Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interna och Observation av fluorescerande Biomolekyler i levande mikroorganismer via elektroporation

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/52208
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford, 2Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Center

Introduction

De flesta fluorescens studier inuti levande celler är beroende av proteinfusioner med fluorescerande proteiner (fps), såsom GFP 1. Dessa fluorescerande taggar tillåter studier av antal kopior, spridningsbild eller lokalisering av proteiner involverade i processer såsom genuttryck eller membrantransport 2-7. Ramprogrammen erbjuder hög märkning specificitet, enkel implementering, och finns i en stor inventering av varianter med olika fotofysikaliska och kemiska egenskaper en. Emellertid organiska fluoroforer förblir det främsta valet för in vitro-försök på grund av deras större fotostabilitet (upp till 100-faldigt mer stabil än FPS) 8,9, liten storlek (upp till 100-faldigt mindre volym än FPS) och enkel intramolekylär märkning (huvudsakligen genom användningen av cysteinrester). Alla dessa faktorer är särskilt viktiga för enda molekyl fluorescens och FRET studerar 10.

Flera internametoder Combining fördelarna med ekologisk märkning och in vivo upptäckt har införts under det senaste decenniet; Men sådana metoder antingen använda relativt stora polypeptider taggar (t.ex. TMP, Halo, eller 20 kDa SNAP taggar) 11-14, kräver användning av onaturliga aminosyror 15, eller är begränsade till stora, singel-membran eukaryota celler (t.ex.. , skrapa lastning, spruta lastning, mikroinjektion) 16-19.

Detta protokoll beskriver en roman, enkel och hög genomströmning metod som kopplar fördelarna med ekologiska fluoroforer med in vivo observation interna. Att utveckla denna teknik, vi anpassat elektroporering förfarande som vanligen används för att transformera celler med plasmid DNA 20,21 för att ladda mikroorganismer, såsom E. coli eller S. cerevisiae med ekologiskt märkta biomolekyler. Protokollet består av fyra enkla steg: inkubation av celler med märkta biomolekyler,elektroporering, cellåtervinning, och cell tvättning för att avlägsna icke-interna biomolekyler. Här presenterar vi denna elektroporation protokoll, liksom cell imaging och dataanalysprocesser för att studera cellbaserad och enda molekyl fluorescens och FRET signaler.

Elektroporation bygger på avlossa en högspännings elektriskt fält över en låg jonstyrka cellsuspension att bilda transienta membran porer genom vilka biomolekyler kan komma in celler (Figur 1) 20,21. Precis som med transformation av bakterier eller jäst med plasmid DNA, celler måste vara beredd före elektroporering att säkerställa deras electrocompetency. Detta förfarande, som består av flera tvättningssteg med vatten, ökar membranpermeabiliteten och sänker jonstyrkan av cell lösning för att undvika Ijusbågsbildning i elektroporationskyvett. I detta protokoll kan celler framställas som beskrivs nedan (Se PROTOKOLL: 1,1) eller köpas från kommersiella leverantörs.

Figur 1
Figur 1: Schematisk bild av internaprotokollet Från vänster till höger:. Lägga till några mikroliter märkta biomolekyler till portion av elektroceller (dubbelt märkt DNA-fragment och bakterier i detta exempel); inkubera 1-10 min på is och överför till en pre-kyld elektroporeringskyvett; electroporate och sedan lägga 0,5-1 ml rikt medium till cellerna direkt efter; inkubera vid 37 ° C (eller den temperatur som krävs av organismen, t.ex., 29 ° C för jäst) för att låta cellerna återhämta sig; utföra fem tvättsteg för att avlägsna eventuella överskott icke-interna märkta molekyler; suspendera den slutliga pelleten i 100-200 pl PBS-buffert och pipett 10 ìl på en agaros pad; täcka kudden med en rengjord täck och bild på ett fluorescensmikroskop (i brett fält läge eller HILO-läge).

(Figur 1). Överskottet av icke-internaliserade märkta biomolekyler avlägsnas först genom tvättning i en buffert innehållande en relativt hög koncentration av salt och en del detergent (Se PROTOKOLL: 3,3). Närvaron av salt stör ospecifika elektrostatiska interaktioner bildade av icke-interna märkta biomolekyler som annars kan fastna på yttermembranet. Likaså närvaro av detergent i tvättbufferten stör ospecifika hydrofoba interaktioner.

Medan DNA interna är enkel (Figur 2), försiktighetsåtgärder måste vidtas vid interna märkta proteiner med hjälp elektroporering. Först kanske beståndet urval av ekologiskt märkta proteinet fortfarande innehålla en liten andel av fritt färgämne. Fria färgmolekyler är mycket mindre än proteiner och kan därför intern företrädesvis. För att säkerställa att de allra flesta av de observerade interna fluorescerande molekyler motsvarar proteinet av intresse, bör den initiala proteinprovet innehåller mindre än ~ 2% fri färgämne (Figur 5) 22. Överskottet av icke-internaliserade märkta proteinerna kan även fastna på det yttre cellmembranet efter elektroporering; detta fenomen är protein specifikt och måste kontrolleras för varje nytt protein. Vi föreslår flera alternativ som tillåter avlägsnandet av icke-interna proteiner från den laddade cellprov (Se PROTOKOLL: 3.3.3).

Slutligen celler återsuspenderas i en liten volym av fosfatbuffert och pipetterades på en agaros pad, möjliggör deras avbildning på ett fluorescensmikroskop. Immobilisering på agaros kuddar är en enkee och effektivt sätt att avbilda celler på ett täck utan att skada deras integritet. Dynan bör innehålla en låg fluorescens odlingsmedium.

Cell imaging kan utföras antingen i Vidvinkel, total inre reflektion fluorescens (TIRF) eller använda HILO (Mycket benäget och Laminerade Optisk Sheet) mikroskopi. I HILO konfigurationen, tränger laserstrålen djupare i provet än i TIRF, ännu inte belysa hela provet som för widefield, som tillåter en större signal-till-brusförhållandet 23. Beroende på lasereffekten och tidsupplösning som används, kan interna biomolekyler räknas (med hjälp av stegvis-fotoblekning analys, figur 3), lokaliserad eller spåras 24-28. Internalisering av dubbelt märkta konstruktioner med en FRET-par av fluoroforer medger kvantifiering av FRET både encelliga eller enda molekyl nivåer (Figur 6).

Olika parametrar kan varierasberoende på den önskade utgången och det biologiska systemet studeras. Först, kan mängden internaliserad material per cell avstämmas genom att ändra koncentrationen av märkta biomolekyler sattes till cellerna före elektroporering (Figur 2). Elektroporation fältstyrkan kommer också att påverka både laddningseffektivitet och cellviabilitet; som väntat, medan lasteffektivitets ökar med ökande fältstyrka, livskraft elektroporerade celler minskar (Figur 4A). Båda parametrar kan kvantifieras genom registrering andelen belastade och delande celler efter elektroporering. Denna livskraft analys i kombination med fluorescens avbildning bekräftas även den observation av interna biomolekyler i levande celler och tillåta ständig kontroll över flera generationer (Figur 4B).

