Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Internalisering og Observation af fluorescerende biomolekyler i levende mikroorganismer via Elektroporation

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/52208
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford, 2Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Center

Introduction

De fleste fluorescens undersøgelser inde levende celler afhænger af proteinfusioner med fluorescerende proteiner (fps), såsom GFP 1. Disse fluorescerende tags kan studier af kopitallet, diffusion mønster eller lokalisering af proteiner involveret i processer som genekspression eller membran transport 2-7. Rammeprogrammer tilbyde høj mærkning specificitet, nem implementering, og fås i en stor beholdning af varianter med forskellige fotofysiske og kemiske egenskaber 1. Men organiske fluoroforer forbliver det primære valg for in vitro-forsøg på grund af deres større fotostabilitet (op til 100 gange mere stabil end rammeprogrammerne) 8,9, lille størrelse (op til 100 gange mindre volumen end RP) og nem intramolekylær mærkning (især gennem anvendelse af cysteinrester). Alle disse faktorer er særligt vigtige for enkelt-molekyle fluorescens og FRET studerer 10.

Adskillige internalisering metoder Combining fordelene ved økologisk mærkning og in vivo detektion er blevet indført i det seneste årti; Imidlertid er sådanne metoder enten anvende relativt store polypeptider tags (f.eks TMP, halogen eller 20 kDa SNAP tags) 11-14, kræver anvendelse af unaturlige aminosyrer 15, eller er begrænset til store, single-membran eukaryote celler (f.eks. , skrabe lastning, sprøjte lastning, mikroinjektion) 16-19.

Denne protokol beskriver en roman, ligefrem og højt gennemløb internalisering metode, par fordelene af organiske fluoroforer med in vivo observation. At udvikle denne teknik, vi tilpasset elektroporation procedure almindeligvis anvendes til at transformere celler med plasmid-DNA 20,21 med henblik på at indlæse mikroorganismer, såsom E. coli eller S. cerevisiae med økologisk mærkede biomolekyler. Protokollen består af 4 trin: inkubering af celler med mærkede biomolekyler,elektroporation, celle opsving, og celle vask for at fjerne ikke-internaliserede biomolekyler. Her præsenterer vi denne elektroporation protokol, samt cell imaging og dataanalyse processer for at studere cellebaserede og single-molekyle fluorescens og ærgre signaler.

Elektroporation afhængig udleder en høj spænding elektrisk felt over en lav ionstyrke cellesuspension at danne forbigående membranporer hvorigennem biomolekyler kan indtaste celler (figur 1) 20,21. Ligesom med transformation af bakterier eller gær med plasmid-DNA, skal være forberedt før elektroporering at sikre deres electrocompetency celler. Denne procedure, som består af flere vasketrin med vand, øger membranpermeabilitet og sænker ionstyrken af ​​cellen løsning til at undgå lysbuedannelse i elektroporation cuvette. I denne protokol, kan celler fremstilles som beskrevet nedenfor (se PROTOKOL: 1.1) eller købt fra kommerciel udbyders.

Figur 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af internalisering protokollen Fra venstre til højre:. Tilføje et par mikroliter mærkede biomolekyler til alikvot af elektrokompetente celler (dobbelt-mærkede DNA-fragmenter og bakterier i dette eksempel); inkuberes 1 til 10 minutter på is og overføre til en forud afkølet elektroporation cuvette; elektroporere og derefter tilføje 0,5-1 ml rigt medium til cellerne umiddelbart efter; inkuberes ved 37 ° C (eller den ønskede temperatur af organismen, fx 29 ° C for gær) at lade cellerne inddrive; udføre 5 vasketrin for at fjerne overskydende ikke-internaliserede mærkede molekyler; resuspenderes slutpelleten i 100-200 ml PBS-buffer og pipette 10 pi på en agarose pad; dække puden med en renset dækglas og billede på et fluorescens mikroskop (i bredt felt tilstand eller HILO tilstand).

(figur 1). Overskuddet af ikke-internaliserede mærkede biomolekyler først fjernes ved vask i en puffer indeholdende en forholdsvis høj koncentration af salt og nogle detergent (Se PROTOKOL: 3.3). Tilstedeværelsen af ​​salt forstyrrer ikke-specifikke elektrostatiske interaktioner dannet af ikke-internaliserede mærkede biomolekyler, som ellers kan sætte sig fast på den ydre membran. Tilsvarende nærvær af detergent i vaskebufferen forstyrrer ikke-specifikke, hydrofobe interaktioner.

Mens DNA internalisering er ligetil (figur 2), der skal tages, når internalisere mærkede proteiner ved hjælp af elektroporation forholdsregler. For det første kan bestanden prøve af økologisk mærkede protein stadig indeholde en lille procentdel af gratis farvestof. Gratis farvestofmolekyler er meget mindre end proteiner, og måske derfor internaliseres fortrinsvis. For at sikre, at størstedelen af de observerede internaliserede fluorescerende molekyler svarer til proteinet af interesse, bør den oprindelige proteinprøve indeholde mindre end ~ 2% fri farvestof (figur 5) 22. Overskuddet af ikke-internaliserede mærkede proteiner kan også holde sig til den ydre cellemembran efter elektroporation; dette fænomen er protein-specifik og skal kontrolleres for hvert nyt protein. Vi foreslår flere muligheder, der tillader fjernelse af ikke-internaliserede proteiner fra den indlæste celleprøve (Se PROTOKOL: 3.3.3).

Endelig celler resuspenderes i et lille volumen af ​​phosphatbuffer og pipetteret på en agarose pad, så deres billeddannelse på et fluorescensmikroskop. Immobilisering på agarose puder er en simple og effektiv måde at billeddannelse celler på et dækglas uden at skade deres integritet. Puden bør indeholde en lav fluorescens dyrkningsmedium.

Cell imaging kan udføres enten i Vidvinklet, total intern refleksion fluorescens (TIRF) eller ved hjælp HILO (Highly krængning og lamineret Optical Sheet) mikroskopi. I Hilo konfiguration laserstrålen trænger dybere ind i prøven end i TIRF, endnu ikke belyse hele prøven som for Vidvinklet, som tillader en større signal-støj-forhold 23. Afhængigt af laser magt og tidsopløsning bruges kan internaliserede biomolekyler tælles (ved hjælp af trinvis-fotoblegning analyse, figur 3), lokaliseret, eller spores 24-28. Internalisering af dobbelt mærkede konstruktioner med et FRET par fluoroforer tillader kvantificering af FRET både enkelt celle eller et enkelt molekyle niveauer (figur 6).

Forskellige parametre kan varieresafhængig af den ønskede effekt og det biologiske system undersøgt. For det første kan mængden af internaliseret materiale per celle indstilles ved at ændre koncentrationen af mærkede biomolekyler tilsat til cellerne før elektroporering (figur 2). Elektroporering feltstyrke vil også påvirke både lastning effektivitet og levedygtighed celle; som forventet, mens stiger belastningseffektivitet med stigende feltstyrke, levedygtigheden af elektroporerede celler aftager (figur 4A). Begge parametre kan kvantificeres ved at registrere den procentdel af lastet og delende celler efter elektroporering. Denne levedygtighedsassay kombineret med fluorescensimagografi også kontrollerer observation af internaliserede biomolekyler i levende celler og tillade kontinuerlig observation over flere generationer (figur 4B).

