Biology

Интернационализация и наблюдение флуоресцентных биомолекул в живых микроорганизмов с помощью электропорации

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/52208

Louise Aigrain^1,2, Marko Sustarsic¹, Robert Crawford¹, Anne Plochowietz¹, Achillefs N. Kapanidis¹

¹Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford, ²Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Center

Introduction

Большинство исследований флуоресценции внутри живых клеток зависит от слитых белков с флуоресцентными белками (FPS), таких как GFP ^1. Эти флуоресцентные метки позволяют исследования числа копий, диффузии рисунком или локализации белков, участвующих в процессах, таких как генной экспрессии или мембранного транспорта ^2-7. Рамочные обеспечивают высокую маркировки специфику, простоту реализации, и доступны в большом инвентаризации вариантах с различной фотофизических и химических свойств ^1. Тем не менее, органические флуорофоры остаются основным выбором для экспериментов в пробирке из-за их большей фотостабильностью (до 100 раз более устойчивы, чем FPS) ^8,9, малый размер (до 100 раз меньший объем, чем FPS) и легкость внутримолекулярной маркировки (главным образом, за счет использования остатков цистеина). Все эти факторы особенно важны для флуоресценции одиночных молекул и FRET исследования ^10.

Несколько методов интернализации Combinчисле преимущества органического маркировки и при обнаружении естественных были введены в последнее десятилетие; Однако, такие методы либо используют относительно большие полипептиды меток (например, TMP, галоген или 20 кДа SNAP метки) ^11-14, требуют использования неприродных аминокислот ^15, или ограничиваются большими, одной мембраны эукариотических клетках (например. загрузка путем соскоба, шприц нагрузку, микроинъекции) ^16-19.

Этот протокол описывает новый, простой и высокой пропускной метод интернализации, которая соединяет преимущества органических флуорофоров с наблюдением в естественных условиях. Для разработки этого метода, мы адаптировали процедуры электропорации, который обычно используется для трансформации клеток плазмидой ДНК ^20,21, чтобы загрузить микроорганизмов, таких как E. палочки или S. Cerevisiae с органически маркированных биомолекул. Протокол состоит из 4 простых шага: инкубация клеток с мечеными биомолекул,электропорации, восстановление клеток и стиральная клеток для удаления не усвоены биомолекул. Здесь мы представляем этот электропорации протокол, а также ячейки изображения и анализа данных процессов для исследования флуоресценции клеток на основе и одиночных молекул и ладу сигналы.

Электропорации зависит от выгрузки электрическое поле высокого напряжения на низкой ионной силы суспензии клеток с образованием переходные поры мембраны, через которые биомолекулы могут проникать в клетки (фигура 1) ^20,21. Так же, как трансформации бактерий или дрожжей с плазмидной ДНК, клетки должны быть подготовлены до электропорации, чтобы обеспечить их electrocompetency. Эта процедура, состоящая из нескольких стадий промывки водой, увеличивает проницаемость мембран и снижает ионной силы раствора клеток, чтобы избежать искрения в кювету для электропорации. В этом протоколе, клетки могут быть получены, как описано ниже (см протокол: 1,1) или покупали у коммерческого поставщикас.

Рисунок 1: Схематическое представление протокола интернализации Слева направо:. Добавить несколько микролитров меченых биомолекул на аликвоты электрокомпетентных клеток (фрагментов дважды меченных ДНК и бактерии в этом примере); инкубировать от 1 до 10 мин на льду и переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации; электропорации, а затем добавить 0,5-1 мл обогащенной среды к клеткам непосредственно после; инкубировать при 37 ° С (или требуемой температуры в организме, например, 29 ° C для дрожжей), чтобы восстановить клетки; Выполните 5 стиральные шаги, чтобы удалить лишнюю, не являющихся усвоенные меченые молекулы; ресуспендируйте конечный осадок в 100-200 мкл буфера PBS и пипеткой 10 мкл на агарозном площадку; покрыть панель с очищенной покровного и изображения на флуоресцентного микроскопа (в режиме широкого поля или в режиме Хило).

(Рисунок 1). Избыток без интернализированных меченых биомолекул сначала удаляют путем промывки в буфере, содержащем достаточно высокую концентрацию соли с добавлением моющего средства (см протокол: 3,3). Наличие соли нарушает неспецифические электростатические взаимодействия, образованные без интернализированных меченых биомолекул, которые в противном случае могут прилипать на внешней мембране. Кроме того, наличие моющего средства в промывочном буфере нарушает неспецифические гидрофобных взаимодействий.

В то время как интернализация ДНК является прямым (рис 2), меры предосторожности должны быть приняты при интернализации меченых белков с помощью электропорации, Во-первых, акции образец органично меченого белка может по-прежнему содержат небольшой процент свободного красителя. Молекулы свободного красителя значительно меньше, чем белков и, следовательно, может быть усвоены преимущественно. Для того, чтобы подавляющее большинство наблюдаемых интернализованных флуоресцентных молекул соответствует белку интереса, исходный образец белка должны содержать не более ~ 2% свободного красителя (рисунок 5) ^22. Избыток без интернализированных меченых белков также может прилипнуть к наружной клеточной мембране после электропорации; Это явление является белок-специфических и должна быть проверена для каждого нового белка. Мы предлагаем несколько вариантов, которые позволяют удаление не-усвоены белков из загруженного образца клеток (см протокола: 3.3.3).

Наконец, клетки ресуспендировали в небольшом объеме фосфатного буфера и пипеткой на агарозном площадку, что позволяет их изображений на флуоресцентном микроскопе. Иммобилизация на агарозном колодок Симпле и эффективный способ визуализации клеток на покровное без ущерба для их целостности. Прокладка должна содержать питательную среду с низким уровнем флуоресценции.

Изображений клеток может быть выполнено либо в широкопольных, общая флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) или с помощью Хило (с большим углом наклонения и ламинированные Оптический лист) микроскопии. В конфигурации Хило, лазерный луч проникает глубже в образец, чем в TIRF, пока не осветить весь образец, как и для широкопольных, что позволяет большее отношение ²³ сигнал-шум. В зависимости от разрешения мощности лазера и используемого времени усвоенные биомолекулы, можно пересчитать (с использованием ступенчатого фотообесцвечиванию анализ, рис 3), локализованы, или гусеничный ^24-28. Интернализации дважды меченных конструкций с лобзиком пары флуорофоров позволяет оценить количественно FRET как на одноклеточных или уровни одной молекулы (рисунок 6).

Различные параметры могут быть измененыВ зависимости от желаемой производительности и биологической системы исследуемого. Во-первых, количество интернализованной материала на клетку может быть настроена путем изменения концентрации меченых биомолекул к клеткам добавляли предварительного электропорации (рисунок 2). Сила Электропорация поле также будет влиять как эффективность загрузки и жизнеспособность клеток; как и следовало ожидать, в то время как при увеличении эффективности загрузки с увеличением напряженности поля, жизнеспособность электропорации клеток уменьшается (фиг.4А). Оба параметра могут быть определены количественно путем записи процент загружен и делящиеся клетки после электропорации. Это жизнеспособность анализ в сочетании с флуоресцентной томографии также проверяет соблюдение интернализованных биомолекул в живых клетках и позволяют непрерывное наблюдение в течение нескольких поколений (рис 4б).

В целом, этот протокол позволяет интернализации флуоресцентно меченых ДНК и белка молекул вE.coli или S. Cerevisiae ^26. Отдельные молекулы, меченные органических флуорофоров могут быть отслежены с высокой пространственно-временной разрешающей способности для временных масштабах порядок больше, чем FPS. И, наконец, этот способ является совместимым с широким полем зрения, TIRF и конфокальной обнаружения, а также импульсных схем возбуждения, такие как Алекс (переменный лазерное возбуждение ^28,29).

Protocol

1. Подготовка Cell

Подготовка лабораторного производства электрокомпетентных бактерий
1. Приготовьте 5-10 мл на ночь предварительной культуры из одной колонии штамма E.coli интереса в низких флуоресценции среды, такой как М9 или EZ Rich определенной среде.
2. Утром, привить новую культуру 400 мл с ночной прекультуры такой, что OD _{600 нм} начинается в 0.02. Добавить в 400 мл низкой флуоресценции среднего 2,5 мл 1 М MgSO ₄ и 2,5 мл 1 М MgCl _2.
3. Выращивают при температуре 37 ° С и 250 оборотов в минуту до OD _{600 нм} достигает от 0,4 до 0,6.
4. Остановить рост путем охлаждения культуру в ледяной бане в течение 10-15 мин.
  Примечание: С сегодняшнего дня, выполнять все действия при 4 ° С (на льду).
5. Центрифуга культуры 15 мин при 1000 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 250 мл охлажденной и стерильной дистиллированной H ₂ O.
6. Повторите центрифугирования и ресуспендирования шаги тВайс, уменьшая объем водой до 100 мл и затем 50 мл.
7. Центрифуга культуры 10 мин при 1000 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 25 мл охлажденной и стерильной дистиллированной H ₂ O + 10% глицерина.
8. Повторите центрифугирования и ресуспендирования шаги три раза, уменьшая объем 10% раствора глицерина до 10 мл, 5 мл и, наконец, 500 мкл.
9. Алиготе клетки в аликвоты 20 мкл каждого, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С.
Коммерческие Электрокомпетентные бактериальные клетки
1. Развести коммерческую аликвоту клеток 1: 1 со стерильным охлажденной дистиллированной водой. Сделайте 20 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C.
Подготовка Электрокомпетентные дрожжи
Примечание: Электрокомпетентные S. CEREVISIAE клетки получают до каждого эксперимента электропорации и не могут быть хранили при -80 ° С в течение Е. палочка.
1. Чтобы начать посев 50 мл YPD среде с одной колонии желаемого штамма интерес.
2. Инкубируют при 30 ° С и 250 оборотов в минуту, пока OD _{600 нм} достигает от 0,6 до 0,8.
3. Центрифуга клеток при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
4. Ресуспендируют осадок в 25 мл охлажденной и стерильной дистиллированной H ₂ O.
5. Повторите промывание ресуспендирования два раза в 25 мл воды и ресуспендирования два раза в 2 мл охлажденного раствора сорбита в 1 М.
6. Ресуспендируют клеток в 250 мкл 1 М сорбит, и разделить клетки в 50 мкл аликвоты.

2. агарозном подготовка площадку

Чтобы удалить фоновые флуоресцентные частицы, сжечь покровное в печи при 500 ° С в течение 1 часа. "Чистый сожгли" покровные могут быть сохранены в течение нескольких недель при комнатной температуре, покрытой алюминиевой фольгой.
Примечание: Другие способы обычным моющим такие как плазменной очистки или пираньи раствор может быть использован до тех пор, в качестве фонафлуоресценции очищенных слайдов остается квази-нуль.
Приготовьте раствор агарозы с низким уровнем флуоресценции путем плавления в микроволновой печи 2% агарозном - дистиллированную водный раствор (70 ° C). Сразу добавить 500 мкл четкой 2% раствор агарозы до 500 мкл 2X низкая культура флуоресценции среды и аккуратно перемешать.
Прежде, чем это остывает и твердеет, быстро пипетки это агарозы - средний раствора на покровное микроскопа (Нет 1,5 толщины), чтобы образовать прокладку из примерно 2 см диаметром и несколько миллиметров высоты. Избегайте пузырей и совать их с помощью пипетки советов в случае необходимости.
Свести площадку со вторым "сожгли" покровное (Нет 1,5 толщины, рисунок 1).
Примечание: Этот верхний покровное помогает сформировать плоскую однородную площадку и защищают от пыли и сушки, а клетки в стадии подготовки. Минимальная среда М9, такие как или обогащенной среде, такой как EZ Rich определенной среде были испытаны на их низкой флуоресценции.

3. Electroporatион

Инкубация
1. Добавить до 5 мкл меченых молекул, сохраненных в буфере с низким содержанием соли (<50 мМ соли) в одну аликвоты компетентных клеток (20 мкл бактерий или 50 мкл дрожжей) и инкубируют 10 мин на льду.
  Примечание: Концентрация флуоресцентно меченных молекул в маточных растворов и, таким образом, количество меченых молекул, добавленных в клетке до электропорации непосредственно коррелирует с эффективностью загрузки (рис 3, и обсуждение). Поскольку некоторые белки менее совместим с низкой состоянии соли, концентрация соли в буфере для хранения может быть увеличена, но объем меченых молекул к клеткам добавляли предварительного электропорации, то необходимо уменьшить.
2. Передача смесь клеток и меченых биомолекул в предварительно охлажденный электропорации кюветы (0,1 и 0,2 см расстояния для бактерий и дрожжей, соответственно). Слегка постучите кювету на скамейку, чтобы удалить любые возможные пузыри из раствора.
3. Поместите кубКорвет в электропоратора и применять высоковольтный электрический импульс к решению (от 0,9 до 1,8 кВ / см, см Обсуждение для более подробной информации по выбору напряжение). Такой импульс формирует временные поры в мембранах клеток, позволяющих меченые биомолекулы диффундировать в клетки.
4. Убедитесь, что постоянная времени отображается на электропоратора составляет от 4 до 6 мс. Более низкие постоянные времени часто из-за слишком высокой концентрации соли и / или при наличии пузырьков в кювете, и приведет к очень низкой или вообще не загрузки клеток.
Восстановление
1. Сразу же после электропорации, добавить 500 мкл обогащенной среде, такой как SOC, EZ Богатый определенной среде, YPD или любой обогащенной среде к клеткам.
2. Инкубируйте образца при 37 ° С для бактерий и 29 ° C для дрожжей от 2 до 10 мин. Для измерения жизнеспособности, в котором пользователь хочет, чтобы оценить процент клеток, растущих и деления после электропорации, использовать более длительное время восстановления (до 1 часа) в качестве ше наблюдать такие по времени задержки перед первым делением.
Стиральные шаги
1. Вымойте клетки, чтобы удалить любые не-усвоены биомолекул счет остановки клеток в течение 1 мин при 3300 мкг и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 500 мкл PBS.
  Примечание: Для каждого образца готовят отрицательный контроль клеток, инкубированных с таким же количеством меченых биомолекул, но не электропорации и промывают точно так же в качестве основного образца.
2. Повторите предыдущие шаги 3 раза.
3. В случае белка интернализации, оптимизировать процедуру промывки в зависимости от свойств и поведения меченого белка. Следующие шаги пример возможных оптимизаций:
  1. Выполните первый три циклов стирки с использованием ЗФР, содержащим 100 мМ NaCl и 0,005% Тритон Х100 для удаления не усвоены белки, которые могут прилипать к наружной мембраны ^{22 клеток,} <SUP> 26.
    1. Фильтр электропорации клетки с диаметром пор фильтра 0,22 мкм, установленного внутри 1,5 мл микроцентрифужных трубки с помощью пипетки электропорации клетки в фильтр. Спин в течение 3 мин при 800 х г и 4 ° С. Откажитесь от проточных. Добавить 500 мкл новый PBS над клетками и спина их снова, как и прежде, и повторить эти шаги раз ^22.
  2. Добавить небольшое количество протеазы К (10 нг в 500 мкл PBS) в течение первого цикла стирки, чтобы позволить переваривание любой не-белком интернализации.
4. Спин вниз клеток в течение 1 минуты при 3300 х г и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 150 мкл PBS.
5. Распространение загружалась раствором клеток на агарозном площадку, удалив верхний покровное и распространение 10 мкл клеточной суспензии в капли капли. Замените неиспользованный чистый обожженную покровное (Нет 1,5 толщины, соответствующий объектива микроскопа спецификация) на Т-он верхняя часть панели и нажмите очень мягко на слайде.
6. Защитите электропорации клетки от света, сохраняя колодки в непрозрачном ящике, а визуализации различных образцов.

Сбора данных 4. Микроскоп

Примечание: Одно-клеток и одиночных молекул флуоресцентной микроскопии в живых микроорганизмов может быть выполнена на любом подходящем флуоресцентного микроскопа (по спецификации или коммерческого).

Настройки
1. Widefield или HILO освещение
  1. Образцы изображений с любым микроскопом TIRF / одиночных молекул.
    Примечание: В качестве примера, мы используем в лаборатории индивидуальные инвертированного микроскопа с TIRF настройки. Балки из 532-нм и диодного лазера в 637 нм, объединяют и коллимируется до решения вопроса на задней фокальной плоскости объектива. Флуоресценции из образца собирают через ту же цель, отделенный от света возбуждения с использованием длинный проход и режекторный фильтр, и разделен на ReD и зеленого каналов с использованием дихроичное зеркало. Эти два канала изображаются на отдельных половинах чипе электронно-умножения прибор с зарядовой связью (EM-CCD) камеры. Видео записывается с помощью кинетического режима. Белые световые изображения получены с использованием белого света лампы и конденсатор, присоединенный к микроскопа в качестве источника освещения.
  2. Для общего наблюдения одиночных молекул, установить режим подсветки микроскопа к TIRF или HILO ²³ (см Обсуждение для более подробной информации о TIRF по сравнению с изображениями Хило). Чтобы установить режим Хило на TIRF микроскоп, немного уменьшится угол падения возбуждающего света, чтобы сместить акцент немного выше, чем на поверхности покровного (изображение внутрь клетки, а не его нижней мембраны в контакте с покровным см 4.5.4 ).
  3. Для анализа клеток уровня, долго одиночных молекул отслеживания экспериментов или поэтапного анализа Фотообесцвечивания, установите режим подсветки микроскопа в режиме Widefield ensuriН.Г. непрерывное наблюдение объема всей клетки и, следовательно, всех интернализованных меченых молекул.
2. Как правило, полномочия использование возбуждения около 0,5-3 мВт (~ 50-400 Вт / см ^2).
  Примечание: нижнего лазерного полномочия полезны для достижения долгоживущий наблюдение флуоресценции и сопровождение (более 1 минуты), а более высокие мощности лазера может потребоваться для получения высшего пространственно-временной резолюции или поэтапного анализа фотообесцвечивания.
3. Используйте время экспозиции в диапазоне от 15 мс для отслеживания экспериментов 100 мс для более широкого наблюдения и интенсивности количественной оценке. Примечание: Другие частоту кадров и режима могут быть использованы, например, стробоскопический освещения, особенно для изучения быстро диффундирующих видов ^30.
4. В TIRF микроскоп, записать канал, флуоресценции на электронно-умножения CCD (EMCCD) камеры при увеличении в результате длину пикселей ~ 100 нм / пиксел. Настройка TIRF является описать более подробно в работе ^26.
Сбор данных
1. Выключить или не блокировать лазерного излучения до начала эксперимента. Включите усиление камеры EMCCD, чтобы предотвратить повреждение камеры из-за передержки.
2. Поместите сэндвич площадку агарозы вниз на столик микроскопа, с стороны клеток, покрытых обращенной вниз, с тем чтобы привести в клетку ближе к цели. Установите фокус на клетки в проходящем свете микроскопии режиме ^28. Запись изображения каждой ячейке зрения при дневном свете визуализации для того, чтобы найти ячейку контуры перед выключением белый свет.
3. Защиты образца от лаборатории окружающего света.
4. В режиме возбуждения Хило, отрегулируйте угол луча возбуждения к каждой максимальной отношения сигнал-шум при освещении только часть образца, близкого к поверхности покровного.
  1. Для достижения Хило освещение, фокусирует лазерный луч в задней фокальной плоскости 100x НС 1,4 объективной ²⁸ (выше NUMEричное отверстий, таких как 1,45 или 1,49, также пригодны). При перемещении фокусирующей линзы перпендикулярна к лучу, фокус сдвигается от объективной центре, чтобы луч выходит из объектива с углом.
  2. Отрегулируйте положение объектива для того, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум, внутриклеточный интенсивность флуоресценции от внеклеточного фонового сигнала.
5. Включите усиление камеры и начать сбор данных перед включением лазера.
6. Во время записи данных, приобретают белый свет изображение каждого поля зрения до или после записи данных флуоресценции; это помогает идентифицировать границы ячеек в флуоресценции каналов.
7. Для оценки жизнеспособности
  1. Использование низкой флуоресценции обогащенной среде в агарозном площадку, чтобы позволить клеткам расти после электропорации.
  2. Равновесие микроскоп для оптимальной температуре в течение исследуемого микроорганизма (37 ° С по отношению к E.coli, 29 ° С в течение S.cerevisiae,) С объективной системы нагревателя.
  3. Запись и белый свет и флуоресцентные изображения каждые 30 мин, убедившись, что оставаться на одной и той же поле зрения во время всей записи данных. Отставание ≈1 час обычно наблюдается до клетки начинают делиться.
8. Подсчет количества интернализованных биомолекул в клетке
  1. Установите мощность лазера к высоким значениям (2-3 МВт) и долгое время экспозиции (100 мс).
  2. Установите освещение в режим с широким полем зрения для того, чтобы осветить всю клетку.
  3. Запись видеороликов как описано в шаге 4,2 убедившись, что записи дополнительных кадров (50-100 кадров) после завершения флуоресценции фотообесцвечивания.

5. Анализ данных

Общий анализ
1. Анализ записанных изображений и видео, как в белом свете и флуоресценции возбуждений, используя программное обеспечение обработки изображений, таких как свободного программного обеспечения ImageJ.
  1. В ImageJ, открыть изображения или фильмы, записанные на микроскопа (в формате TIF) в меню File> Open> Ваше местоположение файла.
  2. Для качественно сравнить интенсивности флуоресценции на экране компьютера, убедитесь, что все флуоресцентные изображения отображаются с одинаковой яркостью и контрастностью настройки в меню Image> Adjust> Brightness / Contrast. Отрегулируйте вручную или автоматически настройки для выбранного изображения, нажмите кнопку "Установить" и выберите опцию "распространяются на все другие образы".
  3. Выберите тип информации для извлечения: Анализ> Set измерений и выбора (по крайней мере) "площадь", "Стандартное отклонение", "Мин и макс значение серого" и "Среднее значение серого".
  4. Для сравнения интенсивности флуоресценции клеток, выберите область, представляющих интерес с помощью кнопку выбора Freehand из ImageJ и извлечь интенсивности клеток в Анализ> Измерить. Полученная таблица содержит значения измерений имогут быть сохранены и / или скопированы в другие программы. Значение "Среднее" соответствует средней интенсивности на пиксель в выбранной области и может быть непосредственно сопоставлены между клетками и между клеткой и фоном.
  5. В электропорации образца клеток, клеток считается загружен, если его средняя интенсивность каждого пикселя больше, чем средней интенсивности на пиксель отрицательного контроля плюс 3 раза по сравнению с стандартным отклонением (Av _(я загрузил _{ячейку)>} Av (я _-EP) + 3 * StdDev (я _-EP)).
2. Создание Псевдоокрашенные флуоресценции наложения изображений и фильмов для того, чтобы оценить качество и загрузку образцов.
  1. В ImageJ, наложения изображений, таких как белого света изображение и изображение флуоресценции, соответствующей тому же поле зрения в Image> Colors> Merge каналов. Выберите цвет для каждого изображения (C4 (серый) для белого света, C1 (красный) для красного канала, C2 (зеленый для зеленого канала ... и т.д.)..
  2. Проверитьна накладываемого изображения, что флуоресценция находится в пределах границ ячейки (белый свет изображения), и что фон флуоресценции является низким и однородным (не яркие пятна за пределами границ клеток).
  3. Прежде чем анализировать большое количество клеток, проверьте качественно изображения, соответствующие отрицательным образца сходство с образами пустых клеток и отображать намного ниже, интенсивность, чем электропорации клеток.
3. Для жизнеспособности экспериментов, рассчитывать вручную проценты деления, непролиферирующих, но явно без изменений (идентичный) и поврежденные (мертвые) клетки из того же поля зрения растущего с течением времени (см 4.2.6).
4. Оценка жизнеспособности, по крайней мере 200 клеток на образце (электропорации, отрицательного контроля и пустых ячеек) для того, чтобы собрать достаточно статистических данных.
Анализ Клеточная
1. Подсчет количества интернализованных биомолекул в клетке ступенчатым анализа фотообесцвечивания
  1. Сегмент клетки по Selectiнг сферу интересов с помощью кнопку выбора Freehand из ImageJ и нарисуйте окружающей точно клеток (эквивалентно клеточной мембраны).
  2. Извлечение интенсивности клеток с течением времени в Image> Стеки> Участок Z-оси профиля. Полученный график представляет среднюю интенсивность каждого пикселя для области внутри границ клеток по сравнению с каждого кадра фильма в результате чего фотообесцвечивания кривой для этой конкретной соты. Он содержит первоначальный экспоненциальное падение интенсивности клеточного достигает более низкую асимптоту (фоновой флуоресценции). Измеренные значения и могут быть сохранены и / или скопировать с другим программным обеспечением нажав на кнопку "Сохранить" или "Копировать".
  3. Скопируйте и вставьте значения отбеливания в колонке таблицы (я _RAW).
  4. Рассчитайте среднее аутофлуоресценцию на пиксель, оставшегося после фотообесцвечивания (I _AUTO) путем усреднения I _{необработанные} значения, полученные за последние 50-100 кадров (ниже асимптоты).
  5. SВычесть среднее аутофлуоресценцию на пиксель, оставшегося после фотообесцвечивания для этой ячейки от начальной кривой фотообесцвечивания: Я _{отбеливания} = I _{сырья -} Я _авто.
  6. БАЗА вычитается фотообесцвечиванию timetraces (я _{отбеливания} по сравнению с рамой), показывающий меньше, чем 10 квантованных шаги, чтобы оценить средний размер шага (унитарное интенсивности флюорофор) в связи с отбеливания одного флуорофора ^26.
  7. Оцените количество интернализованных молекул на клетку путем деления первоначального базового вычитается интенсивность клеток (я _{отбеливания} при Т = 0) унитарным интенсивности флуорофора.
2. Эффективность Одноклеточный FRET
  1. Измеряется средняя клеток интенсивность каждого пикселя в обоих каналах донорных и акцепторных выбросов (при возбуждении доноров) и в клеточной границы для каждого канала, а объяснить 5.1.1.4.
  2. Измерьте среднюю интенсивность пикселя для фона в каждом чAnnel от пустой области слайда.
  3. Вычтите эту фоновую интенсивность от средней интенсивности на пиксель. Используйте эти фоновые вычитается интенсивность флуоресценции для расчета FRET для каждой ячейки путем вычисления фона вычитается интенсивность акцепторный, поделенное на общее (акцептора + донора) фон вычитается интенсивность при возбуждении доноров: Я _{акцепторные} / (я _{акцепторные} + I _донор)
Анализ одиночных молекул
1. Отслеживание одиночных молекул и анализ диффузии
  Примечание: Протокол для отслеживания диффузии флуоресцентных молекул в живых клетках и оценить их коэффициента диффузии было описано ^{26, 28.}
  1. Короче говоря, подходят образы отдельных флуорофоров в каждом кадре с помощью 2D эллиптической гауссовой. Ссылка локализованы молекулы в пути, если они появились в последовательных кадров в окне 5-7 пикселей (0.48-0.67 мкм). Используйте Memorпараметр у 1 кадра для учета переходного исчезновения флуорофора из-за мигать или пропущенных локализации.
2. В естественных условиях smFRET анализа
  1. Определить вручную локализованных молекул внутри клетки из фильмов, пройдя через кино в ImageJ и определить неподвижные (или довольно неподвижные) молекулы в ладу (акцептор) канала.
  2. Чтобы извлечь интенсивности в акцепторной и донорной канала, соответствующего неподвижного молекулы, выберите область вокруг молекулы в каждом канале с помощью "Овал" кнопкой выбора ImageJ (круг вокруг каждого отдельного флюорофора, используя радиус ~ 3 пикселей) и извлечь интенсивности молекулы в Анализ> Измерить. Полученная таблица содержит значения измерений и может быть сохранена и / или скопированы в другие программы.
  3. Рассчитать фоновые значения на канал от средней интенсивности пикселя из круга такого же размера в пустой области слайда над всеми кадрами проанализированы.
  4. Используйте фоновые вычитается флуоресценции значения в донорных и акцепторных каналов (при возбуждении донора) для флуоресценции и FRET времени следы, как и в одиночной камере FRET случай (см 5.2.1.7).
    Примечание: Автоматическое и надежный анализ и алгоритмы были описаны в ссылках ^{26-28, 31.}

Representative Results

Пробоподготовка

Различные этапы протокола представлены как схемы на рисунке 1. В качестве примера, мы представляли загрузку бактерий с двойной меткой (донорных и акцепторных красителей) фрагментов ДНК. Представитель результаты интернализации ДНК показаны на рисунке 2. Для каждого электропорации образца, данные для пустых клеток и не-электропорации клеток были также зарегистрированы (рисунок 2). "Пустые ячейки" соответствуют Электрокомпетентные клетки ни инкубировали с флуоресцентными биомолекул, ни электропорации; их интенсивность в люминесцентной канала отражает уровень автофлуоресцентной в одинаковых экспериментальных условиях (мощность лазера, разрешение времени, температуры и т.д.). "Non-электропорации клетки" (также называемый -EP, т.е. минус EP) соответствуют отрицательным контролем, в котором Электрокомпетентные клетки были инкубированы с флуоресцентным biomolecмологий, но не электропорации. Эти не электропорации клетки должны обладать уровень флуоресценции, похожий на флуоресценции из пустых клеток и существенно ниже, чем интенсивность флуоресценции, отображаемой загружен, электропорации клеток. Это подтверждает удаление любого не-интернализованных меченых биомолекул, которые могли бы осесть на наружной клеточной мембране.

Фиг.2
Рисунок 2: Представитель результаты интернализации двухцепочечной ДНК, меченных разными флуорофорами при различных концентрациях бактерий (AE) и дрожжей (F) Слева направо:. Белый свет, флуоресцентные и наложения изображений. - / + EP обозначает инкубацию с / без электропорации. Шкала бары: 3 мкм. А. Cy3B дц, 10 пмоль, Е. палочка. B. ATTO647N дц, 10 пмоль, Е. палочка. C. Alexa647 дц, 5 пмоль, кишечная палочка. D. Cy3B дц, 100 пмоль, кишечная палочка. Е. ATTO647N DSДНК, 100 пмоль, Е. палочка. F. ATTO647N дц, 30 пмоль, дрожжи. Эта цифра была изменена с ссылкой +26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Подсчет количества интернализованных биомолекул в клетке

Процедура оценки числа интернализованных меченых биомолекул в клетке с использованием фотообесцвечивания анализ представлен на рисунке 3 и Дополнительного кино 2, вместе с представительными результатами, полученными с различными концентрациями меченой ДНК. Сотовый загрузки увеличивается КПД при первоначальной суммы инкубировали меченой ДНК, что позволяет пользователю настроить количество меченых молекул на клетку с уровня "одиночных молекул" (<10, Дополнительное Кино 2В) на уровне "Ансамбль" (> 10 , Дополнительное Кино 2А). Надежный способ оценки процент загруженных клеток TО подсчитать количество электропорации клеток, отображающих интенсивность клеток выше средней интенсивности клеточного не-электропорации клеток плюс 3 раза их стандартное отклонение (т.е. Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP), где Av = средний, I = интенсивность каждого пикселя, Std. Dev. = стандартное отклонение и -EP = не электропорации), как показано на рисунке 3.

Рисунок 3:. Подсчет количества интернализованных молекул с использованием фотообесцвечивания анализ () Одноклеточный фотообесцвечиванию анализа. Примеры timetraces интенсивности флуоресценции (синие: необработанные данные, красный: подходят, вставки: WL и флуоресцентные изображения кишечной палочки, загруженной с ATTO647N меченных двухцепочечной ДНК до и после отбеливания). Top: пошаговое отбеливание событие. Средний: клетка, содержащая ± 3 молекулы, показывающие отбеливаниеи мигает. Внизу: клетка, содержащая> 10 этапов, соответствующих, по крайней мере, 10 молекул (B) Гистограмма одноступенчатых интенсивности Высота от автоматизированной ступенчатой алгоритм подбора из 57 клеток, содержащих менее 6 различимые шаги.. Одно-гауссова форме сосредоточена в 11 ± 3 а.е., что соответствует унитарного интенсивности флуорофора из 8100 фотонов в секунду. Звездочка обозначает бункер сбора всех высот ступенек выше или равно 50 а.е. (С) Гистограмма интернализированных молекул на клетку электропорации с различными количествами ATTO647N дцДНК, рассчитанных от деления начальной интенсивности флуоресценции от унитарной интенсивности флуорофора. Сверху вниз: пустые клетки (то есть, не инкубировали с флуоресцентными молекулами, а не электропорации), не электропорации (но инкубировали с флуоресцентными молекулами, названный -ep), и электропорации клетки инкубировали с 10 и 100 пмоль дцДНК (названный + EP). Пустые и не-электропорации клетки соответствуютдля флуоресценции, в то время как электропорации клетки показывают широкое распределение интернализованных молекул, с высокой долей сильно нагруженных клеток в 100 пмоль (≥ 4 молекул, см звездочка с маркировкой корзину). Эффективность интернализации (фракция клеток с Int.> В виду + 3x Std. Dev. Недопущения образца -EP) для образцов 10 и 100 пмоль была 94% и 90%, соответственно. Среднее число интернализованных молекул на клетку: 121 ± 106 молекул для 10 пмоль дцДНК, и 176 ± 187 молекул на 100 пмоль дцДНК. Настройки: 100 мс экспозиции, Widefield освещения. Шкала бары: 1 мкм. Эта цифра была изменена с ссылкой ^+26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Загрузка клеток и жизнеспособность

В дополнение к изменению количества меченых биомолекул добавляли к клеткам до электропорации,Пользователь может настроить количество интернализованных молекул, выбирая различные напряженности поля во время электропорации (рис 4, Дополнительный Фильм 1). Более высокие значения напряженности поля приводит к повышению эффективности интернализации, но приведет к незначительному снижению жизнеспособности клеток. Для белка интернализации, использование стадии фильтрации может помочь удалить не-усвоенные меченых белков (см 3.3.3.1.1). В таких случаях, фильтрация клеток гарантирует, что наблюдаемые флуоресцентные белки действительно интернализации внутри бактериальной цитоплазме; отметим, однако, что фильтрация также оказывает негативное влияние на жизнеспособность клеток (более подробно см ^22).

Рисунок 4: Влияние электропорации напряжения при погрузке клеток и жизнеспособности () Бар график, отражающий эффект силы электропорации поля по загрузке effic.iency (красные столбики) и жизнеспособность клеток (зеленые полоски). 84 ± 8% от не-электропорации клетки (0 кВ / см) разрыв после 1 ч на агарозном площадку на 37 ° C. При тех же условиях, 78 ± 3% и 49 ± 3% клеток электропорации 0,9 кВ / см и 1,8 кВ / см, соответственно разделить после 1 ч. Для повышения эффективности загрузки, 73 ± 8% клеток загружаются на 0,9 кВ / см, в то время как 92 ± 6% клеток загружаются на 1,8 кВ / см. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение, рассчитанное из трех независимых измерений; более 200 клеток анализировали дл каждого образца и каждого повтора. Габаритные эффективность возрастает нагрузка с электропорации напряжения на небольшой ущерб жизнеспособности клеток. (B) измерения флуоресценции Клеточные на протяжении нескольких поколений показывает, что общая интенсивность флуоресценции поровну между обеими дочерними клетками. Ячейка 1 и 2 относится к числу клеток в белом свете изображение (слева) и флуоресценции изображение при Т = 0. шкалебар: 1 мкм). Эта цифра была изменена с ссылкой +26.

Белок интернализация

Представитель результаты белка интернализации в рисунках 5А и B. Это особенно важно, чтобы удалить как можно больше из оставшегося свободного (непрореагировавшего) красителя из образца белка, возможно до электропорации. В примерах на фиг.5а и B, в Cy3b меченного фрагмента Кленова образца (Cy3b-KF, где KF является фрагментом Кленова в кишечной палочки ДНК-полимеразы I, 66 кДа) содержит только 1% свободного краситель; Вклад таких красителей с общей загрузкой клеток является незначительным. Сравнение электропорации образца интереса с обеих не-электропорации клеток (инкубируют с тем же количеством меченого белка), а также клетки электропорации с эквивалентным количеством свободного красителя образуют две необходимые элементы управления, чтобы гарантировать, что наблюдаемые флуоресцентные молекулыдействительно усвоили меченых белков.

Рисунок 5: Белки интернализация в живых бактерий () Представитель флуоресценции наложение поле мнениями.. Клетки электропорации при напряжении 1,4 кВ с 50 пмоль РНК-полимераза ω-субъединицы из белка маточного раствора, который содержал только 1% свободного красителя Cy3b. Номера для электропорации (не -EP) и пустые ячейки определяются, как раньше. Бесплатный краситель усвоены в той же концентрации, что и в электропорации пробе РНК-полимераза ω. Изображений в режиме широкое поле, возбуждения 532 нм в 1 мВт, 50 мс экспозиции. (B) Распределение некорректированных клеточных среднем интенсивности для образцов в (А), приведены в пропорции от общего количества клеток. Более 400 клеток на образце сегменты. Эта цифра была изменена с ссылкой ^+22. (C) Интернализация unlaBeled РНК-полимеразы Т7 (Т7 РНК-полимераза, 98 кДа) в электрокомпетентные DH5 & alpha несущий pRSET-EmGFP плазмида, кодирующая изумруд GFP (EmGFP) под контролем промотора Т7. Слева: Схема анализа. Средний: флуоресценция наложения. Справа: гистограммы на основе клеток интенсивности флуоресценции для не-электропорации образца (сверху) и клеток инкубировали и электропорации Т7 РНК-полимеразы (внизу); приблизительно 11% электропорации клетки показывают высокую интенсивность флуоресценции (часть клеток с Int.> в виду + 3x Std. Dev. недопущения образца -EP), указывающий экспрессию EmGFP. Звездочки указывают бункеров сбора всех интенсивностей выше или равно 1100 Au Масштабная линейка: 3 мкм. Эта цифра была изменена с ссылкой ^+26.

5С представляет еще одно применение белка электропорации. Здесь электропорации немеченого белка, но его интернализации вызывает наблюдаемый отклик флуоресцентный. Этот эксперимент проверяет предварительноощущение Строительные и функциональность электропорации белков в цитоплазме клетки. Без маркировки РНК-полимеразы Т7 (98 кДа) интернализации в E. Штамм DH5 & alpha;, содержащий плазмиды, кодирующей для флуоресцентного белка EmGFP под контролем промотора Т7 ^26. Как ген РНК-полимеразы Т7 отсутствует в DH5 & alpha, EmGFP выражение в наших опытах требует, чтобы функциональный РНК-полимеразы Т7, вводят в клетки с помощью электропорации (5С). После электропорации с 1 пмоль РНК-полимеразы Т7,> 11% клеток (синей полосе, 5С) выставлен флуоресценции выше, чем в отрицательном контроле (инкубируют с тем же количеством Т7 РНК-полимеразы, но не электропорации). Этот результат устанавливает, что доля молекул Т7 РНК-полимераза интернализованных путем электропорации сохраняют свою целостность в естественных условиях и может выполнять свои заданные функции в цитоплазме клеток.

В естественных условиях FRET в одной молекулеи уровни одноклеточные

Наконец, интернализация и анализ дважды меченных видов живых бактерий представлена на рисунке 6 и Дополнительного кино 3. Как флуоресцентный белок слияния не являются идеальными для IN VIVO исследований smFRET, способность поставить двойной меткой биомолекул в живых клетках с помощью электропорации является одним из больших преимуществ этого метода. 6А представляет одноклеточных FRET анализ бактерий, нагруженных различными стандартами FRET ДНК (с использованием Cy3B и Atto647N флуорофоры как донорно-акцепторной FRET пары). Клетки подвергали электропорации с 20 пмоль три коротких дважды меченных стандартов дцДНК FRET с эффективностью очевидных FRET (Е *) 0,17, 0,48, 0,86 и в пробирке (ранее определено ^26). Все ДНК проникать в клетки эффективно (6А, слева) и главный пик каждого одноклеточного E * Распределение хорошо согласуется с результатами в пробирке (рис 6AСправа). В средней и высокой FRET образцов, клеточные популяции с низкой Е *, чем ожидалось, наблюдается, по-видимому из-за комбинации акцептора отбеливания и фотофизический бездействия, переменная нагрузка сотовой ячейки (таким образом, переменная отношение сигнал-шум) и деградации ДНК ,

Рисунок 6:.. Представитель результаты одноклеточных и одной молекулы-FRET наблюдение в живых бактерий исследования ансамбля и smFRET в одиночных бактерий () Анализ клеток, нагруженных 20 пмоль каждого из трех стандартов ДНК FRET, обладающих низким (~ 0,17), промежуточный (~ 0,48), и высокой (~ 0,86) FRET (как измеряется с помощью измерения одиночных молекул в пробирке; см 26). Слева: белый свет и зеленый / красный (FRET) флуоресценции наложения изображения (Масштаб бар: 3 мкм). Примеры значений FRET из разных клеток указано другое (белый). Установка HT (сверху вниз):. нескорректированная на основе клеток FRET (E *) гистограммы для донора только (темно-зеленый), низкое (светло-зеленый), средний (желтый) и высокий (красный) FRET стандарты ДНК (B-D) В естественных условиях smFRET. Клетки нагружают 0,25 пмоль промежуточного-FRET ДНК (панель B), 0,25 пмоль высокого FRET ДНК (панель С) и 5 пмоль дважды меченных KF (Панель D). Левая колонка: зеленый / красный флуоресцентный наложение одного кадра до и после акцепторного фотообесцвечивания. Средний столбец: время следы, соответствующие молекулы в желтый круг. FRET эффективность, интенсивность излучения донора, и интенсивности акцепторного излучения отображаются в синий, зеленый и красный, соответственно. Правая колонка: FRET гистограммы донора только молекулы (зеленый) и молекул донорно-акцепторные (желтые, красные, и серые) из 20 временных следов для каждого образца. Шкала бары: 3 мкм для А, 1 мкм для B-D. Эта цифра была изменена с ссылкой ^+26.208fig6large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Для наблюдения smFRET в естественных условиях на образцах ДНК или белка, низким количествах (0,25 пмоль) в средней и высокой лада стандартов ДНК (рис 6В, С) или 5 пмоль двойной меткой флуорофорами KF (Alexa647 / Cy3B как FRET пары, Фигурное 6D) подвергали электропорации в E. палочка. Такие концентрации привело к многочисленным клеток, нагруженных несколько (N = 1-10) меченых молекул, что позволяет прямой локализации, отслеживания и FRET мониторинга для отдельных молекул. Некоторые молекулы диффундируют свободно, в то время как другие, кажется, неподвижные или медленно диффундируют (дополнительные Кино 3). Timetraces иммобилизованных дважды меченных биомолекул (рис 6, в центре) длится 1 до 30 с и показать признаки smFRET: антикоррелирующие изменения в флуоресценции донора и акцептора на акцепторной отбеливания (например, т ~ 16 сек; 6В, средний ), а затем с помощью одногоступенчатый отбеливание донор (например, т ~; 19 сек; фиг.6В). FRET распределения, полученные от таких timetraces (рис 6, справа) результат в виде среднего значения, которое находится в хорошем согласии с опубликованной в пробирке исследования ^26,31,32. Эти результаты устанавливают возможность для количественного smFRET исследований по интернализованных ДНК и белков, и предполагают, что белки сохраняют свою целостность и структуру, на электропорации и интернализации (как поддерживается T7 РНК-полимераза интернализации экспериментов).

Дополнительная Фильм 1:. Жизнеспособность клеток Слева: Белые светлые образы. Справа: флуоресцентные изображения. Анимированные GIF анимированные показывает разделение после электропорации (1,8 кВ / см) бактерий, нагруженных 10 пмоль Atto647 меченой ДНК. Общий очевидно снижение флуоресценции из-за разбавления меченой ДНК при делении клеток, а также частично в фотовыцветания, которое происходит в течение каждогоИзмерение.

Дополнительная Фильм 2: Клеточные исследования Фотообесцвечивания А.. Типичным примером сильно загруженной клетки (содержащей> 100 молекулы ДНК Atto647N меченных). Вверху слева, белый свет изображение клеток, представляющих интерес (красный прямоугольник). Вверху справа, кино загруженных клеток с их флуоресценции распад в течение нескольких минут. Нижняя, время след общей распада интенсивности флуоресценции на клетку интерес. Органические флуорофоры могут проявлять фотообесцвечиванию ЖИЗНИ 2 порядка выше, чем ФП (здесь ~ 41 сек для Atto647N). Б. типичным примером клетки, загруженной с менее чем 10 меченых молекул (3 в данном случае). Лучшие, так же, как панель A. Bottom, времени след общей интенсивности флуоресценции на клетку интерес, показывающий одну стадию отбеливания и / или мигающего, соответствующий отдельных органических флуорофоров. Средняя высота этих шагов соответствует одной молекулы унитарного интенсивности (здесь ~12 а.е.) используется для оценки начального количества интернализованных молекул на клетку. Фильмы при непрерывном возбуждении красным лазером на 300 мкВт власти и 100 мс на кадр.

Дополнительная Фильм 3: Я н VIVO одиночных молекул FRET Top:. Клеток, нагруженных 0,25 пмоль высокого лада ДНК (как показано на рисунке 6, в) непрерывно контролируется на 50 мс на кадр при nTIRF освещения с использованием 1 мВт зеленый (532 нм) лазера. Каждый кадр зеленый / красный (FRET) флуоресценции наложения каждого канала. Диффузионная и неподвижными красный (без изменений) и зеленый (одна активная метка) молекулы ДНК могут быть соблюдены. Внизу: Время следа, соответствующие молекулы в желтый круг. FRET эффективность, интенсивность излучения донора, и интенсивности акцепторного излучения отображаются в синий, зеленый и красный, соответственно. Антикоррелированы акцептор обесцвечивания (красный к-зеленые переходы) соответствует подписи FRET одиночных молекул.

Discussion

Многие параметры могут быть изменены во время клеточного электропорации и сбора данных в зависимости от биологической системы интересов и точный характер эксперимента (сотовый уровня или анализа одиночных молекул). Например, при электропорации ДНК в бактерии, от 0,25 до 5 пмоль дцДНК меченых фрагментов приводит к низкой эффективности интернализации, что позволяет обнаруживать прямую одной молекулы (т.е.., Без необходимости предварительно фотообесцвечивание). Над 5 пмоль дцДНК клетки, как правило, сильно загружен, режим лучше всего подходит для анализа одного элемента. Все меченые ДНК должна быть выше очищали на геле, чтобы удалить все следы свободного красителя (непрореагировавший флуорофор) из маточного раствора ДНК. Кроме того, потенциальные проблемы, связанные с деградацией ДНК, в частности, для smFRET экспериментов, могут быть решены с помощью ДНК с неестественной нуклеиновых кислот, или мотивами, которые защищают экзонуклеазную доступной концы, такие как шпильки петель.

Еще adjustablе параметр электропорации является напряженность поля применяется во электропорации. Низкий напряженность поля (~ 1 кВ / см) будет приводить к низкой эффективности загрузки, соответствующим одной молекулы исследований. Более высокие значения напряженности поля (до 1,8 кВ / см) позволит повысить эффективность погрузки; Однако, есть обратная корреляция между напряженности поля и жизнеспособности клеток после электропорации (см рисунок 4). Для справки, нормальный напряженность поля для бактерий и дрожжей электропорации составляет ~ 1,5 кВ / см. Постоянная времени, представляющий длину этого распада, является удобным параметром, чтобы следовать, так как постоянная времени падает, как только любой дуги явление происходит в кювете. В нормальных условиях, постоянная времени должна быть больше, чем 4 мс; Более низкие значения приведет к низкой эффективности загрузки или даже без загруженных поврежденных клеток. Большинство electroporators предложить другие степени свободы (например, «Пульс усечения" или "форму импульса»), который может быть изменен, чтобы настроиться иЗагрузка клеток и жизнеспособность. Мы применили этот метод для обеих бактерий и дрожжей, однако подобные процедуры должны также позволить интернализации меченых биомолекул в клетки млекопитающих с использованием соответствующих параметров Электропоратор поскольку их мембраны на самом деле меньше комплекс (один липидный бислой), а с электропорации уже был использован с такими клетками ^21.

При интернализации меченых белков, все свободное краситель должен быть удален из меченого белка основного раствора предварительного электропорации. Молекулы свободного красителя, из-за их меньшего размера, может быть усвоены преимущественно за интерес белков, и их трудно различить в процессе анализа данных (несмотря на их ожидаемой более быстрой диффузии). Как руководство, для образца органично меченого белка, чтобы служить для электропорации, количество оставшихся бесплатных краситель должен быть ниже 2% (обнаруженных с помощью флуоресцентного сканирования в SDS-PAGE) ^22. Этот процесс особенно важно,а некоторые молекулы могут прилипать к наружной мембраны электропорации бактерии или дрожжи. В этом отношении, отрицательный контрольный образец должен отображать интенсивность флуоресценции на клетку значительно ниже, чем электропорации клеток, в идеале, как низкий, как уровень автофлуоресцентной пустых ячеек (клеток, которые не были инкубировали с любыми флуоресцентно меченных биомолекул, ни электропорации, рисунок 2).

Как и в двухцепочечной ДНК, эффективность интернализации меченых белков связана с количеством биомолекул к клеткам добавляли предшествующих электропорации. Тем не менее, другие параметры, такие как размер и заряд, играют важную роль в интернализации. Маленькие белки обладают высокой эффективностью интернализации, в то время как более крупные белки (до 98 кДа) может быть успешно усвоены, но с меньшей эффективностью (рис 5) ^26. Isolelectric точки белка, потенциальные взаимодействия с клеточной мембраной и другие физико-химические параметры такженагрузочной ячейкой влияние во время электропорации. В результате, пользователи должны оптимизировать эксперименты по своей собственной системе, зная, что высокая начальная концентрация меченого белка (> 50 мкм) даст наилучший шанс для успешной загрузки. Электропорация также предлагает новый инструмент для возмущения и анализировать клеточную функцию путем введения белков и других биомолекул в клетки (либо помеченных или немаркированные). Т7 РНК-полимеразы эксперименты (фиг 5с), присутствующие такой пример эксперимента, где можно ввести биомолекулы, которые могут изменить экспрессию гена в естественных условиях с использованием электропорации.

При выполнении одиночных молекул эксперименты флуоресценции, освещение МДП, как правило, отдается предпочтение по сравнению другими видами освещения, как это предлагает лучшее соотношение сигнал-шум, возбуждая только флуорофорами в тонкой части над поверхностью покровного (~ 100 нм). Однако изображений помечены биомолекулы рассеивающие внутри живых микроорганизмов может повторнодесть глубже освещение (до 0,8 мкм для кишечной палочки). Глубже освещение достигается в режиме Хило, сохраняя при этом высокое соотношение сигнал-шум. С другой стороны, широкое поле изображения является особенно важным для ступенчатого анализа фотообесцвечивания, когда пользователь оценки количества интернализированных молекул фотообесцвечивание весь загруженный клетки с высокой мощности лазера и деления начальной интенсивности флуоресценции клеток унитарным света, излучаемого одной молекулы (одного шага фотообесцвечивания, рис 3). Изображения Widefield также необходим для отслеживания долгосрочных молекулы для того, чтобы локализовать рассеивающие молекулы, представляющие интерес, даже если их траектории охватывают весь объем клеток.

В этом протоколе, мы представляем, как электропорация, стандартная техника для биологов и биохимиков для доставки нуклеиновых кислот в клетках, представляет собой простой способ для доставки флуоресцентных биомолекулы в различных типах клеток. Thявляется новым, техника высокой пропускной предлагает уникальный инструмент для наблюдения меченые молекулы в их родной среде. Кроме того биомолекул, меченных флуорофоры, охватывающих широкий диапазон длин волн, электропорации может доставить молекулы, модифицированные многих химических групп, таких как неестественных нуклеотидов и аминокислот, металлических энтеросорбенты, сшивающих агентов, и доступа к файлам групп. Если биологическая система представляет интерес не является необходимым для развития клеток, ген, кодирующий целевой белок, также могут быть удалены (или разобранном), гарантируя, что белки, наблюдаемые после интернализации представляют все (или большинство) из внутриклеточного пула белка , В сущности, электропорации может "пересадка" гибкость биоконъюгатов в пробирке в живых клетках и, следовательно, на пользу усилия в области синтетической биологии, системной биологии и обнаружения одиночных молекул VIVO.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells	Invitrogen	11319-019	or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.
EZ Rich Defined Madia	Teknova	M2105	low fluorescence rich media
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100	or any classical electroporator for microorganism transformation
Certified Molecular Biology agarose	Biorad	161-3100	low fluorescence agarose for agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h
Single-molecule fluorescence microscope	Home-built		described in REFs
Localization software	Custom-written, available online		MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.
Tracking software	Available online		MATLAB implementation by Blair and Dufresne.