Sammanfattningsvis ger detta protokoll internalisering av fluorescerande DNA och proteinmolekyler iE. coli eller S. cerevisiae 26. Individuella molekyler märkta med organiska fluoroforer kan spåras med hög Spatiotemporal upplösning för tidsskalor en storleksordning längre än FPS. Slutligen är denna metod är förenlig med widefield, TIRF och konfokal upptäckt, liksom pulsade exciteringssystem, såsom ALEX (alternerande laserexcitation 28,29).

Protocol

1. Cell-beredning

  1. Beredning av lab-made elektro bakterier
    1. Förbered en 5-10 ml natten förodling från en enda koloni av E. coli-stam av intresse i en låg fluorescens medium såsom M9 eller EZ Rich Defined Medium.
    2. På morgonen, ympa en ny 400 ml kultur med övernattning förkulturen så att OD 600 nm börjar vid 0,02. Lägg till 400 ml med låg fluorescens medel 2,5 ml av 1 M MgSO 4 och 2,5 ml 1 M MgCl2.
    3. Odla vid 37 ° C och 250 rpm tills OD 600 nm når 0,4-0,6.
    4. Stoppa tillväxten genom kylning av kulturen i ett is-vattenbad under 10-15 min.
      OBS: Från och med nu, genomföra alla steg vid 4 ° C (på is).
    5. Centrifugera kultur 15 min vid 1000 x g. Kasta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 250 ml kyld och sterilt destillerat H2O
    6. Upprepa centrifugering och resuspension steg tWice, minskar volymen vatten till 100 ml och därefter 50 ml.
    7. Centrifugera kultur 10 min vid 1000 x g. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 25 ml kyld och sterilt destillerat H2O + 10% glycerol.
    8. Upprepa centrifuger och resuspension steg tre gånger, vilket minskar volymen av 10% glycerollösning till 10 ml, 5 ml, och slutligen till 500 | il.
    9. Alikvotera cellerna i alikvoter av 20 pl vardera, flash-frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.
  2. Kommersiella elektrokompetenta bakterieceller
    1. Späd en kommersiell cell alikvot 1: 1 med sterilt kylt destillerat vatten. Gör 20 l alikvoter och förvara vid -80 ° C.
  3. Förberedelse elektrokompetent jäst
    Obs: elektro S. cerevisiae celler bereds före varje elektroporation experiment och kan inte lagras vid -80 ° C som för E. coli.
    1. För att starta, ympa 50 ml YPD medium med en enda koloni av önskad stam av intresse.
    2. Inkubera vid 30 ° C och 250 rpm tills OD 600 nm når 0,6 till 0,8.
    3. Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
    4. Återsuspendera pelleten i 25 ml kyld och sterilt destillerat H2O
    5. Upprepa tvättsteg återsuspendering två gånger i 25 ml vatten och återsuspendering två gånger i 2 ml av en kyld lösning av sorbitol vid en M.
    6. Resuspendera cellerna i 250 | il 1 M sorbitol och dela cellerna i 50 | il alikvoter.

2. Agaros pad beredning

  1. För att ta bort bakgrunds fluorescerande partiklar, bränna en täck i en ugn vid 500 ° C i 1 timme. "Clean brände" täck kan lagras i veckor i rumstemperatur täckt av aluminiumfolie.
    Anm: Andra vanliga reningsmetoder, såsom plasma rengöring eller Piranha lösning kan användas så länge som bakgrundenfluorescens av de rengjorda diabilder förblir kvasi-null.
  2. Förbered en låg fluorescens agaroslösningen genom smältning i en mikrovågsugn en 2% -ig - destillerat lösning vatten (70 ° C). Omedelbart till 500 ul av den klara 2% agaroslösning till 500 | il 2X låg fluorescens odlingsmedium och blanda försiktigt.
  3. Innan det kyls ner och hårdnar, omgående pipett här agaros - medel lösning på ett mikroskop täck (nr 1,5 tjocklek) för att bilda en kudde av ungefär 2 cm diameter och en några millimeter höjd. Undvik bubblor och pop dem med en pipettspetsar om det behövs.
  4. Platta kudden med en andra "bränd" täck (nr 1,5 tjocklek, se figur 1).
    Obs: Denna övre täck hjälper bildar en platt homogen pad och skyddar mot damm och torkning medan celler förbereds. Minimal medium såsom M9 eller rikt medium såsom EZ Rich definierat medium har testats för deras låga fluorescens.