Sammenfattende denne protokol tillader internalisering af fluorescensmærkede DNA og proteinmolekyler iE. coli eller S. cerevisiae 26. Enkelte molekyler mærket med økologiske fluoroforer kan spores med høj spatiotemporale opløsning til tidshorisonter en størrelsesorden længere end rammeprogrammer. Endelig er denne metode er kompatibel med Vidvinklet, TIRF og konfokal afsløring, samt pulserende excitation ordninger såsom ALEX (skiftevis laserexcitation 28,29).

Protocol

1. Cell forberedelse

  1. Fremstilling af lab-gjort elektrokompetente bakterier
    1. Forbered en 5-10 ml overnight prækultur fra en enkelt koloni af E.coli stamme af interesse i en lav-fluorescens medium, såsom M9 eller EZ Rich Defined Medium.
    2. Om morgenen, pode en ny 400 ml kultur med overnight forkultur sådan, at OD 600 nm starter 0,02. Føj til de 400 ml lav fluorescens medium 2,5 ml 1 M MgSO4 og 2,5 ml 1 M MgCl2.
    3. Vokse ved 37 ° C og 250 rpm, indtil OD600 nm når 0,4 til 0,6.
    4. Stoppe væksten ved nedkøling kulturen i et is-vandbad i 10-15 min.
      Bemærk: Fra nu af udføre alle trin ved 4 ° C (på is).
    5. Centrifugeres kulturen 15 minutter ved 1000 x g. Bortkast supernatanten og resuspender cellepelleten i 250 ml kølede og sterilt destilleret H2O
    6. Gentag centrifugering og resuspension trin tWice, begrænse den mængde vand til 100 ml og derefter 50 ml.
    7. Centrifugeres kulturen 10 minutter ved 1000 x g. Bortkast supernatanten og resuspender cellepelleten i 25 ml afkølet og sterilt destilleret H 2 O + 10% glycerol.
    8. Gentag centrifugering og resuspension trin tre gange, faldende volumen på 10% glycerol-opløsning til 10 ml, 5 ml og endelig til 500 pi.
    9. Alikvot cellerne i portioner af 20 pi hver flash-fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
  2. Kommercielle elektrokompetente bakterieceller
    1. Fortynd en kommerciel celle portion 1: 1 med sterilt kølet destilleret vand. Gør portioner og butik 20 pi ved -80 ° C.
  3. Forberedelse elektrokompetente gær
    Bemærk: elektrokompetente S. cerevisiae-celler fremstilles før hver elektroporation eksperiment og ikke kan opbevares ved -80 ° C som for E. coli.
    1. For at starte, pode 50 ml YPD-medium med en enkelt koloni af den ønskede stamme af interesse.
    2. Inkuber ved 30 ° C og 250 rpm, indtil OD600 nm når 0,6 til 0,8.
    3. Centrifuger cellerne ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Pellet resuspenderes i 25 ml kølet og sterilt destilleret H 2 O.
    5. Gentag vasketrin resuspenderes to gange i 25 ml vand og resuspenderes to gange i 2 ml af en afkølet opløsning af sorbitol på 1 M.
    6. Resuspender cellerne i 250 pi 1 M sorbitol og opdele cellerne i 50 pi alikvoter.

2. Agarose pad forberedelse

  1. For at fjerne baggrund fluorescerende partikler, brænde et dækglas i en ovn ved 500 ° C i 1 time. "Clean brændt" dækglas kan opbevares i uger ved stuetemperatur dækket med aluminiumfolie.
    Bemærk: Andre almindelige rengøringsmetoder såsom plasma rengøring eller Piranha-opløsning kan anvendes, så længe baggrundfluorescens af de rengjorte slides stadig kvasi-null.
  2. Forbered en lav fluorescens agaroseopløsning ved smeltning i en mikrobølgeovn en 2% agarose - destilleret vand opløsning (70 ° C). Straks tilføje 500 pi af det klare 2% agaroseopløsning til 500 pi 2X lav fluorescens dyrkningsmedium og blandes forsigtigt.
  3. Før det køler ned og hærde, straks pipette denne agarose - medium løsning på et mikroskop dækglas (nr 1,5 tykkelse) for at danne en pude af ca. 2 cm diameter og en højde få millimeter. Undgå bobler og pop dem med en pipette tips, hvis nødvendigt.
  4. Glat puden med en anden "brændt" dækglas (nr 1,5 tykkelse, se figur 1).
    Bemærk: Denne øvre dækglas med til at danne en flad homogen pad og beskytte mod støv og tørring, mens celler er under udarbejdelse. Minimal medium, såsom M9 eller rigt medium, såsom EZ Rich Defined Medium er blevet testet for deres lave fluorescens.

3. Electroporation

  1. Inkubation
    1. Tilføj op til 5 pi af mærkede molekyler, der er lagret i en buffer med lavt saltindhold (<50 mM salt) til en enkelt portion af kompetente celler (bakterier 20 pi eller 50 pi gær) og inkuber 10 minutter på is.
      Bemærk: Koncentrationen af ​​fluorescensmærkede molekyler i stamopløsningerne og dermed mængden af ​​mærkede molekyler tilsættes til cellen før elektroporering er direkte korreleret med belastningseffektivitet (figur 3, og diskussion). Da nogle proteiner er mindre kompatible med lav salt tilstand, kan saltkoncentrationen i opbevaringspuffer øges, men mængden af ​​mærkede molekyler tilsat til cellerne før elektroporering skal så være nedsat.
    2. Overfør blandingen af ​​celler og mærkede biomolekyler i en præ-kølet elektroporation cuvette (0,1 og 0,2 cm afstand for bakterier og gær, henholdsvis). Bank forsigtigt på kuvetten på bænken for at fjerne eventuelle bobler fra opløsningen.
    3. Placer cuVette i elektroporator og anvende en høj spænding elektrisk impuls til opløsningen (0,9-1,8 kV / cm, se diskussionen for flere detaljer om valg af spænding). En sådan impuls danner forbigående porer i cellemembraner tillader mærkede biomolekyler at diffundere ind i cellerne.
    4. Kontroller, at tidskonstanten vises på elektroporator er mellem 4 til 6 ms. Lavere tidskonstanter skyldes ofte for høj saltkoncentration og / eller tilstedeværelse af bobler i kuvetten, og vil føre til meget lav eller ingen belastning af cellerne.
  2. Recovery
    1. Umiddelbart efter elektroporering, tilsættes 500 pi rigt medium, såsom SOC, EZ Rich Defined Medium, YPD eller et rigt medium til cellerne.
    2. Prøven inkuberes ved 37 ° C for bakterier og 29 ° C for gær til 2 til 10 min. For levedygtighedsmålinger, hvor brugeren ønsker at vurdere procentdelen af ​​celler, der vokser og deler sig efter elektroporation bruge en længere restitutionstid (op til 1 time), da we observere sådanne LAG gange før den første celledeling.
  3. Vasketrin
    1. Vask cellerne for at fjerne eventuelle ikke-internaliseres biomolekyler ved nedspinning cellerne i 1 minut ved 3300 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 500 pi PBS.
      Bemærk: For hver prøve, udarbejde en negativ kontrol af celler inkuberet med den samme mængde af mærkede biomolekyler, men ikke elektroporerede og vasket nøjagtig samme måde som den vigtigste prøve.
    2. Gentag de foregående trin 3 gange.
    3. I tilfælde af protein internalisering, optimere vaskeproceduren afhængigt af egenskaberne og opførsel af det mærkede protein af interesse. Følgende trin er eksempel på mulige optimeringer:
      1. Udføre den første 3 vaskecyklusser under anvendelse af PBS indeholdende 100 mM NaCI og 0,005% Triton X100 at fjerne ikke-internaliseres proteiner, som kan klæbe til den ydre cellemembran 22 <sup> 26.
        1. Filter elektroporerede celler med en 0,22 um porestørrelse filter monteret inde i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved pipettering af elektroporerede celler i filteret. Spin ned i 3 min ved 800 xg og 4 ° C. Kassér gennemstrømning. Tilføj 500 pi ny PBS over cellerne og spin dem igen som før og gentag disse trin, når 22.
      2. Tilføj en lille mængde protease K (10 ng i 500 pi PBS) i første vaskecyklus at tillade spaltning af ikke-internaliserede protein.
    4. Spin ned cellerne i 1 minut ved 3300 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 150 pi PBS.
    5. Spred indlæst celle løsning på agarose puden ved at fjerne den øvre dækglas og spredning 10 pi af cellesuspensionen dråbe ved dråbe. Udskift en ubrugt ren brændt dækglas (nr 1,5 tykkelse, der matcher mikroskopobjektivet specifikation) på than toppen af ​​puden, og tryk meget forsigtigt på objektglasset.
    6. Beskyt elektroporerede celler mod lys ved at gemme puderne i en uigennemsigtig kassen, mens billeddannelse forskellige prøver.

Erhvervelse 4. Mikroskop data

Bemærk: Single-celle og single-molekyle fluorescens mikroskopi i levende mikroorganismer kan udføres på en hvilken som helst passende fluorescens mikroskop (specialbygget eller kommerciel).

  1. Indstillinger
    1. Vidvinklet eller HILO belysning
      1. Billede prøver med nogen TIRF / single-molekyle mikroskop.
        Bemærk: Som et eksempel, bruger vi i laboratoriet en tilpasset omvendt mikroskop med et TIRF opsætning. Bjælker fra en 532-nm og en 637-nm diode laser kombineres og kollimeret før fokusering på bagsiden brændplan af målet. Fluorescens fra prøven indsamles via det samme mål, adskilt fra excitationslyset ved hjælp af en lang-pass og et hak filter, og opdelt i reD og grønne kanaler ved hjælp af et dikroisk spejl. De to kanaler er afbildet på separate halvdele af chippen af ​​en elektron-multiplicere ladningskoblet indretning (EM-CCD) kamera. Videoer optages med den kinetiske tilstand. Hvidt lys billeder opnås ved anvendelse af et hvidt lys lampe og en kondensator knyttet til mikroskopet som en belysningskilde.
      2. Til almindelig single-molekyle observation, indstille belysningen tilstanden af mikroskopet til TIRF eller HILO 23 (se Diskussion for mere information om TIRF versus HILO imaging). For at indstille en HILO tilstand på et TIRF mikroskop, falde en smule indfaldsvinklen af ​​excitationslyset at flytte fokus lidt højere end dækglasset overflade (billedet cellens indre snarere end dens nedre membran i kontakt med dækglas, se 4.5.4 ).
      3. For celle-niveau analyse, lange single-molekyle sporing forsøg eller trinvis fotoblegning analyse, indstille belysningen tilstanden af ​​mikroskopet til en Widefield tilstand ensuring kontinuerlig observation af cellevolumen helhed og dermed for alle internaliserede mærkede molekyler.
    2. Typisk brug excitation beføjelser omkring 0,5-3 MW (~ 50-400 W / cm2).
      Bemærk: Lavere laser beføjelser er nyttigt at opnå lang levetid fluorescens observation og sporing (over 1 minut), mens kan være påkrævet højere laser beføjelser til videregående spatiotemporale opløsning eller trinvis fotoblegning analyse.
    3. Brug eksponeringstider spænder fra 15 ms til sporing eksperimenter til 100 ms for mere generel observation og intensitet kvantificering. Bemærk: Andre frame rates og tilstande kan bruges som stroboskopisk belysning, især til at studere hurtigt spredende arter 30.
    4. I TIRF mikroskop, registrere fluorescens kanal på en elektron-multiplicere CCD (EMCCD) kamera ved en forstørrelse resulterer i en pixel længde ~ 100 nm / pixel. Den TIRF setup er beskrive mere detaljeret i henvisning 26.
  2. Dataindsamling
    1. Sluk eller blokere laserbelysning indtil starten af ​​forsøget. Skift EMCCD kamera gevinst ud for at forhindre beskadigelse af kameraet på grund af overeksponering.
    2. Placer agarose pad sandwich hovedet på mikroskopbordet med celle-dækket side vender nedad, med henblik på at bringe cellen tæt på målet. Sæt fokus på cellerne i transmitteret lysmikroskopi tilstand 28. Optage et billede af hver celle i udsigt under hvidt lys billeddannelse for at lokalisere cellen skitserer før frakobling af hvidt lys.
    3. Beskyt prøven fra laboratoriet omgivende lys.
    4. Hilo excitation tilstand justere vinklen excitationsstrålen til hver maksimal signal-til-støj-forholdet ved kun at oplyse den del af prøven tæt på dækglasset overflade.
      1. For at opnå HILO belysning, fokusere laserstrålen ind i bagsiden brændplan en 100x NA 1.4 mål 28 (højere Numehjælpe- åbninger såsom 1,45 eller 1,49 er også egnede). Ved at flytte fokuseringslinsen vinkelret på bjælken, fokus bevæger bortset fra målet centrum, så at strålen forlader målet med en vinkel.
      2. Juster linsen position for at maksimere signal-støj-forholdet, intracellulær fluorescensintensitet versus ekstracellulære baggrund signal.
    5. Tænd kameraet gevinst og start dataopsamling før der tændes for laseren.
    6. Under optagelse af data, erhverve et hvidt lys billede af hver FOV før eller efter registrering af fluorescensdata; dette medvirker til at identificere cellegrænser i fluorescens kanaler.
    7. For levedygtighed estimering
      1. Brug en lav fluorescens rigt medium i agarose pad at tillade celler at vokse efter elektroporering.
      2. Ækvilibrer mikroskopet til den optimale temperatur for den undersøgte mikroorganisme (37 ° C for E. coli, 29 ° C for S. cerevisiae) Med et objektivt varmelegeme system.
      3. Optag både hvidt lys og fluorescens billeder hver 30 min, og sørg for at forblive på nøjagtig samme synsfelt under hele dataregistrering. En forsinkelse på ≈1 time typisk observeres før cellerne begynder at dele sig.
    8. Tælle antallet af internaliserede biomolekyler per celle
      1. Indstil laser magt til høje værdier (2-3 MW) og lang eksponeringstid (100 ms).
      2. Indstil belysning til vidvinklede tilstand, for at belyse hele cellen.
      3. Optag film som beskrevet i trin 4.2 og sørg for at optage yderligere rammer (50-100 rammer) efter afslutningen af ​​fluorescens fotoblegning.

5. Dataanalyse

  1. Generel analyse
    1. Analyser de optagede billeder og film, både i hvidt lys og fluorescens excitationer, ved hjælp af en imaging software, såsom de frie software ImageJ.
      1. I ImageJ, åbne billeder eller film optaget på mikroskopet (TIF format) i Filer> Åbn> Din fil placering.
      2. For kvalitativt sammenligne fluorescensintensiteter på en computerskærm, skal du sørge for, at alle fluorescens billeder vises med de samme lysstyrke og kontrast i Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast. Juster manuelt eller automatisk indstillingerne for et valgt billede, skal du trykke på "Set" knappen, og vælg "forplante sig til alle de andre billeder" valgmulighed.
      3. Sæt den type oplysninger at udvinde: Analyser> Set Målinger, og vælg (mindst) "område", "Standard afvigelse", "Min & Max grå værdi" og "Mean grå værdi".
      4. At sammenligne celle fluorescensintensiteter, vælge det område s af interesse ved hjælp af Freehand menuknap af ImageJ og udtrække celle intensiteter i Analyser> Measure. Den resulterende tabel indeholder måleværdier ogkan gemmes og / eller kopieres til andre programmer. Den "Mean" værdi svarer til den gennemsnitlige intensitet per pixel i det valgte område, og kan sammenlignes direkte mellem celler eller mellem en celle og baggrunden.
      5. I en elektroporeret celleprøve, er en celle anses indlæses hvis den gennemsnitlige intensitet per pixel er større end den gennemsnitlige intensitet per pixel af den negative kontrol plus 3 gange standardafvigelsen (Av (I indlæst celle)> Av (I -EP) + 3 * Stdafv (I -EP)).
    2. Byg falsk-farvet fluorescens overlay billeder og film med henblik på at vurdere kvaliteten og lastning af prøverne.
      1. I ImageJ, overlay billeder såsom hvidt lys billede og fluorescens billede, der svarer til den samme FOV i Billede> Farver> Flet kanaler. Vælg en farve til hvert billede (C4 (grå) for det hvide lys, C1 (rød) til rød kanal, C2 (grøn for grønne kanal ... osv.).
      2. Checkpå overlejringsbilledet at fluorescensen er placeret i cellen grænser (hvidt lys billede), og at baggrundsfluorescens er lav og homogen (ingen lyspunkter uden for cellen grænser).
      3. Inden vi analyserer et stort antal celler, se kvalitativt billederne svarer til den negative prøve, svarer til de tomme celle billeder og vise meget lavere støtteintensiteter end de elektroporerede celler.
    3. For levedygtighed eksperimenter, tæller manuelt procenterne i forbindelse med opdeling, ikke-delende, men synligt intakt (identiske) og beskadigede (døde) celler fra samme synsfelt vokser over tid (se 4.2.6).
    4. Vurdere levedygtighed mindst 200 celler pr prøve (elektroporeret, negativ kontrol og tomme celler) for at samle nok statistikker.
  2. Cell-baseret analyse
    1. Tælle antallet af internaliserede biomolekyler per celle ved trinvis fotoblegning analyse
      1. Segment celler ved selecting interesseområdet ved hjælp af Freehand menuknap af ImageJ og tegne en figur omkring netop cellen (svarende til celle membranen).
      2. Uddrag cellen intensiteter over tid i Image> Stakke> Plot Z-aksen profil. Den resulterende graf repræsenterer den gennemsnitlige intensitet per pixel for området inden cellegrænsen versus hver film ramme resulterer i en fotoblegning kurven for den specifikke celle. Den indeholder en indledende eksponentiel nedgang af cellen intensitet nå en nedre asymptote (baggrundsfluorescens). Måleværdierne og kan gemmes og / eller kopieres til anden software ved at klikke på "Gem" eller "Kopier".
      3. Kopier og indsæt blegning værdier i et regneark kolonne (I rå).
      4. Beregn den gennemsnitlige autofluorescens per pixel tilbage efter fotoblegning (I auto) som gennemsnittet I- rå værdier opnået i de sidste 50-100 rammer (lavere asymptote).
      5. Subtract den gennemsnitlige autofluorescens per pixel tilbage efter fotoblegning for denne celle fra den oprindelige fotoblegning kurven: Jeg blegning = I rå - I auto.
      6. Brug baseline-korrigeret fotoblegning timetraces (jeg blegning versus ramme) viser mindre end 10 kvantiserede skridt til at vurdere den gennemsnitlige trin størrelse (enstrenget fluorofor intensitet) på grund af blegning af en enkelt fluorophor 26.
      7. Evaluer antallet af internaliserede molekyler per celle ved at dividere den oprindelige basislinie-korrigeret celle intensitet (I blegning ved t = 0) af ensartet fluorofor intensitet.
    2. Encellede FRET effektivitetsgevinster
      1. Mål den gennemsnitlige celler intensitet per pixel i både donor og acceptor emission kanaler (efter donor excitation) og inden for cellen grænse for hver kanal som forklare i 5.1.1.4.
      2. Mål den gennemsnitlige pixel intensitet til baggrunden i hver lmAnnel fra et tomt område af dias.
      3. Fratræk denne baggrund intensitet fra den gennemsnitlige intensitet per pixel. Brug disse baggrundssubtraktion fluorescensintensiteter at beregne FRET for hver celle ved at beregne baggrundssubtraktion acceptor intensitet divideret med total (acceptor + donor) baggrundssubtraktion intensitet ved donor excitation: Jeg acceptor / (jeg acceptor + I donor)
  3. Single-molekyle analyse
    1. Single-molekyle sporing og diffusion analyse
      Bemærk: Protokollen til sporing spredende fluorescerende molekyler i levende celler og vurdere deres tilsyneladende diffusionskoefficient er blevet beskrevet 26, 28.
      1. Kort fortalt passer billederne af enlige fluoroforer i hvert billede af en 2D elliptisk Gauss. Link lokaliseret molekyler til et spor, hvis de optrådte i på hinanden følgende rammer i et vindue på 5-7 pixels (0,48-0,67 um). Brug en MEMORy parameter 1 frame at redegøre for forbigående forsvinden af ​​en fluorofor grund blinke eller ubesvarede lokalisering.
    2. In vivo smFRET analyse
      1. Identificere manuelt lokaliserede molekyler i celler fra film ved at gå gennem en film i ImageJ og identificere immobile (eller temmelig immobile) molekyler i FRET (acceptor) kanal.
      2. Du kan pakke intensiteter i acceptor og donor-kanal, der svarer til en immobil molekyle, skal du vælge området omkring molekylet i hver kanal ved hjælp af "Oval" valgknap af ImageJ (cirkel omkring hver enkelt fluorophor ved hjælp af en -3-pixel radius) og udpakke molekyle intensiteter i Analyser> Measure. Den resulterende tabel indeholder måleværdier og kan gemmes og / eller kopieres til andre programmer.
      3. Beregn baggrundsværdier per kanal fra gennemsnittet pixel intensitet fra en cirkel af samme størrelse i et tomt område af glide over alle rammer analyseres.
      4. Brug baggrundssubtraktion fluorescens værdier i donor- og acceptor-kanaler (efter donor excitation) til fluorescens og FRET tid spor, som i den encellede FRET tilfælde (se 5.2.1.7).
        Bemærk: Automatiseret og robust analyse og algoritmer er blevet beskrevet i Referencer 26-28, 31.

Representative Results

Forberedelse af prøver

De forskellige trin i protokollen præsenteres som diagrammer i figur 1. Som et eksempel, repræsenteret vi lastning af bakterier med dobbelt mærket (donor og acceptor farvestoffer) DNA-fragmenter. Repræsentative resultater for DNA internalisering er vist i figur 2. For hver elektroporeret prøve blev data for tomme celler og ikke-elektroporerede celler også registreres (figur 2). "Tomme celler" svarer til elektrokompetente celler hverken inkuberet med fluorescerende biomolekyler eller elektroporeret; deres intensitet i den fluorescerende kanal afspejler autofluorescens niveau under identiske eksperimentelle betingelser (laser magt, tidsopløsning, temperatur, etc.). "ikke-elektroporeret celler" (også kaldet -EP, dvs minus EP) svarer til en negativ kontrol, hvor elektrokompetente celler er blevet inkuberet med det fluorescerende biomolecESTEMMELSER men ikke elektroporeret. Disse ikke-elektroporeret celler, bør udvise en fluorescens niveau svarende til autofluorescens af de tomme celler og signifikant lavere end fluorescensintensiteten vises af belastede, elektroporerede celler. Dette bekræfter fjernelsen af ​​enhver ikke-internaliserede mærkede biomolekyler, der kunne have klæbet til den ydre cellemembran.

Figur 2
Figur 2: Repræsentative resultater for internalisering af dsDNA mærket med forskellige fluoroforer ved forskellige koncentrationer i bakterier (AE) og gær (F) fv. Hvidt lys, fluorescens og overlay billeder. - / + EP betegner inkubation uden / med elektroporation. Scale barer: 3 um. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, gær. Dette tal er blevet ændret fra henvisning 26. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Tælle antallet af internaliserede biomolekyler per celle

Proceduren til at estimere antallet af internaliserede mærkede biomolekyler per celle ved hjælp af fotoblegning analyse er præsenteret i figur 3 og supplerende Movie 2, sammen med repræsentative resultater opnået med forskellige koncentrationer af mærket DNA. Cell loading effektivitetsforbedringer med det oprindelige beløb af rugede mærket DNA, så brugeren kan tune antallet af mærkede molekyler pr celle fra et "single-molekyle" niveau (<10, Supplerende Movie 2B) til en "ensemble" niveau (> 10 , Supplerende Movie 2A). En robust måde at estimere procentdelen af ​​lastede celler er to tælle antallet af elektroporerede celler udviser en celle intensitet over den gennemsnitlige celle intensiteten af ikke-elektroporeret celler plus 3 gange deres standardafvigelse (dvs. Av (I-EP) + 3 * Stdafv (I-EP), hvor Av = gennemsnit I = intensitet per pixel, Std. Dev. = standardafvigelse og -EP = ikke-elektroporeret) som vist i figur 3.

Figur 3
Figur 3:. Tælle antallet af internaliserede molekyler under anvendelse fotoblegning analyse (A) Single-celle fotoblegning analyse. Eksempler på fluorescens intensitet timetraces (blå: rådata, rød: fit; åbninger: WL og fluorescensbilleder af E. coli fyldt med ATTO647N-mærket dsDNA før og efter blegning). Top: enkelt trin blegning begivenhed. I midten: celle, der indeholder ± 3 molekyler viser blegningog blinker. Nederst: celle indeholdende> 10 trin svarende til mindst 10 molekyler (B) Histogram af single-trinhøjde intensiteter fra en automatiseret trin-fitting algoritmen fra 57 celler indeholdende mindre end 6 skelnelige trin.. Single-Gauss fit er centreret ved 11 ± 3 au, svarende til en enhedsstat fluorofor intensitet på 8100 fotoner per sekund. Stjernen markerer bin indsamle alle trin højder over eller lig med 50 au (C) Histogram af internaliserede molekyler per celle elektroporeret med forskellige mængder af ATTO647N dsDNA, opgjort efter dividere den indledende fluorescensintensitet af enhedskarakter fluorofor intensitet. Top til bund: tomme celler (dvs. ikke inkuberet med fluorescerende molekyler og ikke elektroporerede), ikke-elektroporeret (men inkuberet med fluorescerende molekyler, opkaldt -EP), og elektroporerede celler inkuberet med 10 og 100 pmol dsDNA (opkaldt + EP). Tomme og ikke-elektroporerede celler svarertil autofluorescens, mens elektroporerede celler viser en bred fordeling af internaliserede molekyler, med en højere andel af højt belastede celler ved 100 pmol (≥ 4 molekyler, se stjerne-mærket bin). Internalisering effektivitet (fraktion af celler med Int.> Betyde + 3x Std. Dev. Af ikke -EP prøve) for de 10 og 100 pmol prøver var 94% og 90%, hhv. Gennemsnitlig antal internaliserede molekyler per celle: 121 ± 106 molekyler til 10 pmol dsDNA og 176 ± 187 molekyler til 100 pmol dsDNA. Indstillinger: 100 ms eksponering, Widefield belysning. Scale barer: 1 um. Dette tal er blevet ændret fra henvisning 26. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Cell lastning og levedygtighed

Ud over at ændre mængden af ​​mærkede biomolekyler tilsat til cellerne forud for elektroporering, denBrugeren kan indstille mængden af internaliseret molekyler ved at vælge forskellige feltstyrker under elektroporering (figur 4, Supplerende Movie 1). Højere feltstyrker medføre større internalisering effektiviteten, men fører til et mindre fald på cellelevedygtighed. For protein internalisering, kan anvendelse af et filtreringstrin hjælpe med at fjerne ikke-internaliserede mærkede proteiner (se 3.3.3.1.1). I sådanne tilfælde celle filtrering sikrer, at observerede fluorescerende proteiner faktisk internaliseres inden i bakterielle cytoplasma; vi dog bemærke, at filtrering også har en negativ indvirkning på cellernes levedygtighed (for flere detaljer, se ref 22).

Figur 4
Figur 4: Påvirkning af elektroporation spænding på celle lastning og levedygtighed (A) Bar diagram repræsenterer effekten af elektroporation feltstyrke på lastning effic.iency (røde søjler) og levedygtighed af cellerne (grønne søjler). 84 ± 8% af den ikke-elektroporeret celle (0 kV / cm) kløft efter 1 time på en agarose pad ved 37 ° C. Under de samme betingelser, 78 ± 3% og 49 ± 3% af cellerne elektroporeret ved 0,9 kV / cm og 1,8 kV / cm henholdsvis opdele efter 1 time. For lastning effektivitet, er 73 ± 8% af cellerne indlæst på 0,9 kV / cm, mens 92 ± 6% af cellerne er indlæst på 1,8 kV / cm. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen beregnet ud fra tre uafhængige målinger; mere end 200 celler blev analyseret for hver prøve, og hver gentagelse. Belastningseffektivitet stiger samlet med elektroporation spænding til den lille skade for cellelevedygtighed. (B) Cell-baserede fluorescens målinger over flere generationer viser, at den samlede fluorescensintensitet deles ligeligt mellem de to datterceller. Celle 1 og 2 henviser til celleantallet i hvidt lys billede (til venstre) og fluorescens billede ved t = 0. Scalebar: 1 um). Dette tal er blevet ændret fra henvisning 26.

Protein internalisering

Repræsentative resultater for protein internalisering er i figur 5A & B. Det er særligt vigtigt at fjerne så meget af den resterende frie (uomsat) farvestof fra proteinprøven som muligt før elektroporering. I eksemplerne i figurerne 5A & B, Cy3b-mærkede Klenow Fragment prøve (Cy3b-KF, hvor KF er Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I, 66 kDa) kun indeholder 1% fri farvestof; sådan farvestof bidrag til den samlede celle belastning er ubetydelig. Sammenligninger af den elektroporerede prøve af interesse med både de ikke-elektroporeret celler (inkuberet med den samme mængde mærket protein) samt celler elektroporeret med den ækvivalente mængde af fri farvestof udgør to nødvendige kontrol for at sikre, at de observerede fluorescerende molekylerer faktisk internaliseres mærkede proteiner.

Figur 5
Figur 5: Protein internalisering i levende bakterier (A) Repræsentant fluorescens felt synspunkter overlay.. Celler elektroporeret på 1,4 kV spænding med 50 pmol RNAP ω subunit fra et protein stamopløsning, der indeholdt kun 1% fri Cy3b farvestof. Ikke-elektroporeret (non -EP) og tomme celler er defineret som tidligere. Fri farvestof blev internaliseret i samme koncentration som i RNAP ω elektroporeret prøve. Imaging i bredt tilstand, 532-nm excitation ved 1 mW, 50 ms eksponering. (B) Fordeling af ukorrigerede celle-gennemsnit intensiteter for prøver i (A), givet i andel af den samlede celletal. Mere end 400 celler pr prøve blev segmenteret. Dette tal er blevet ændret fra henvisning 22. (C) internalisering af unlaBeled T7 RNA-polymerase (T7 RNAP, 98 kDa) i elektrokompetente DH5a bærer pRSET-EmGFP plasmid, der koder Emerald GFP (EmGFP) under kontrol af en T7-promotor. Venstre: Skematisk assay. I midten: fluorescens overlay. Højre: histogrammer af cellebaserede fluorescensintensiteter for ikke-elektroporeret prøve (øverst) og cellerne blev inkuberet og elektroporeret med T7 RNAP (nederst); ca. 11% af den elektroporerede celler viser høj fluorescens intensitet (fraktion af celler med Int.> betyde + 3x Std. Dev. ikke -EP prøve) indikerer ekspression af EmGFP. Stjernerne viser placeringer samler alle de intensiteter over eller lig med 1.100 au Målestok: 3 um. Dette tal er blevet ændret fra henvisning 26.

Figur 5C viser en anden anvendelse af protein elektroporation. Her elektroporeres protein er umærket, men dens internalisering udløser en observerbar fluorescerende respons. Dette eksperiment bekræfter præsence og funktionaliteten af ​​elektroporerede proteiner i cellecytoplasmaet. Unlabeled T7 RNA-polymerase (98 kDa) blev internaliseret i E. coli-stamme DH5a indeholdende et plasmid, der koder for fluorescerende protein EmGFP under kontrol af en T7-promotor 26. Da genet for T7 RNA-polymerase er fraværende i DH5a, EmGFP ekspression i vore forsøg kræver, at funktionel T7-RNA-polymerase, indføres i celler via elektroporering (figur 5C). Efter elektroporering med 1 pmol T7 RNAP,> 11% af cellerne (blå bar, figur 5C) udviste fluorescens højere end den negative kontrol (inkuberet med den samme mængde af T7 RNAP, men ikke elektroporeret). Dette resultat fastslår, at en del af de T7 RNAP molekylerne internaliseret ved elektroporation bevarer deres integritet in vivo og kan udføre deres tilsigtede funktioner i cellen cytoplasma.

In vivo FRET på enkelt-molekyleog encellede niveauer

Endelig internalisering og analyse af dobbelt mærkede arter levende bakterier vist i figur 6 og Supplerende Movie 3. Som det fluorescerende protein fusioner er ikke ideel til in vivo smFRET undersøgelser, evnen til at levere dobbelt mærkede biomolekyler i levende celler ved hjælp af elektroporation er en af de store aktiver i denne metode. figur 6A præsenterer encellede FRET analyse af bakterier lastet med forskellige FRET DNA-standarder (ved hjælp Cy3B og Atto647N fluoroforer som donor-acceptor FRET par). Celler elektroporeret med 20 pmol af tre korte dobbelt-mærkede dsDNA FRET standarder med tilsyneladende FRET effektivitetsgevinster (E *) på 0,17, 0,48 og 0,86 in vitro (tidligere bestemt 26). Alle DNA'er indtaste celler effektivt (figur 6A, venstre) og hovedtoppen af hver enkelt celle E * fordeling stemmer godt overens med in vitro resultater (figur 6AHøjre). I mellemrunder høj FRET prøver cellepopulationer med lavere E * end forventet observeres, formentlig på grund af en kombination af acceptor blegning og fotofysiske inaktivitet, variabel celle belastning (således variable signal-til-støj-forhold), og DNA-nedbrydning .

Figur 6
Figur 6:.. Repræsentative resultater for encellede og single-molekyle FRET observation i levende bakterier Ensemble og smFRET studier i enkelte bakterier (A) Analyse af celler fyldt med 20 pmol hver af tre DNA FRET standarder udviser lav (~ 0,17), mellemprodukt (~ 0,48) og høj (~ 0,86) FRET (som målt ved hjælp af in vitro enkelt molekyle målinger se ref 26). Venstre: hvidt lys og grøn / rød (FRET) fluorescens overlay billeder (Skala bar: 3 um). Eksempler på FRET værdier fra forskellige celler er angivet (hvid). Rig ht (top til bund):. ukorrigerede cellebaseret FRET (E *) histogrammer for donor kun (mørkegrøn), lav (lys grøn), intermediære (gul) og høj (rød) FRET DNA standarder (B-D) In vivo smFRET. Celler er fyldt med 0,25 pmol mellemliggende FRET DNA (panel B), 0,25 pmol høj FRET DNA (panel C) og 5 pmol dobbelt-mærket KF (panel D). Venstre kolonne: grøn / rød fluorescens overlejring af enkelt ramme før og efter acceptor fotoblegning. Midterste kolonne: tid spor svarende til molekylet i den gule cirkel. FRET effektivitetsgevinster, donor emissionsintensiteter og acceptor emissionsintensiteter vises i blå, grøn og rød, hhv. Højre kolonne: FRET histogrammer af donor kun molekyler (grøn) og donor-acceptor molekyler (gul, rød og grå) fra 20 tid spor for hver prøve. Scale barer: 3 um for A, 1 um for B-D. Dette tal er blevet ændret fra henvisning 26.208fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

At observere smFRET in vivo for DNA eller protein prøver, lave beløb (0,25 pmol) af middellangt- og high-FRET DNA-standarder (figur 6B, C) ​​eller 5 pmol dobbelt-mærket KF (Alexa647 / Cy3B fluoroforer som FRET par, Figur 6D) er elektroporeret ind i E. coli. Sådanne koncentrationer førte til mange celler fyldt med par (n = 1-10) mærkede molekyler, der muliggør direkte lokalisering, sporing og FRET overvågning af enkelte molekyler. Nogle molekyler diffunderer frit, mens andre synes immobile eller diffus langsomt (Supplerende Movie 3). Timetraces af immobiliserede dobbelt-mærkede biomolekyler (figur 6, midten) sidste i 1 til 30 s og vise kendetegnende for smFRET: anticorrelated ændringer i donor og acceptor fluorescens upon acceptor blegning (f.eks t ~ 16 sek, figur 6B, midterste ), efterfulgt af enkelt-trins donor blegning (for eksempel t ~; 19 sek figur 6B). FRET fordelinger fra sådanne timetraces (figur 6, højre) resulterer i en gennemsnitlig værdi, der er i fremragende aftale med offentliggjort in vitro-undersøgelser 26,31,32. Disse resultater indføre muligheden for kvantitative smFRET undersøgelser af internaliserede DNA og proteiner, og foreslå, at proteiner er ubeskadigede og struktur ved elektroporation og internalisering (som støttes af T7 RNAP internalisering eksperimenter).

Supplerende Movie 1:. Cellelevedygtighed Venstre: hvidt lys billeder. Til højre: fluorescensbilleder. Animerede GIF animeret viser opdelingen efter elektroporation (1,8 kV / cm) af bakterier lastet med 10 pmol Atto647 mærket DNA. Den samlede tilsyneladende fald i fluorescens skyldes fortynding af mærket DNA ved celledeling og også delvist til fotoblegning, der forekommer under hvermåling.

Supplerende Movie 2: Cellebaserede fotoblegning undersøgelser A.. Et repræsentativt eksempel på en tungt lastet celle (indeholdende> 100 Atto647N-mærkede DNA-molekyler). Øverst til venstre, hvidt lys billede af cellen af ​​interesse (rød rektangel). Øverst til højre, film af de belastede celler viser deres fluorescens henfald over adskillige minutter. Bottom, tid spor af den samlede fluorescensintensitet henfald af cellen af ​​interesse. Organiske fluoroforer kan udstille fotoblegning levetider 2 størrelsesordener højere end rammeprogrammer (her, ~ 41 sek for Atto647N). B. Et repræsentativt eksempel på en fyldt med mindre end 10 mærkede molekyler (3 i dette tilfælde) celle. Top, samme som panel A. Bottom, tid spor af den samlede fluorescensintensitet af cellen af ​​interesse viser enkelt trin blegning og / eller blinker svarende til enkelt organiske fluoroforer. Den gennemsnitlige højde af disse trin svarer til single-molekylet enhedsstat intensitet (her ~12 AU) anvendes til at vurdere det oprindelige antal internaliserede molekyler per celle. Film under kontinuerlig rød laser excitation ved 300 pW magt og 100 ms per frame.

Supplerende Movie 3: Jeg n vivo enkelt molekyle FRET Top:. Celler fyldt med 0,25 pmol høj FRET DNA (som i figur 6C) løbende overvåges ved 50 ms per frame under nTIRF belysning ved hjælp af 1 mW grøn (532 nm) laser. Hver ramme er en grøn / rød (FRET) fluorescens overlay på hver kanal. Sprede og immobile rød (intakt) og grøn (enkelt aktiv etiket) DNA-molekyler kan observeres. Nederst: Time spor svarende til molekylet i den gule cirkel. FRET effektivitetsgevinster, donor emissionsintensiteter og acceptor emissionsintensiteter vises i blå, grøn og rød, hhv. Anti-korreleret acceptor blegning begivenhed (rød-til-grønne overgange) svarer til undertegnelse af single-molekyle FRET.

Discussion

Mange parametre kan varieres under celle elektroporation og dataopsamling afhængig biologiske system af interesse og den præcise karakter af forsøget (celle-niveau eller single-molekyle analyse). For eksempel, når elektroporering DNA i bakterier, 0,25-5 pmol mærket dsDNA fragmenter fører til en lav internalisering effektivitet, der muliggør direkte påvisning single-molekyle (dvs.., Uden behov for fotoblegning forhånd). Over 5 pmol dsDNA, celler tendens til at være tungt lastet, en ordning bedre egnet til encellede analyse. Alle mærkede DNA'er bør også være tidligere geloprenset for at fjerne ethvert spor af frit farvestof (ikke-reageret fluorofor) fra DNA stamopløsning. Desuden potentielle problemer med DNA-nedbrydning, især for smFRET eksperimenter, kan løses ved anvendelse af DNA'er med unaturlige nukleinsyrer eller motiver, der beskytter exonuklease-tilgængelige termini såsom hairpin-loops.

En anden adjustable parameter i elektroporation er feltstyrken påføres under elektroporation. Lav feltstyrke (~ 1 kV / cm) vil føre til en lav belastningseffektivitet egnet til enkelt-molekyle studier. Højere feltstyrker (op til 1,8 kV / cm) vil øge lastning effektivitet; Imidlertid er der en omvendt korrelation mellem feltstyrke og cellelevedygtighed efter elektroporation (se figur 4). For reference, en normal feltstyrke anvendes for bakterier og gær elektroporation er ~ 1,5 kV / cm. Tidskonstanten, repræsenterer længden af ​​dette henfald er en bekvem parameter til følge, eftersom tidskonstanten dråber, så snart nogen gnistdannelse fænomen forekommer i kuvetten. Under normale indstillinger bør tidskonstanten være større end 4 ms; lavere værdier vil føre til lav belastningseffektivitet eller endog ikke-loaded beskadigede celler. De fleste electroporators tilbyde andre frihedsgrader (såsom "puls trunkering" eller "puls form"), som kan ændres til at tune bådecelle lastning og levedygtighed. Vi anvendte denne fremgangsmåde for både bakterier og gær, men lignende procedurer bør også tillade internalisering af mærkede biomolekyler i pattedyrceller ved hjælp af passende elektroporator indstillinger da deres membran er faktisk mindre kompleks (enkelt lipiddobbeltlag), og da elektroporation er allerede blevet anvendt med sådanne celler 21.

Når internalisere mærkede proteiner, skal fjernes fra den kendte elektroporering mærkede protein stamopløsning alle frie farvestof. Free farvestofmolekyler, på grund af deres mindre størrelse, kan internaliseres fortrinsvis over proteiner af interesse, og er vanskelige at skelne under dataanalyse (trods deres forventede hurtigere diffusion). Som en vejledning, for en prøve af økologisk mærkede protein at være egnet til elektroporation, bør mængden af tilbageværende fri farvestof være under 2% (påvist ved hjælp af fluorescerende scanning af en SDS-PAGE) 22. Denne proces er særlig vigtigt,som nogle molekyler kan holde sig til de ydre membraner af elektroporerede bakterier eller gær. I denne forbindelse bør den negative kontrolprøve vise fluorescensintensitet per celle klart lavere end elektroporerede celler, ideelt så lavt som autofluorescens niveau af tomme celler (celler, som ikke er blevet inkuberet med eventuelle fluorescensmærkede biomolekyler eller elektroporeret, figur 2).

Som med dsDNA er internalisering effektivitet mærkede proteiner bundet til mængden af ​​biomolekyler tilsat til cellerne før elektroporering. Men andre parametre, såsom størrelse og ladning, spiller en rolle i internalisering. Små proteiner udviser høje internalisering effektiviteten, mens større proteiner (op til 98 kDa) med held kan internaliseres, men med lavere effektivitet (figur 5) 26. Det isoelektriske punkt af proteinet potentielle vekselvirkninger med cellemembranen og andre fysisk-kemiske parametre ogsåindflydelse celle loading under elektroporering. Som et resultat, brugerne nødt til at optimere eksperimenter for deres eget system, vel vidende, at en høj initial koncentration af mærket protein (> 50 uM) vil give den bedste chance for vellykket belastning. Elektroporation tilbyder også et nyt redskab til at forstyrre og analysere cellulær funktion ved at indføre proteiner og andre biomolekyler i celler (enten mærket eller umærket). T7 RNA-polymerase eksperimenter (figur 5C) forelægge en sådant eksempel på et eksperiment, hvor vi kan indføre et biomolekyle, der kan ændre genekspression in vivo ved hjælp af elektroporering.

Ved udførelse af enkelt-molekyle fluorescens eksperimenter er TIR belysning sædvanligvis begunstiget i forhold til andre illumination tilstande, fordi den giver det bedste signal-til-støj-forholdet af spændende kun fluoroforer inden for en tynd sektion over dækglasset overflade (~ 100 nm). Men imaging mærkede biomolekyler spredende inde levende mikroorganismer kan rekoret dybere belysning (op til 0,8 um for E. coli). Dybere belysning opnås i Hilo tilstand, mens et højt signal-til-støjforhold opretholdes. På den anden side, bredt felt billeddannelse er særlig vigtig for trinvis fotoblegning analyse, hvor brugeren at anslå antallet af internaliserede molekyler ved fotoblegning en hel loaded celle med høj laser power og dividere den første celle fluorescensintensitet af ensartet intensitet produceret af et enkelt molekyle (enkelt fotoblegning trin, figur 3). Vidvinklet billeddannelse er også påkrævet til langsigtet molekyle sporing for at lokalisere de spredende molekyler af interesse, selv om deres baner dækker cellevolumen hele.

I denne protokol, præsenterer vi, hvordan elektroporation, en standard teknik til biologer og biokemikere til at levere nukleinsyrer i celler, er en simpel metode til at levere fluorescerende biomolekyler i forskellige celletyper. Ther roman, high-throughput teknik giver et unikt værktøj til at observere mærkede molekyler i deres naturlige miljø. Derudover biomolekyler mærket med fluoroforer dækker en bred vifte af bølgelængder, elektroporation kan levere molekyler modificeret med mange kemiske grupper, såsom unaturlige nukleotider og aminosyrer, metalchelatorer, tværbindere og anbringelse i bur grupper. Hvis det biologiske system af interesse er ikke afgørende for udvikling cellen, kan det gen, der koder for målproteinet også blive slettet (eller bankede-down), der sikrer, at proteinerne observeret efter internalisering repræsenterer alle (eller de fleste) af det intracellulære protein pool . I det væsentlige, kan elektroporation "transplantation" fleksibiliteten af in vitro biokonjugater i levende celler og derfor en fordel indsats i syntetisk biologi, systembiologi og in vivo enkelt molekyle detektion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells Invitrogen 11319-019 or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.
EZ Rich Defined Madia Teknova M2105 low fluorescence rich media
MicroPulser Electroporation Apparatus  Biorad 165-2100 or any classical electroporator for microorganism transformation
Certified Molecular Biology agarose Biorad 161-3100 low fluorescence agarose for agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 thickness Menzel BB024060SC remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h
Single-molecule fluorescence microscope Home-built described in REFs
Localization software Custom-written, available online MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. 
Tracking software Available online MATLAB implementation by Blair and Dufresne. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Leake, M. C., et al. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  3. Taniguchi, Y., Kawakami, M. Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy. Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).
  4. Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).
  5. Lee, J. H., et al. Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ. Science. 343, 1360-1363 (2014).
  6. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  7. Sauer, M. Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact. J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).
  9. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Meth. 2, 905-909 (2005).
  10. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).
  11. Jaitin, D. A., et al. Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types. Science. 343, 776-779 (2014).
  12. Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biol. 14, R124 (2013).
  13. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
  14. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).
  15. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  16. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).
  17. Clarke, M. S., McNeil, P. L. Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol. J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).
  19. Taylor, L. S. Electromagnetic syringe. IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).
  20. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).
  21. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  22. Sustarsic, M., et al. Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation. Histochem Cell Biol. , (2014).
  23. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).
  24. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 000, 1-5 (2014).
  25. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).
  26. Crawford, R., et al. Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules. Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).
  27. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).
  28. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. J Vis Exp. , (2014).
  29. Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods. Phys Biol. 7, 031001 (2010).
  30. Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. Perspective - Living cells as test tubes. Science. 312, 228-230 (2006).
  31. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).
  32. Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature communications. 4, 2131 (2013).

Tags

Mikrobiologi elektroporering fluorescens FRET in vivo enkelt molekyle Imaging bakterier Escherichia coli gær internalisering mærkede DNA mærkede proteiner
Internalisering og Observation af fluorescerende biomolekyler i levende mikroorganismer via Elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aigrain, L., Sustarsic, M.,… More

Aigrain, L., Sustarsic, M., Crawford, R., Plochowietz, A., Kapanidis, A. N. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (96), e52208, doi:10.3791/52208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter