे हरमन और अमेरिकी Burgbacher करने के लिए आभारी हैं। इस काम DFG (SFB 629 बी -6) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
| Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
| Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
| Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
| Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
| Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
| Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
| Standard Fly food | Custom | ||
| Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
| Petri dishes 9 cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
| Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
| NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
| Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
| Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
| Pyrometer | Trotec | BP20 |
References
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