3. Electroporatjon

  1. Inkubation
    1. Lägg till upp till 5 ^ märkta molekyler som lagras i saltbuffert (<50 mM salt) till en enda portion av kompetenta celler (20 il bakterier eller 50 l jäst) och inkubera 10 minuter på is.
      Obs: Koncentrationen av fluorescensmärkta molekyler i stamlösningarna och således mängden märkta molekyler till cell före elektroporering är direkt korrelerad med laddningseffektivitet (fig 3, och diskussion). Eftersom vissa proteiner är mindre kompatibla med låg salthalt skick, kanske saltkoncentrationen i buffertminnet ökas men volymen av märkta molekyler läggs till cellerna före elektroporering måste sedan minskas.
    2. Överför blandningen av celler och märkta biomolekyler till en pre-kyld elektroporeringskyvett (0,1 och 0,2 cm avstånd för bakterier och jäst, respektive). Knacka försiktigt kyvetten på bänken för att avlägsna eventuella bubblor från lösningen.
    3. Placera cuvette i elektroporator och tillämpa en högspännings elektrisk puls till lösningen (0,9-1,8 kV / cm, se diskussion för mer information om att välja spänning). En sådan puls bildar transienta porer i cellmembranen möjliggör märkta biomolekyler att diffundera in i cellerna.
    4. Kontrollera att tidskonstanten som visas på elektroporator är mellan 4-6 ms. Lägre tidskonstanter är ofta på grund av alltför hög saltkoncentration och / eller närvaro av bubblor i kyvetten, och kommer att leda till mycket låg eller ingen belastning av cellerna.
  2. Återhämtning
    1. Omedelbart efter elektroporering, tillsätt 500 | il av rikt medium såsom SOC, EZ Rich Defined Medium, YPD eller någon rikt medium till cellerna.
    2. Inkubera provet vid 37 ° C för bakterier och 29 ° C för jäst under 2 till 10 min. För viabilitet mätningar, där användaren vill att utvärdera andelen celler som växer och delar sig efter elektroporering, använda en längre återhämtningstid (upp till en timme) som we iaktta sådana fördröjningstider före den första celldelningen.
  3. Tvättsteg
    1. Tvätta cellerna för att avlägsna eventuella icke-interna biomolekyler genom att spinna ned cellerna för 1 min vid 3300 xg och 4 ° C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 | il PBS.
      Obs: För varje prov, förbereda en negativ kontroll av celler inkuberade med samma mängd märkta biomolekyler men inte elektroporerade och tvättade exakt samma sätt som huvudprovet.
    2. Upprepa föregående steg 3 gånger.
    3. I fallet med proteininterna, optimera tvättförfarandet beroende på egenskaperna och beteendet hos det märkta proteinet av intresse. Följande steg är exempel på möjliga optimeringar:
      1. Utför de första tre tvättcykler med användning av PBS innehållande 100 mM NaCl och 0,005% Triton X 100 för att avlägsna icke-interna proteiner som kanske skulle klibba till det yttre cellmembranet 22, <sup> 26.
        1. Filtrera de elektroporerade cellerna med en filter pordiameter 0,22 ^ m på insidan av ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att pipettera de elektroporerade cellerna i filtret. Spinn ner under 3 min vid 800 xg och 4 ° C. Kassera genomströmning. Lägg 500 l nya PBS över cellerna och snurra dem igen som förut och upprepa dessa steg när 22.
      2. Lägg en liten mängd proteas K (10 ng i 500 l PBS) under den första tvättcykeln för att möjliggöra nedbrytning av icke-interna protein.
    4. Centrifugera ner cellerna under 1 minut vid 3300 xg och 4 ° C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 150 | il PBS.
    5. Sprid den laddade cellen lösningen på agarosen pad genom att ta bort den övre täck och sprider 10 pl av cellsuspensionen droppen av droppen. Ersätt en oanvänd rena brända täck (nr 1,5 tjocklek, matchar mikroskop målet specifikation) på tHan ovanpå dynan och tryck mycket försiktigt på bilden.
    6. Skydda elektroporerade cellerna från ljus genom att lagra dynorna i en ogenomskinlig låda medan avbildning olika prover.

4. Mikroskop datainsamling

Obs: Single-cell och enda molekyl fluorescensmikroskopi i levande mikroorganismer kan utföras på något lämpligt fluorescensmikroskop (specialbyggd eller kommersiell).

  1. Inställningar
    1. Widefield eller HILO belysning
      1. Bild prov med varje TIRF / enda molekyl mikroskop.
        Obs: Som ett exempel, använder vi i laboratoriet en anpassad inverterat mikroskop med en TIRF set-up. Balkar från en 532-nm och en 637-nm diodlaser kombineras och kollimeras innan fokus på baksidan fokalplan målet. Fluorescens från provet samlas in genom samma mål, skild från excitationsljus med hjälp av en lång passning och ett notchfilter, och delas upp i red och gröna kanaler med en dikroisk spegel. De två kanalerna är avbildade på separata halvorna av chipet för en elektron multiplicera charge-coupled device (EM-CCD) kamera. Videoklipp spelas in med den kinetiska läget. Vita ljusbilder erhålls med hjälp av en vitt ljus lampa och en kondensor fäst vid mikroskopet som en belysningskälla.
      2. För allmän enda molekyl observation, tända och släcka belysningen av mikroskop för att TIRF eller HILO 23 (se diskussion för mer information om TIRF kontra HILO imaging). För att ställa in en HILO-läge på en TIRF mikroskop, minska något infallsvinkeln av excitation ljus för att flytta fokus en aning högre än täckytan (bild cellens inre snarare än dess undre membran i kontakt med täck, se 4.5.4 ).
      3. För cellnivå analys, spårning långa enda molekyl experiment eller stegvis fotoblekning analys, tända och släcka belysningen av mikroskop för att en widefield läge ensuring av kontinuerlig observation av hela cellvolymen och därmed av alla internalis märkta molekyler.
    2. Vanligtvis används excitation befogenheter runt 0,5-3 mW (~ 50-400 W / cm 2).
      Obs: Lägre lasereffekter är användbara för att uppnå långlivade fluorescens observation och spårning (över 1 minut) medan högre lasereffekter kan krävas för högre spatiotemporal upplösning eller stegvis fotoblekning analys.
    3. Använd exponeringstider som sträcker sig från 15 ms för att spåra försök till 100 ms för mer allmän iakttagelse och intensitet kvantifiering. Obs: Andra frame rates och lägen kan användas som stroboskopisk belysning, särskilt för att studera snabba diffunderande arter 30.
    4. I TIRF mikroskop, registrera fluorescens kanal på en elektron-multiplicera CCD (EMCCD) kamera vid en förstoring som resulterar i en pixel längd ~ 100 nm / pixel. Den TIRF setup är att beskriva mer i detalj i referens 26.
  2. Dataregistrering
    1. Stäng av eller blockera laserbelysning fram till starten av experimentet. Växla EMCCD kameran vinsten av för att förhindra skador på kameran pga överexponering.
    2. Placera agarosen pad smörgås upp och ner på mikroskop scenen, med cell täckta sidan vänd nedåt, för att bringa cellen nära målet. Ställ fokus på cellerna i överförd ljusmikroskop läget 28. Spela in en bild av varje cell uppfattning under vitt ljus avbildning för att lokalisera cellen konturer innan du stänger av vitt ljus.
    3. Skydda provet från labbet omgivande ljus.
    4. Hilo excitation läge, justera vinkeln excitationsstrålen till varje maximal signal-brus-förhållande genom att belysa endast den del av provet nära täckytan.
      1. För att uppnå HILO belysning, fokusera laserstrålen i det bakre fokalplanet av en 100x NA 1,4 objektiv 28 (högre Numerical öppningar såsom 1,45 eller 1,49 är också lämpliga). Genom att skifta fokuseringslinsen vinkelrät mot balken, flyttar fokus förutom målet centrum så att strålen lämnar målet med en vinkel.
      2. Justera linsens position för att maximera signal-till-brus-förhållande, intracellulär fluorescensintensitet kontra extracellulärt bakgrundssignal.
    5. Slå på kameran vinsten och börja datainsamling innan du slår på lasern.
    6. Under inspelning uppgifter, förvärva ett vitt ljus bild av varje FOV före eller efter inspelningen fluorescensdata; Detta hjälper till att identifiera cellgränser i fluorescenskanalerna.
    7. För bärkraft uppskattning
      1. Använd en låg fluorescens rikt medium i agarosen pad att låta cellerna att växa efter elektroporering.
      2. Jämvikta mikroskop för att den optimala temperaturen för den studerade mikroorganismen (37 ° C för E. coli, 29 ° C för S. cerevisiae) Med en objektiv värmesystem.
      3. Record både vitt ljus och fluorescens bilder var 30 min, och se till att stanna kvar på exakt samma synfält under hela datainspelning. En fördröjning av ≈1 timme typiskt observeras innan cellerna börjar dela sig.
    8. Räkna antalet interna biomolekyler per cell
      1. Ställ lasereffekt till höga värden (2-3 MW) och lång exponeringstid (100 ms).
      2. Ställ in belysnings att widefield läge för att belysa hela cellen.
      3. Spela in filmer som beskrivs i steg 4.2 och se till att spela in ytterligare ramar (50-100 bildrutor) efter slutförandet av fluorescens fotoblekning.

5. Dataanalys

  1. Allmän analys
    1. Analysera de inspelade bilder och filmer, både i vitt ljus och fluorescensexcite, med hjälp av ett bildbehandlingsprogram, såsom den fria programvaran ImageJ.
      1. I ImageJ, öppna bilder eller filmer som spelats in på mikroskopet (TIF-format) i Arkiv> Öppna> Din fil plats.
      2. För att kvalitativt jämföra fluorescensintensiteter på en datorskärm, se till att alla fluorescens bilder visas med samma ljusstyrka och kontrast i Bild> Justera> Ljusstyrka / Kontrast. Justera manuellt eller automatiskt inställningarna för en vald bild, tryck på "Set" -knappen och välj "Propagera för alla andra bilder" alternativet.
      3. Ange typ av information för att extrahera: Analysera> Set Mätningar och väljer (minst) "Area", "Standardavvikelse", "Min & Max gråvärdet" och "Mean gråvärdet".
      4. Att jämföra cell fluorescensintensiteter, välja området s intresse använder valknappen Freehand av ImageJ och extrahera cellnivåer i Analyze> Mät. Det resulte tabell innehåller mätvärdena ochkan sparas och / eller kopieras till andra program. Värdet "Mean" motsvarar den genomsnittliga intensiteten per pixel i det markerade området och kan direkt jämföras mellan celler eller mellan en cell och bakgrunden.
      5. I en electroporated cellprov, är en cell fund laddad om dess medelintensitet per pixel är större än den genomsnittliga intensiteten per pixel av den negativa kontrollen plus tre gånger dess standardavvikelse (Av (jag laddade cellen)> AV (I -EP) + 3 * stdDev (I -EP)).
    2. Bygga falskt färgade fluorescens overlay bilder och filmer för att utvärdera kvaliteten och lastning av proverna.
      1. I ImageJ, overlay bilder som det vita ljuset bilden och fluorescensbild som motsvarar samma FOV i Bild> Färger> Merge kanaler. Välj en färg för varje bild (C4 (grå) för vitt ljus, C1 (röd) för röda kanalen, C2 (grönt för gröna kanalen ... osv.).
      2. Checkpå överlagringsbild att fluorescensen är belägen inom cellgränserna (vitt ljus bild) och att bakgrundsfluorescens är låg och homogen (inga ljuspunkter utanför cellgränserna).
      3. Innan analysera ett stort antal celler, kolla kvalitativt bilderna motsvarar det negativa provet liknar de tomma cellbilder och visa mycket lägre intensiteter än de elektroporerade cellerna.
    3. För lönsamhetsexperiment, räkna manuellt procentsatserna för uppdelning, icke-delande men synbart intakt (identiska) och skadade (döda) celler från samma synfält växer över tid (se 4.2.6).
    4. Utvärdera livskraft minst 200 celler per prov (elektro, negativ kontroll och tomma celler) för att samla tillräckligt med statistik.
  2. Cellbaserad analys
    1. Räkna antalet interna biomolekyler per cell genom stegvis fotoblekning analys
      1. Segment celler genom selecting området av intresse med hjälp av valknappen Freehand av ImageJ och rita en form som omger just cellen (motsvarande cellmembranet).
      2. Utdrag cellintensitet över tid i Bild> Staplar> Plot Z-axeln Profil. Den resulterande grafen representerar den genomsnittliga intensiteten per pixel för området i cellen gränsen kontra varje film bildruta som resulterar i en fotoblekning kurva för den specifika cellen. Den innehåller en inledande exponentiell minskning av cell intensiteten når en lägre asymptot (bakgrundsfluorescens). Mätvärdena och kan sparas och / eller kopieras till andra program genom att klicka på "Spara" eller "Kopiera".
      3. Kopiera och klistra in den blekvärdena i ett kalkylblad kolumn (jag rå).
      4. Beräkna den genomsnittliga autofluorescens per pixel kvar efter fotoblekning (I auto) som genomsnittet I- rå värden som erhållits för de senaste 50-100 ramar (lägre Asymptote).
      5. Subtract genomsnitts autofluorescens per pixel kvar efter fotoblekning för den cellen från den ursprungliga fotoblekning kurvan: Jag blekning = jag raw - I auto.
      6. Använd baslinjen korrigerad fotoblekning timetraces (jag blekning kontra ram) visar mindre än 10 kvantiserade steg för att utvärdera den genomsnittliga steglängd (enhetlig fluoroforen intensitet) på grund av blekning av en enda fluoroforen 26.
      7. Utvärdera antalet interna molekyler per cell genom att dividera det initiala utgångskorrigerad cellintensiteten (I blekning vid t = 0) med det enhets fluoroforen intensitet.
    2. Encelliga FRET effektivitet
      1. Mät genomsnittliga celler intensiteten per pixel i både utsläpps givare och mottagare kanaler (efter donator excitation) och inom cellgränsen för varje kanal som förklara i 5.1.1.4.
      2. Mät den genomsnittliga pixelintensiteten för bakgrunden i varje lmannel från ett tomt område på bilden.
      3. Subtrahera denna bakgrund intensitet från den genomsnittliga intensiteten per pixel. Använd dessa bakgrundskorrigerad fluorescensintensiteter att beräkna FRET för varje cell genom att beräkna bakgrundskorrigerad acceptor intensitet dividerat med totalt (acceptor + donator) bakgrundskorrigerad intensitet vid givar excitation: Jag acceptor / (jag Acceptor + I donator)
  3. Single-molekyl analys
    1. Single-molekylen spårning och diffusion analys
      Obs: Protokollet för spårning diffuse fluorescerande molekyler i levande celler och för att utvärdera deras uppenbara diffusionskoefficienten har beskrivits 26, 28.
      1. Kortfattat, passa bilder av enskilda fluoroforer i varje bildruta med en 2D elliptisk Gauss. Länk lokaliserad molekyler till ett spår om de dök upp i konsekutiva ramar inom ett fönster på 5-7 pixlar (0,48-0,67 um). Använd en Memory parameter av 1 ram att redovisa den transienta försvinnande av en fluorofor pga blinka eller missade lokalisering.
    2. In vivo smFRET analys
      1. Identifiera manuellt lokaliserade molekyler inuti celler från filmer genom att gå igenom en film i ImageJ och identifiera orörliga (eller ganska orörliga) molekyler i FRET (acceptor) kanal.
      2. För att extrahera intensitet i acceptor och givare kanal motsvarar en orörlig molekyl, markerar området kring molekylen i varje kanal med "Oval" val knapp ImageJ (cirkel runt varje enskild fluorofor, med hjälp av en ~ 3-pixel radie) och extrahera molekyl nivåer i Analyze> Mät. Det resulte tabell innehåller mätvärdena och kan sparas och / eller kopieras till andra program.
      3. Beräkna bakgrundsvärden per kanal från den genomsnittliga pixelintensiteten från en cirkel av samma storlek i ett tomt område på bilden över alla ramar analyserade.
      4. Använd bakgrundskorrigerad fluorescensvärden i givaren och mottagaren kanaler (vid givar excitation) för fluorescens och FRET tids spår, som i den encelliga FRET fallet (se 5.2.1.7).
        Obs: Automatiserad och robust analys och algoritmer har beskrivits i referenser 26-28, 31.

Representative Results

Provberedning

De olika stegen i protokollet presenteras som scheman i figur 1. Som ett exempel, vi representerade lastningen av bakterier med dubbelmärkt (donator och acceptor färgämnen) DNA-fragment. Representativa resultat DNA interna visas i figur 2. För varje elektroporeras prov, var data för tomma celler och icke-elektroporerade celler också in (Figur 2). "Tomma celler" motsvarar elektrokompetenta celler varken inkuberade med fluorescerande biomolekyler eller elektro; deras intensitet i den fluorescerande kanalen speglar autofluorescens nivån under identiska experimentella betingelser (lasereffekt, tidsupplösning, temperatur, etc.). "Non-electroporated celler" (även kallad -EP, dvs minus EP) motsvara en negativ kontroll, i vilken elektrokompetenta celler har inkuberats med fluorescerande Biomolecduler men inte electroporated. Dessa icke-elektro celler bör uppvisa en fluorescensnivå liknar autofluorescens av de tomma cellerna och betydligt lägre än fluorescensintensiteten visas av laddade, elektroporerade celler. Detta bekräftar att avlägsna alla icke-interna märkta biomolekyler som kunde ha anslutit sig till det yttre cellmembranet.

Figur 2
Figur 2: Representativa resultat för internalisering av dsDNA märkt med olika fluoroforer vid olika koncentrationer i bakterier (AE) och jäst (F) Från vänster till höger:. Vitt ljus, fluorescens och overlay bilder. - / + EP betecknar inkubation utan / med elektroporering. Skalstrecken: 3 um. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, jäst. Denna siffra har modifierats referens 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Räkna antalet interna biomolekyler per cell

Proceduren för att uppskatta antalet intern märkta biomolekyler per cell använder fotoblekning analys presenteras i figur 3 och Kompletterande Movie 2, tillsammans med representativa resultat som erhållits med olika koncentrationer av märkt DNA. Cell lastning effektivitet ökar med den ursprungliga mängden inkuberas märkt DNA, så att användaren kan ställa in antalet märkta molekyler per cell från en "enda molekyl" nivå (<10, Kompletterande Movie 2B) till en "ensemble" nivå (> 10 Kompletterande Movie 2A). En robust sätt att uppskatta andelen laddade celler är to räkna antalet elektroporerade celler som uppvisar en cellintensitet över det genomsnittliga cellintensiteten av icke-electroporated celler plus tre gånger deras standardavvikelse (dvs., Av (I-EP) + 3 * stdDev (I-EP) där Av = medelvärde, I = intensitet per pixel, Std. Dev. = standardavvikelse och -EP = icke-elektro) som visas i Figur 3.

Figur 3
Figur 3:. Räkna antalet interna molekyler använder fotoblekning analys (A) Single-cell fotoblekning analys. Exempel på fluorescensintensitet timetraces (blå: rådata; red: fit; sätter in: WL och fluorescens bilder av E. coli laddad med ATTO647N-märkta dsDNA före och efter blekning). Top: enkelstegsblek händelse. Mitten: cell innehållande ± 3 molekyler visar blekningoch blinkar. Botten: cell som innehåller> 10 steg motsvarande minst 10 molekyler (B) Histogram av sk enkelstegs höjd intensiteter från en automatiserad steg passande algoritm från 57 celler som innehåller mindre än 6 urskiljbara steg.. Single-gaussisk passform är centrerad vid 11 ± 3 au, som motsvarar en enhetlig fluorofor intensitet av 8100 fotoner per sekund. Asterisken markerar bin samla alla steghöjder över eller lika 50 au (C) Histogram av internaliserade molekyler per cell elektroporerade med olika mängder av ATTO647N dsDNA, beräknade efter dividera initiala fluorescensintensitet med det enhets fluoroforen intensitet. Uppifrån och ned: tomma celler (dvs inte inkuberats med fluorescerande molekyler och inte elektroporerade), icke-elektro (men inkuberas med fluorescerande molekyler, som heter -EP), och elektroporerade celler odlades med 10 och 100 pmol dsDNA (uppkallad + EP). Tomma och icke-elektro cellerna motsvarartill autofluorescens, medan elektroporerade celler visar en bred spridning av internaliserade molekyler, med en högre andel högt belastade celler på 100 pmol (≥ 4 molekyler, se asterisk-märkta bin). Internaeffektivitet (fraktion av celler med Int.> Betyda + 3x Std. Dev. Icke -EP prov) för 10 och 100 pmol prover var 94% och 90%, respektive. Genomsnittlig antal interna molekyler per cell: 121 ± 106 molekyler för 10 pmol dsDNA och 176 ± 187 molekyler för 100 pmol dsDNA. Inställningar: 100 ms exponering, widefield belysning. Skalstrecken: 1 ^ M. Denna siffra har modifierats referens 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cell lastning och viabilitet

Förutom att ändra mängden av märkta biomolekyler sattes till cellerna före elektroporering, denanvändaren kan finjustera mängden interna molekyler genom att välja olika fältstyrkor under elektroporering (Figur 4, Kompletterande Movie 1). Högre fältstyrkor leder till större interna effektivitet, men leder till en liten minskning av cellernas livskraft. För protein intemalisering, kan användningen av ett filtreringssteg hjälpa till att avlägsna icke-internaliserade märkta proteiner (se 3.3.3.1.1). I sådana fall ser cellfiltrering som observerade fluorescerande proteiner faktiskt intern inuti bakterie cytoplasman; Vi noterar dock har denna filtrering också en negativ inverkan på cellviabilitet (för mer information, se REF 22).

Figur 4
Figur 4: Påverkan av elektrospänning vid cell lastning och livskraft (A) Stapeldiagram representerar effekten av elektrofältstyrka på lastning effic.iency (röda staplar) och cellernas viabilitet (gröna staplar). 84 ± 8% av den icke-electroporated cell (0 kV / cm) klyftan efter 1 h på en agaros dynan vid 37 ° C. Under samma förhållanden, 78 ± 3% och 49 ± 3% av cellerna elektroporerade på 0,9 kV / cm och 1,8 kV / cm respektive dela efter 1 timme. För laddningseffektivitet, är 73 ± 8% av cellerna laddas vid 0,9 kV / cm, medan 92 ± 6% av cellerna lastas vid 1,8 kV / cm. Felstaplarna representerar standardavvikelsen beräknad utifrån tre oberoende mätningar; mer än 200 celler analyserades för varje prov och varje upprepning. Generellt laddningseffektivitet ökar med elektroporering spänning till den ringa nackdel för cellviabilitet. (B) Cellbaserade fluorescensmätningar över flera generationer visar att den totala fluorescensintensiteten delas lika mellan de båda dottercellerna. Cell 1 och 2 avser antalet celler i den vita ljusbild (vänster) och fluorescens bild vid t = 0. Skalabar: 1 mikrometer). Denna siffra har modifierats referens 26.

Proteininterna

Representativa resultat proteininterna finns i figurerna 5A & B. Det är särskilt viktigt att ta bort så mycket av det återstående fria (oreagerad) färgämne från provproteinet som möjligt före elektroporering. I exemplen i figurerna 5A & B, den Cy3b märkta Klenow Fragment prov (Cy3b-KF, där KF är Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymeras I, 66 kDa) endast innehåller ett% fritt färgämne; sådant färgämne bidrag till den totala cellbelastning är försumbar. Jämförelser av electroporated prov av intresse med både de icke-elektro celler (inkuberas med samma mängd märkt protein) samt celler elektroporerade med motsvarande mängd fri färgämne utgör två nödvändiga kontroller för att säkerställa att de observerade fluorescerande molekylerär faktiskt intern märkta proteiner.

Figur 5
Figur 5: Protein interna i levande bakterier (A) representant fluorescens overlay fält vyer.. Celler elektro vid 1,4 kV spänning med 50 pmol RNAP ω subenhet från ett proteinstamlösning som innehöll endast 1% fri Cy3b färgämne. Icke-elektro (non -EP) och tomma celler definieras som tidigare. Fri färgämne interna vid samma koncentration som i RNAP ω electroporated prov. Imaging i brett fält läge, 532-nm excitation vid 1 mW, 50 ms exponering. (B) Fördelning av okorrigerade cell genomsnitt intensiteter för prover (A), som ges i andel av det totala antalet celler. Mer än 400 celler per prov segmente. Denna siffra har modifierats referens 22. (C) Internalisering av UNLABeled T7 RNA-polymeras (T7-RNAP, 98 kDa) i elektrokompetent DH5a bärande pRSET-EmGFP plasmid kodande smaragd GFP (EmGFP) under kontroll av en T7-promotor. Vänster: Schematisk analys. Mitten: fluorescens overlay. Höger: histogram för cellbaserade fluorescensintensiteter för icke-electroporated prov (överst) och celler odlades och elektro med T7 RNAP (botten); ca 11% av de elektroporerade cellerna visar hög fluorescensintensitet (fraktion av celler med Int.> betyda + 3x Std. Dev. icke -EP prov) indikerar uttryck av EmGFP. Asteriskerna anger lådor samla alla intensiteter över eller lika 1.100 au Skala bar: 3 pm. Denna siffra har modifierats referens 26.

Figur 5C visar en annan tillämpning av protein elektroporering. Här är den elektro proteinet omärkt, men dess interna utlöser ett observer fluorescerande svar. Detta experiment verifierar presinne och funktionaliteten hos electroporated proteiner i cellens cytoplasma. Omärkt T7 RNA-polymeras (98 kDa) internaliseras i E. coli stam DH5a innehållande en plasmid som kodar för fluorescerande protein EmGFP under kontroll av en T7-promotor 26. Eftersom genen för T7 RNA-polymeras är frånvarande i DH5a, EmGFP expression i våra experiment kräver att funktionell T7 RNA-polymeras är införs i cellerna via elektroporering (figur 5C). Efter elektroporering med 1 pmol T7 RNAP,> 11% av cellerna (blå stapel, figur 5C) uppvisade fluorescens högre än den negativa kontrollen (inkuberas med samma mängd T7 RNAP, men inte elektro). Detta resultat fastställer att en del av de T7 RNAP molekylerna interna genom elektroporering behåller sin integritet in vivo och kan utföra sina avsedda funktioner i cellens cytoplasma.

In vivo FRET vid enda molekyloch encelliga nivåer

Slutligen interna och analys av dubbelt märkta arter i levande bakterier som presenteras i figur 6 och Kompletterande Movie 3. Som fluorescerande proteinfusioner är inte idealiskt för in vivo smFRET studier, är en förmåga att leverera dubbelt märkta biomolekyler i levande celler använder elektroporering av de stora tillgångar av detta förfarande. Figur 6A visar encelliga FRET analys av bakterier laddade med olika FRET DNA-standarder (med hjälp Cy3B och Atto647N fluoroforer såsom donator-acceptor FRET par). Celler electroporated med 20 pmol av tre korta dubbelt-märkta dsDNA FRET standarder med uppenbara FRET effektivitet (E *) av 0,17, 0,48, och 0,86 in vitro (tidigare bestämda 26). Alla DNA: n in i celler effektivt (Figur 6A, vänster) och huvudtoppen av varje encelliga E * fördelning stämmer väl överens med de in vitro resultaten (Figur 6A, Höger). I medellång- och hög FRET prover, cellpopulationer med lägre E * än väntat observeras, förmodligen på grund av en kombination av acceptor blekning och fotofysisk inaktivitet, rörlig cell lastning (alltså, variabel signal-till-brus-förhållande) och DNA nedbrytning .

Figur 6
Figur 6:.. Representativa resultat för encelliga och enda molekyl FRET observation i levande bakterier Ensemble och smFRET studier i enskilda bakterier (A) Analys av celler laddade med 20 pmol vardera av tre DNA FRET standarder uppvisar låg (~ 0,17), mellanprodukt (~ 0,48) och hög (~ 0,86) FRET (mätt med användning av in vitro-mätningar enda molekyl; se ref 26). Vänster: vitt ljus och grön / röd (FRET) fluorescens overlay bilder (Skala bar: 3 pm). Exempel på FRET-värden från olika celler indikeras (vit). Rig ht (topp till botten):. okorrigerade cellbaserade FRET (E *) histogram för givare endast (mörkgrön), låg (ljusgrön), mellan (gul), och hög (röd) FRET DNA-standarder (B-D) In vivo smFRET. Celler laddas med 0,25 pmol intermediär-FRET-DNA (fält B), 0,25 pmol hög FRET-DNA (fält C) och 5 pmol dubbelt märkt KF (panel D). Vänster kolumn: grön / röd fluorescens lagring av enstaka bild före och efter acceptor fotoblekning. Mellanöstern kolumn: tids spår motsvarande molekylen i den gula cirkeln. FRET effektivitet, utsläpp donator intensiteter och acceptutsläppsintensitet visas i blått, grönt och rött, respektive. Höger kolumn: FRET histogram av donator endast molekyler (grön) och donator-acceptormolekyler (gul, röd, och grå) från 20 tids spår för varje prov. Skala barer: 3 pm för A, 1 ìm för B-D. Denna siffra har modifierats referens 26.208fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att observera smFRET in vivo för DNA- eller proteinprover, låga mängder (0,25 pmol) av intermediär- och hög-FRET DNA-standarder (Figur 6B, C) ​​eller 5 pmol av dubbelmärkt KF (Alexa647 / Cy3B fluoroforer som FRET-par, figur 6D) är elektro i E. coli. Sådana koncentrationer ledde till många celler laddade med få (n = 1-10) märkta molekyler, att direkt lokalisering, spårning, och FRET övervakning för enstaka molekyler. Vissa molekyler diffunderar fritt, medan andra verkar orörliga eller diffundera långsamt (Kompletterande Movie 3). Timetraces av immobiliserade dubbelt-märkta biomolekyler (Figur 6, mitten) varar 1 till 30 s och visar kännetecken smFRET: anticorrelated förändringar i givaren och mottagaren fluorescens vid acceptor blekning (t.ex. t ~ 16 sek; Figur 6B, mitten ), följt av enstaka-steg donator blekning (exempelvis t ~; 19 sek; figur 6B). FRET distributioner som genereras från sådana timetraces (Figur 6, höger) resulterar i ett medelvärde som är i utmärkt överens med publicerade in vitro studier 26,31,32. Dessa resultat fastställa kapacitet för kvantitativa smFRET studier om interna DNA och proteiner, och föreslå att proteiner är oskadade och struktur på elektroporering och interna (som stöds av T7 RNAP interna experiment).

Kompletterande Film 1:. Cellviabilitet Vänster: Vit ljusbilder. Höger: fluorescens bilder. Animerad GIF animerade visar fördelningen efter elektroporering (1,8 kV / cm) av bakterier lastade med 10 pmol Atto647 märkt DNA. Den totala skenbara minskningen av fluorescens beror på utspädning av märkt DNA på celldelning och även delvis till fotoblekning, som uppträder under varjemätning.

Kompletterande Movie 2: Cellbaserad Fotoblekning studier A.. Representativt exempel på en tungt lastad cell (innehållande> 100 Atto647N-märkta DNA-molekyler). Överst till vänster, vitt ljus bild av cellen av intresse (röd rektangel). Överst till höger, film av de laddade cellerna visar deras fluorescens förfall under flera minuter. Bottom, tidskurva för den totala fluorescensintensiteten sönderfall av cellen av intresse. Organiska fluoroforer kan uppvisa fotoblekning livstid 2 tiopotenser högre än ramprogrammen (här, ~ 41 sek för Atto647N). B. Ett representativt exempel på en cell laddad med mindre än 10 märkta molekyler (3 i det här fallet). Top, samma som panel A. Bottom, tidskurva för den totala fluorescensintensiteten hos cellen av intresse visar enda steg blekning och / eller blinkar motsvarande enskilda organiska fluoroforer. Den genomsnittliga höjden av dessa steg motsvarar enda molekyl enhetlig intensitet (här ~12 AU) som används för att beräkna de initiala antalet interna molekyler per cell. Filmer under ständig röd laserexcitation vid 300 pW makt och 100 msek per ram.

Kompletterande Movie 3: I n vivo enda molekyl FRET Top:. Celler laddad med 0,25 pmol hög FRET DNA (som i figur 6C) övervakas kontinuerligt på 50 ms per ram enligt nTIRF belysning med 1 mW grön (532 nm) laser. Varje ram är en grön / röd (FRET) fluorescens lagring av varje kanal. Spridande och orörlig röda (intakt) och grön (enda aktiv etikett) DNA-molekyler kan observeras. Botten: Tid spår motsvarande molekylen i den gula cirkeln. FRET effektivitet, utsläpp donator intensiteter och acceptutsläppsintensitet visas i blått, grönt och rött, respektive. Anti-korrelerade acceptor blekning händelse (röd-till-grön övergångar) motsvarar undertecknandet av en enda molekyl FRET.

Discussion

Många parametrar kan varieras under cell elektroporering och datainsamling, beroende på det biologiska systemet av intresse och den exakta arten av experimentet (cellnivå eller enda molekyl analys). Till exempel, när electroporating DNA i bakterier, 0,25-5 pmol märkta dsDNA-fragment leder till en låg interna effektivitet, för att direkt enda molekyl detektering (dvs., Utan behov av fotoblekning i förväg). Över 5 pmol dsDNA, celler tenderar att vara tungt lastad, en regim bättre lämpad för encelliga analys. Alla märkta DNA: n bör också vara tidigare gelrenades för att avlägsna varje spår av fritt färgämne (icke-reagerade fluorofor) från DNA-stamlösningen. Dessutom potentiella problem med DNA nedbrytning, särskilt för smFRET experiment, kan åtgärdas med hjälp av DNA-molekyler med onaturliga nukleinsyror eller motiv som skyddar exonukleas-tillgängliga terminaler såsom hårnålsslingor.

En annan adjustable parameter i elektroporering är fältstyrkan appliceras under elektroporering. Låg fältstyrka (~ 1 kV / cm) kommer att leda till en låg laddningseffektivitet lämplig för enda molekyl studier. Högre fältstyrkor (upp till 1,8 kV / cm) ökar lasteffektiviteten; Men det finns ett omvänt samband mellan fältstyrka och cellviabiliteten efter elektroporering (se figur 4). För referens, en normal fältstyrka används för bakterier och jäst elektroporation är ~ 1,5 kV / cm. Tidskonstanten, som representerar längden på detta förfall, är en bekväm parameter att följa, eftersom de ständiga droppar tids så fort något överslag fenomen inträffar i kyvetten. Under normala inställningar, bör tidskonstanten vara större än 4 ms; lägre värden kommer att leda till låg lasteffektivitet eller ens icke-lastade skadade celler. De flesta electroporators erbjuda andra frihetsgrader (t.ex. "pulstrunke" eller "puls form"), som kan modifieras för att ställa bådecellbelastning och viabilitet. Vi tillämpade denna metod för att både bakterier och jäst, men liknande förfaranden bör också göra det möjligt att internalisering av märkta biomolekyler i däggdjursceller med hjälp av lämpliga inställningar elektroporator eftersom deras membran är faktiskt mindre komplex (singel lipidbiskiktet) och eftersom elektroporering har redan använts med sådana celler 21.

När interna märkta proteinerna, behöver all fritt färgämne som skall avlägsnas från det märkta proteinet stamlösningen före elektroporering. Fria färgämnesmolekyler, på grund av sin mindre storlek, kan intern företrädesvis över proteiner av intresse, och är svåra att skilja under dataanalys (trots deras förväntade snabbare diffusion). Som en guide, för ett urval av ekologiskt märkta proteinet vara lämpliga för elektroporering, bör mängden återstående fria färgämne vara under 2% (detekteras med hjälp av fluorescerande scanning av ett SDS-PAGE) 22. Denna process är särskilt viktig,som vissa molekyler kan hålla sig till de yttre membranen hos electroporated bakterier eller jäst. I detta sammanhang bör det negativa kontrollprovet visar fluorescensintensiteten per cell klart lägre än elektroporerade celler, helst så låg som den autofluorescens nivån tomma celler (celler som inte har varit inkuberade med eventuella fluorescerande biomolekyler heller elektroporerade, Figur 2).

Som med dsDNA, är internaeffektiviteten av märkta proteiner kopplade till mängden biomolekyler till cellerna före elektroporering. Men andra parametrar, såsom storlek och laddning, spela en roll i interna. Små proteiner uppvisar höga interna effektivitet, medan större proteiner (upp till 98 kDa) kan framgångsrikt intern men med lägre effektivitet (Figur 5) 26. Den isoelektriska punkten av proteinet, potentiella interaktioner med cellmembranet och andra fysikalisk-kemiska parametrar ocksåinflytande cellbelastning under elektroporering. Som ett resultat, användarna behöver för att optimera experiment för sitt eget system, att veta att en hög initial koncentration av märkt protein (> 50 ^ M) kommer att ge den bästa chansen för framgångsrik lastning. Elektroporation erbjuder också ett nytt verktyg för att störa och analysera cellulär funktion genom att införa proteiner och andra biomolekyler i celler (antingen märkta eller omärkta). T7 RNA-polymeras experiment (figur 5C) närvarande ett sådant exempel på ett experiment där vi kan införa en biomolekyl som kan förändra genuttryck in vivo med användning av elektroporering.

När du utför enda molekyl fluorescens experiment, är TIR belysning brukar gynnas framför andra belysningslägen som det erbjuder det bästa signal-brus-förhållandet med endast spännande fluoroforer inom en tunn sektion ovanför täckytan (~ 100 nm). Men imaging märkta biomolekyler diffunderar inuti levande mikroorganismer kan relägget djupare belysning (upp till 0,8 | im för E. coli). Djupare belysning uppnås i Hilo läge, samtidigt som en hög signal-brus-förhållande. Å andra sidan, är brett fält avbildning särskilt viktigt för stegvis fotoblekning analys, där användaren uppskatta antalet interna molekyler genom fotoblekning en hel laddad cell med hög lasereffekt och dividera den initiala cellfluorescensintensitet med det enhetsintensitet produceras av en enda molekyl (enda fotoblekning steg, fig 3). Widefield bildbehandling krävs också för långsiktig molekylen spårning för att lokalisera de diffunderar molekylerna av intresse, även om deras banor täcker hela cellvolymen.

I detta protokoll presenterar vi hur elektroporering, en standardteknik för biologer och biokemister för att leverera nukleinsyror i celler, utgör en enkel metod för att leverera fluorescerande biomolekyler i olika celltyper. Thär ny, och erbjuder hög kapacitet teknik ett unikt verktyg för att observera märkta molekyler i sin ursprungliga miljö. I tillägg finns biomolekyler märkta med fluoroforer täcker ett brett spektrum av våglängder, elektroporering kan leverera molekyler modifierade med många kemiska grupper, såsom onaturliga nukleotider och aminosyror, metallkelatorer, tvärbindningsmedel, och placering i bur grupper. Om det biologiska systemet av intresse är inte avgörande för cellutveckling, kan den gen som kodar för målproteinet också tas bort (eller knackat ned), se till att proteinerna observerats efter interna representerar alla (eller de flesta) av den intracellulära proteinpoolen . I huvudsak kan elektroporering "transplantation" flexibiliteten i in vitro biokonjugaten in i levande celler och därmed gynna insatser inom syntetisk biologi, systembiologi och in vivo enda molekyl upptäckt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells Invitrogen 11319-019 or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.
EZ Rich Defined Madia Teknova M2105 low fluorescence rich media
MicroPulser Electroporation Apparatus  Biorad 165-2100 or any classical electroporator for microorganism transformation
Certified Molecular Biology agarose Biorad 161-3100 low fluorescence agarose for agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 thickness Menzel BB024060SC remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h
Single-molecule fluorescence microscope Home-built described in REFs
Localization software Custom-written, available online MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. 
Tracking software Available online MATLAB implementation by Blair and Dufresne. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Leake, M. C., et al. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  3. Taniguchi, Y., Kawakami, M. Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy. Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).
  4. Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).
  5. Lee, J. H., et al. Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ. Science. 343, 1360-1363 (2014).
  6. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  7. Sauer, M. Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact. J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).
  9. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Meth. 2, 905-909 (2005).
  10. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).
  11. Jaitin, D. A., et al. Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types. Science. 343, 776-779 (2014).
  12. Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biol. 14, R124 (2013).
  13. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
  14. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).
  15. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  16. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).
  17. Clarke, M. S., McNeil, P. L. Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol. J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).
  19. Taylor, L. S. Electromagnetic syringe. IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).
  20. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).
  21. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  22. Sustarsic, M., et al. Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation. Histochem Cell Biol. , (2014).
  23. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).
  24. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 000, 1-5 (2014).
  25. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).
  26. Crawford, R., et al. Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules. Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).
  27. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).
  28. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. J Vis Exp. , (2014).
  29. Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods. Phys Biol. 7, 031001 (2010).
  30. Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. Perspective - Living cells as test tubes. Science. 312, 228-230 (2006).
  31. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).
  32. Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature communications. 4, 2131 (2013).

Tags

Mikrobiologi elektroporering fluorescens FRET in vivo enda molekyl imaging bakterier Escherichia coli jäst intemalisering märkta DNA märkta proteiner
Interna och Observation av fluorescerande Biomolekyler i levande mikroorganismer via elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aigrain, L., Sustarsic, M.,… More

Aigrain, L., Sustarsic, M., Crawford, R., Plochowietz, A., Kapanidis, A. N. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (96), e52208, doi:10.3791/52208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter