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Biology

माउस कंकाल की मांसपेशी में जांच और डीएनए की क्षति के विश्लेषण Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TDT) dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL के) dUTP को तीन संलग्न करने के लिए TDT एंजाइम का उपयोग करने की प्रक्रिया है 'डबल और एकल असहाय डीएनए 12,23 टूट के समाप्त होता है। Apoptosis और डीएनए की क्षति का पता लगाने के लिए TUNEL के विधि प्रथम Gavrieli एट अल। 1,12,24 से 20 साल पहले सूचना मिली थी। इसके बाद से मूल्यांकन किया और विभिन्न ऊतक तैयारी 7,23,27,40 में अनुकूलित किया गया है। TUNEL के न्यूरॉन्स 6,14,29 और cardiomyocytes 43,44 के ischemia के प्रेरित कोशिका मृत्यु, excitotoxic neuronal सेल मौत 30,31 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और गठिया के इलाज 39 में एक बायोमार्कर के रूप में की गई है। यह भी विभिन्न मानव के कैंसर 2,3,15,32,37,38,42 में एक शकुन कारक है और ट्यूमर सेल मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

वैकल्पिक तरीकों का डीएनए की क्षति और कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए मौजूद हैं, लेकिन वे तकनीकी चुनौतियों और निरंतर है। दक्षिणी सोख्ता quantif करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैY डीएनए पूरे ऊतक lysates 7,9-11 में नुकसान है, लेकिन इस विधि सेलुलर स्तर के संकल्प प्रदान करते हैं और जिसका अंदाजा लगाना मुश्किल है नहीं करता है। धूमकेतु परख कोशिकाओं 4,20,28,36 से संरक्षित नाभिक निकालने की आवश्यकता है कि एक वैकल्पिक सेल आधारित पद्धति है। धूमकेतु परख सुसंस्कृत अलग कक्षों पर अच्छी तरह से काम करता है, यह कंकाल की मांसपेशी ऊतक 8,21 से बरकरार नाभिक तैयार करने के लिए और अधिक कठिन है। दक्षिणी धब्बा साथ के रूप में, धूमकेतु परख एक पूरे मांसपेशी ऊतक homogenate से सेल प्रकार विशिष्ट जानकारी प्रदान नहीं करता है। TUNEL के विधि करने के लिए एक अन्य विकल्प के एकल असहाय डीएनए 25,33,41 के खिलाफ या डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया और कोशिका मृत्यु रास्ते में (जैसे p53, H2AX, और caspases) 13,17,22,40 भाग लेने कि प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunohistochemistry है। इस तरह की एंटीबॉडी आधारित विधियों एक उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात उपज के लिए एंटीबॉडी का पूरी तरह से लक्षण वर्णन और उत्कृष्ट एंटीबॉडी विशिष्टता की आवश्यकता होती है। यहां तक ​​कि जब कल्पनाific एंटीबॉडी वे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं 34,35 के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन की विकृतीकरण आवश्यकता हो सकती है, मौजूद है। हम यहाँ पर चर्चा के रूप में, अस्वीकार्य उच्च autofluorescence में मांसपेशियों के ऊतकों परिणामों में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति। वैकल्पिक तरीकों के विपरीत, TUNEL के सरल सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, अच्छा ऊतक पैठ प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है कि, और सेलुलर स्तर के संकल्प के साथ परीक्षण किया जा सकता है कि एक उच्च संकेत और कम पृष्ठभूमि, उत्कृष्ट विशिष्टता के साथ डीएनए की क्षति का पता लगाने को प्राप्त होता है। वैकल्पिक तरीकों आमतौर पर रातोंरात incubations की आवश्यकता होती है, जबकि इसके अलावा, TUNEL के विधि, को पूरा करने के बारे में चार घंटे लगते हैं।

हम Hsieh ली और उनके सहयोगियों ने 16 से उत्पन्न किया गया है कि रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के 10 में से एक माउस मॉडल में कंकाल की मांसपेशी कोशिका मृत्यु का अध्ययन। मांसपेशी में apoptotic कोशिकाओं यों, हम विभिन्न skele भर में मजबूती के साथ काम करता है कि ऊतक तैयारी, धुंधला, और quantitation का एक तरीका विकसित किया हैचूहों में विभिन्न विकासात्मक समय बिंदुओं पर ताल मांसपेशी समूहों। हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TUNEL के लेबलिंग किट और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। हम भी सफलतापूर्वक रीढ़ की हड्डी 10 में Immunofluorescent धुंधला के साथ संयोजन में TUNEL के परख का इस्तेमाल किया है।

यहाँ वर्णित विधि कंकाल की मांसपेशी में ऊतक विकृति, रोग के तंत्र, उम्र बढ़ने के तंत्र, और विकास (पूर्व और प्रसवोत्तर) कोशिका मृत्यु का आकलन करना चाहते हैं जो जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होते हैं। TUNEL के तकनीक कोशिकाओं का केवल एक सबसेट प्रभावित और सेलुलर स्तर संकल्प आवश्यक है जहां मॉडल प्रणाली में डीएनए की क्षति और मरम्मत और कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

यह वीडियो विच्छेदन, ऊतक प्रसंस्करण, सेक्शनिंग, और माउस कंकाल की मांसपेशी की प्रतिदीप्ति आधारित TUNEL के लेबलिंग का वर्णन है। यह भी अर्द्ध स्वचालित TUNEL के संकेत quantitation की एक विधि का वर्णन है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं स्वास्थ्य 26 के राष्ट्रीय संस्थान की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार किए गए। प्रोटोकॉल (MO13M391) जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नवजात माउस बलिदान, विच्छेदन, और फिक्सेशन

  1. सीओ 2 साँस लेना द्वारा एक नवजात माउस बलिदान।
  2. इसके तत्काल बाद घुटने के ऊपर hindlimb काट दिया। लगभग प्रसव के बाद 7 दिन तक, पैर की हड्डियों एक cryostat पर बाद में खंड के लिए बड़ी प्रयोगशाला कैंची या तेज ब्लेड के साथ के माध्यम से कटौती करने के लिए काफी नरम हैं और।
  3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में बर्फ के ठंडे 4% paraformaldehyde के 10 एमएल में hindlimb रखें।
  4. विसर्जन 4 डिग्री सेल्सियस पर 4-24 घंटे के लिए paraformaldehyde में hindlimb तय कर लो। भ्रूण ऊतक में ही कई घंटे की आवश्यकता हैनियतन के एस।
    1. इस TUNEL के परख की क्षमता को कम कर सकते हैं, के रूप में 24 घंटा से अधिक समय निर्धारण करने से बचें।
  5. Sucrose के समाधान में डुबो कर hindlimb Cryoprotect।
    1. वही 15 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस में 10% sucrose के लिए paraformaldehyde बदलें, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    2. पीबीएस में 30% sucrose के लिए बदलें, 4 डिग्री सेल्सियस पर या ट्यूब के नीचे करने hindlimb डूब तक रातोंरात सेते हैं। ऊतक सूक्रोज बाँझ फ़िल्टर कर दिया गया है, बशर्ते कि एक लंबी अवधि के लिए 30% sucrose में छोड़ा जा सकता है।

2. ऊतक एम्बेडिंग

  1. मध्यम embedding के साथ एक लेबल embedding ढालना आधे मार्ग में भरें।
  2. मोल्ड के एक दीवार के लिए संभव के रूप में बंद कटौती पक्ष के साथ, embedding मध्यम के शीर्ष पर hindlimb रखें। मोल्ड के बाहर पर hindlimb के उन्मुखीकरण के निशान।
    1. कई hindlimbs शामिल करें और एक ही ब्लॉक में कटौती। हालांकि, यह सब हीन है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैब्लॉक में dlimbs अंग की धुरी के साथ स्तरों मिलान में वर्गों को पाने के लिए एक दूसरे के समानांतर उन्मुख होते हैं।
  3. मध्यम embedding साथ hindlimbs कवर। मध्यम डालने का कार्य करते हुए hindlimbs बदलाव करते हैं, तो कुंद इत्तला दे दी संदंश या एक दंर्तखोदनी के साथ फिर से उन्हें पूरबी।
  4. कम से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊतक घुसपैठ करने के लिए मध्यम एम्बेड करने दें।
  5. सीधे सूखी बर्फ पर या सूखी बर्फ पर isopentane में जगह नए नए साँचे मध्यम embedding फ्रीज करने के लिए। सभी समय पर नए साँचे स्तर पर रखने और एम्बेडेड ऊतक के स्थानांतरण से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. कई महीने तक के लिए, कटौती करने के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए नए साँचे रखें।

3. Cryosectioning एंबेडेड अंग

  1. -20 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट cryostat के चैम्बर तापमान, -18 डिग्री सेल्सियस के लिए वस्तु तापमान; आवश्यक के रूप में नीचे वस्तु तापमान को समायोजित।
  2. कम से कम 30 मिनट के लिए cryostat के कक्ष के अंदर ऊतक ब्लॉक संतुलित करना। सही ब्लॉक अस्थायीerature खंड गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. 10 माइक्रोन या उससे कम की मोटाई पर अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती। मोटा वर्गों पूरी तरह से TUNEL के अभिकर्मकों द्वारा प्रवेश नहीं किया जाएगा। विरोधी रोल थाली, ब्लेड, और ब्लेड कोण का प्रयोग करें (आमतौर पर 5 डिग्री) cryostat के लिए सिफारिश की।
  4. कमरे के तापमान पर gelatin- या vectabond लेपित गिलास स्लाइड पर वर्गों लीजिए। सूखी बर्फ पर एक स्लाइड बॉक्स में तुरंत रखें। हाथ की पहुंच के भीतर cryostat के पास रखा सूखी बर्फ के साथ एक अलग कंटेनर में स्लाइड बॉक्स रखें।
    1. 100-200 माइक्रोन लंघन, अंग की लंबी अक्ष के माध्यम से अनुप्रस्थ धारावाहिक वर्गों में कटौती। प्रत्येक धारावाहिक के स्तर पर कम से कम 3 आसन्न वर्गों लीजिए।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर hindlimb वर्गों पर 4. TUNEL के परख (कमरे के तापमान पर सभी चरणों का उल्लेख किया है, जब तक)

  1. कमरे के तापमान और सूखी रातोंरात करने के लिए या सप्ताहांत में वर्गों के साथ स्लाइड गला लें।
  2. Immersin द्वारा वर्गों rehydrateएक coplin जार में 2 एक्स 10 मिनट के लिए पीबीएस में जी स्लाइड। एक प्रयोगशाला के साथ सूखी संभव के रूप में खंड के आसपास के रूप में ज्यादा तरल को हटाने, पोंछे।
  3. Permeabilize वर्गों
    1. एक गैर प्रोटियोलिटिक, सैपोनिन आधारित वाणिज्यिक अभिकर्मक या 0.5% Tween20 और 0.05% पीबीएस में ट्राइटन X100 के लिए या तो उपयोग करें।
    2. एक आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड रखें। अभी पर्याप्त पानी बॉक्स के नीचे कवर करने के लिए जोड़ा गया है के साथ एक सरल आर्द्रता चैम्बर, एक तंग ढक्कन के साथ एक खाली विंदुक टिप बॉक्स है।
    3. अनुभाग को कवर करने के लिए स्लाइड पर पिपेट पर्याप्त अभिकर्मक (50 μl नवजात माउस अंगों के लिए पर्याप्त है)। दोहराया आंदोलन स्लाइड लिफ्ट बंद करने के लिए खंड कारण हो सकता है, के रूप में खंड पर सीधे पिपेट मत करो।
    4. कुंद इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, अभिकर्मक की बूंद बाहर प्रसार करने के लिए खंड के शीर्ष पर parafilm का एक छोटा सा आयत जगह है और पूरी तरह से अनुभाग को कवर किया। किसी भी बुलबुले parafilm के तहत फार्म, तो धीरे सूखी, यह लिफ्ट बंद है, और पुन: लागू।
    5. Permeabili के साथ स्लाइड्स सेतेएक कवर आर्द्रता चैम्बर में एक घंटे के लिए zation अभिकर्मक। वर्गों स्लाइड से लिफ्ट बंद करने के लिए शुरू करते हैं, तो permeabilization के समय 30 मिनट तक कम किया जा सकता है।
    6. एक coplin जार 2 एक्स 5 मिनट में पीबीएस में स्लाइड्स धो लें। parafilm के आयतों ऊपर फ्लोट चाहिए और फिर हटा दिया है और खारिज कर दिया जा सकता है।
    7. एक प्रयोगशाला का प्रयोग, संभव के रूप में वर्गों के आसपास के रूप में ज्यादा तरल सूखी साफ कर लें।
  4. TDT की मध्यस्थता डीएनए को तोड़ने लेबलिंग
    1. (50 μl नवजात माउस अंगों के लिए पर्याप्त है) ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए स्लाइड पर 1x TDT लेबलिंग बफर, पिपेट पर्याप्त लेबलिंग बफर बनाने के लिए किट निर्देशों का पालन करें। 5 मिनट के लिए नमी कक्ष में सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक coplin जार में TDT लेबलिंग बफर में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
    2. TDT लेबलिंग मिश्रण बनाने के लिए किट निर्देशों का पालन करें। किट कोबाल्ट, मैग्नीशियम और मैंगनीज फैटायनों शामिल हैं; मैंगनीज कटियन कंकाल की मांसपेशी, तंत्रिका तंत्र Tiss सहित, ऊतकों की एक किस्म पर अच्छी तरह से काम करता हैUES, जिगर, त्वचा, और हड्डी।
    3. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, TDT लेबलिंग मिश्रण करने के लिए DNase (किट में लेबल "nuclease") जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, किट निर्देशों के अनुसार, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए nuclease बफर में DNase के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण खंड पूर्व इलाज करते हैं। पार संदूषण को रोकने के लिए दूर अन्य प्रयोगात्मक वर्गों से DNase समाधान और DNase इलाज वर्गों रखें।
    4. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, लेबलिंग मिश्रण से TDT एंजाइम न आना।
    5. एक प्रयोगशाला के रूप में संभव स्लाइड से ज्यादा के रूप में TDT लेबलिंग बफर दूर करने के लिए पोंछे का उपयोग करें। स्लाइड (अनुभाग प्रति 50 μl) पर पिपेट TDT लेबलिंग मिश्रण, parafilm का एक नया आयत के साथ कवर, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्रता चैम्बर में सेते हैं।
    6. 1x रोक बफर बनाने के लिए किट निर्देशों का पालन करें। स्लाइड से TDT लेबलिंग मिश्रण को दूर करने के पोंछ एक प्रयोगशाला का प्रयोग करें, और ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए 200-300 μl रोक बफर जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए नमी कक्ष में सेते हैं। अल ternatively, एक coplin जार में बंद बफर में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
    7. पीबीएस में स्लाइड 2 एक्स 2 मिनट धो लें। एक प्रयोगशाला के रूप में संभव स्लाइड से ज्यादा के रूप में पीबीएस दूर करने के लिए पोंछे का उपयोग करें।
  5. फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    1. डीएनए को तोड़ता में dNTPs लेबल करने के लिए fluorescein लेबलिंग समाधान तैयार करने के लिए किट निर्देशों का पालन करें। स्लाइड (अनुभाग प्रति 50 μl) पर पिपेट समाधान, parafilm का एक नया आयत के साथ कवर, और 20 मिनट के लिए नमी कक्ष में सेते हैं।
    2. एक coplin जार में पीबीएस में 2 मिनट के लिए धो स्लाइड। एक प्रयोगशाला स्लाइड से जितना संभव हो उतना पीबीएस दूर करने के लिए पोंछे का उपयोग करें।
    3. स्लाइड पर एक माइक्रोग्राम प्रति / पीबीएस में मिलीलीटर और पिपेट को Hoechst 33,258 परमाणु दाग ​​पतला (100-200 μl अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है)। 5 मिनट के लिए नमी कक्ष में सेते हैं।
    4. पीबीएस में 5 मिनट के लिए 3x धो लें।
    5. Antifade प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया के साथ coverslip और नेल पॉलिश के साथ किनारों को सील।
jove_title "> 5। डिजिटल छवि अधिग्रहण

  1. DAPI, FITC, और टेक्सास लाल फिल्टर (या समतुल्य) के साथ एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों मोल। लेबलिंग सफल रहा था और नाभिक (बरकरार या खंडित) लेबल रहे थे कि सत्यापित करने के लिए एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (20x या 40x) का प्रयोग करें। एक 10x उद्देश्य TUNEL के पॉजिटिव puncta के quantitation के लिए पर्याप्त है।
  2. एक छवि में संयुक्त तीन अलग झूठे रंग चैनल के रूप में Hoechst धुंधला, TUNEL के धुंधला हो जाना, और autofluorescent संकेत की छवियों को ले लीजिए। TUNEL के फ्लोरोफोरे लेबल और लाल फिल्टर में, छवि autofluorescent संकेत, हरे रंग की है, तो विपरीत शिकंजा।
    1. बाद में thresholding और quantitation के लिए स्लाइड्स के बीच बराबर सभी इमेजिंग सेटिंग्स रखें। प्रत्येक फिल्टर, पूर्व निर्धारित और रिकार्ड जोखिम बार, लाभ, और binning के लिए (कोई binning सबसे अच्छा है); स्वत: जोखिम या लाभ सेटिंग्स का उपयोग नहीं करते।
    2. सबसे अच्छा इरादे की सीमा पर कब्जा करेगा कि जोखिम और लाभ सेटिंग्स को खोजने के लिए परीक्षण और त्रुटि का प्रयोग करेंसभी दाग ​​स्लाइड भर sities। अधिग्रहीत छवियों में कोई संतृप्त पिक्सल इस वसीयत पूर्वाग्रह quantitation के रूप में कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  3. ब्याज की पूरी पेशी समूह की छवियों को ले लो। यह एक साथ "सिले" होने के लिए एकाधिक छवियों आवश्यकता हो सकती है।

6. छवि विश्लेषण

  1. TUNEL के धुंधला की डिजिटल छवियों का विश्लेषण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण कार्यक्रमों का उपयोग करें। वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण यहाँ दिखाया गया है। वैकल्पिक रूप से, एनआईएच से मुक्त सॉफ्टवेयर ImageJ TUNEL के धुंधला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ TUNEL के दाग अनुभाग के निकट एक खंड दाग और एक पारंपरिक brightfield खुर्दबीन के साथ एक पूर्ण खंड डिजिटल छवि ले। मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए शारीरिक संरचनाओं का पता लगाने के लिए एक शरीर रचना विज्ञान एटलस 5,18,19 के साथ संयोजन में इस एच एंड ई छवि का उपयोग करें।
  3. TUNEL के चैनल के साथ बंद, मैन्युअल रूप से उपयोग करते हुए, मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए क्षेत्र की रूपरेखा का पता लगानेहेक्स्ट और मार्गदर्शन के लिए autofluorescence चैनल। एक मुखौटा में पता लगाया क्षेत्र में कनवर्ट (चयनित पिक्सेल का एक सेट का विश्लेषण किया जा करने के लिए निर्देशांक)।
  4. TUNEL के चैनल पर बारी। छवि विश्लेषण कार्यक्रम में समारोह thresholding तीव्रता का प्रयोग, सभी autofluorescence संकेत बाहर करने के लिए कम सीमा निर्धारित किया है।
  5. अध्ययन सेट में सभी छवियों के लिए एक ही दहलीज सेटिंग्स लागू करें। मास्क में thresholded चयन कन्वर्ट।
  6. प्रत्येक छवि के लिए, मांसपेशियों क्षेत्र मुखौटा और TUNEL के मुखौटा गठबंधन। नए संयोजन मुखौटा केवल पता लगाया पेशी क्षेत्र के भीतर TUNEL के संकेत का प्रतिनिधित्व करेंगे।
  7. वस्तुओं की संख्या का निर्धारण और पता लगाया पेशी क्षेत्र के भीतर TUNEL के संकेत के क्षेत्र आपत्ति करने संयोजन मुखौटा पर नकाब quantitation के प्रदर्शन करना। ImageJ में कण विश्लेषक समारोह का उपयोग कर इस प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

सफल धुंधला के साथ, TUNEL के पॉजिटिव संकेत तीव्रता थ्रेसहोल्ड निर्धारित करके autofluorescence से अलग करने के लिए काफी उज्ज्वल होना चाहिए। कम बढ़ाई TUNEL के पॉजिटिव वस्तुओं कंकाल की मांसपेशी (चित्रा 1 ए) के रूप में उज्ज्वल अनियमित टुकड़े दिखाई दे सकते हैं। शामिल कोशिका मृत्यु प्रकार apoptosis के (चित्रा 1 बी) हालांकि, अगर उच्च बढ़ाई, क्लासिक apoptotic आकृति विज्ञान के साथ कुछ TUNEL के पॉजिटिव वस्तुओं, मनाया जाना चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण (DNase जोड़ा) खंड (चित्रा 1C) में सभी ऊतकों भर में समान रूप से वितरित प्रचुर मात्रा में TUNEL के पॉजिटिव संकेत, प्रदर्शन करना चाहिए। नकारात्मक नियंत्रण (प्रतिक्रिया से छोड़े गए TDT एंजाइम) कम तीव्रता पृष्ठभूमि और autofluorescent संकेत केवल (चित्रा -1) उपज चाहिए। इस ऊतक सामान्य apoptosis के (चित्रा 1 ए) के एक उच्च दर है के रूप में त्वचा, पूरे पैर वर्गों में एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है।

लाल रक्तकोशिकाओं, अस्थि, और endothelial कोशिकाओं महत्वपूर्ण autofluorescent संकेत (चित्रा 2) के योगदान कर सकते हैं। ऐसा लगता है कि autofluorescence सुनिश्चित करने के लिए कोई फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ एक अलग चैनल में प्रत्येक अनुभाग सकारात्मक TUNEL के संकेत के लिए गलत नहीं है छवि को सलाह दी जाती है। यह छवि तीव्रता थ्रेसहोल्ड (2A चित्रा, मध्य पंक्ति) की स्थापना द्वारा अलग किया जा सकता है, ताकि यह सच है TUNEL के पॉजिटिव संकेत, autofluorescence बहुत अधिक से अधिक तीव्रता होनी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, autofluorescent चैनल डिजिटल TUNEL के पॉजिटिव संकेत (2A चित्रा, नीचे पंक्ति) उपज के लिए TUNEL के चैनल से घटाया जा सकता है।

यहाँ वर्णित TUNEL के लेबलिंग विधि SMA के 10 में से एक माउस मॉडल में कंकाल की मांसपेशी कोशिका मृत्यु यों के लिए इस्तेमाल किया गया है। TUNEL के लेबलिंग littermate नियंत्रण (चित्रा 3) के साथ तुलना में, 5 दिन पुराने एसएमए चूहों से पैर की मांसपेशियों में apoptotic प्रोफाइल की संख्या में वृद्धि को दर्शाता है। apoptosis में वृद्धि हुई हैविधि द्वारा मात्रात्मक एकाधिक मांसपेशी समूहों (3B चित्रा) में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों का संकेत है, ऊपर वर्णित है।

चित्रा 1
चित्रा 1: माउस hindlimb मांसपेशियों के प्रतिनिधि TUNEL के लेबलिंग। (ए) tibialis पूर्वकाल मांसपेशी, टिबिया, और त्वचा दिखा माउस hindlimb की अनुप्रस्थ अनुभाग TUNEL के लेबल। प्रादेशिक सेना - tibialis पूर्वकाल, FDL - flexor digitorum longus, EDL - प्रसारिणी digitorum longus। ग्रीन - TUNEL के, नीले - नाभिक, लाल - autofluorescent संकेत। बिंदीदार लाइनों quantitation के लिए पेशी क्षेत्रों चित्रित करना। Hindlimb मांसपेशियों सटे त्वचा TUNEL के लेबलिंग के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (बी) के प्रतिनिधि उच्च बढ़ाई छवियों भ्रूण में TUNEL के पॉजिटिव संरचनाओं (हरा) की पहचान apoptotic नाभिक के रूप में दिन में 13 माउस कंकाल की मांसपेशी। Fayzullina और मार्टिन 2014 में 10 से संशोधित स्केल बार = 10 माइक्रोन। ए और बी। माउस hindlimb (सी) अनुप्रस्थ अनुभाग एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए DNase उपचार के बाद TUNEL के लेबल। अधिकांश नाभिक उज्ज्वल TUNEL के लेबलिंग है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (डी) सी में दिखाया गया के रूप में ही माउस hindlimb की अनुप्रस्थ खंड (सी में अनुभाग के लिए अर्द्ध आसन्न) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए छोड़े गए TDT एंजाइम के साथ TUNEL के लेबल। कोई उज्ज्वल TUNEL के पॉजिटिव संकेत नहीं है; लाल चैनल में संकेत के साथ colocalization द्वारा पता लगाया के रूप में ही हरी झंडी autofluorescence है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: ऊतक autofluorescence माना जाता है और TUNEL के लेबलिंग का विश्लेषण करते समय quantitation से बाहर रखा जाना चाहिए। TUNEL के लेबलिंग और Autofluorescence साथ (ए) माउस hindlimb अनुप्रस्थ अनुभाग: autofluorescence (लाल) चैनल के साथ मूल छवि (शीर्ष पंक्ति), समायोजित थ्रेसहोल्ड के साथ एक ही छवि (मध्य पंक्ति), और एक ही छवि (नीचे पंक्ति) घटाया। थ्रेशोल्डिंग सबसे लाल रक्त कोशिका और endothelial सेल autofluorescence नहीं बल्कि धुंधला विरूपण साक्ष्य (Arrowhead, मध्य पंक्ति) समाप्त। चैनल घटाव भी धुंधला विरूपण साक्ष्य (Arrowhead, नीचे पंक्ति) समाप्त। ग्रीन - TUNEL के, लाल - autofluorescence, नीला - नाभिक। स्केल बार = 100 माइक्रोन। ग्रे आयत बी में बढ़ाया क्षेत्र रूपरेखा बनाती है। (बी) लाल autofluorescence पैनल के उच्च बढ़ाई छवि एक में। लाल रक्त कोशिकाओं और कुछ endothelial कोशिकाओं (तीर), और एक Tissदोनों लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति फिल्टर में UE धुंधला विरूपण साक्ष्य (नोक) autofluoresce। स्केल बार = 50 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3: TUNEL के लेबलिंग नवजात SMA के चूहों के कंकाल की मांसपेशी में कोशिका मृत्यु से पता चलता है प्रसवोत्तर दिन 5 पर SMA के चूहों से लोअर hindlimb मांसपेशियों TUNEL के विधि द्वारा लेबल थे (ए) TUNEL के लेबलिंग SMA के माउस में कई मांसपेशियों समूहों में कई apoptotic प्रोफाइल को दर्शाता है।। littermate नियंत्रण (बाएं) के साथ तुलना में पेशी (दाएं)। ग्रीन - TUNEL के, नीले - हेक्स्ट (नाभिक), लाल - autofluorescence। बिंदीदार लाइनों मात्रा निर्धारित पेशी क्षेत्रों चित्रित करना। प्रादेशिक सेना - tibialis पूर्वकाल, FDL - आकुंचिका खुदाईitorum longus, EDL - प्रसारिणी digitorum longus। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। (बी) TUNEL के लेबलिंग मांसपेशी की कुल पिक्सेल क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत TUNEL के संकेत की कुल पिक्सेल क्षेत्र के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था। 5 चूहों - इसका मतलब ± मानक त्रुटियों 4 दिखाया, एन = रहे हैं। प्रत्येक पेशी समूह (एक पूंछ टी परीक्षण) के लिए SMA और नियंत्रण के बीच सांख्यिकीय महत्व: * पी ​​<0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001। यह आंकड़ा Fayzullina और मार्टिन 2014 में 10 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक विधि का पता लगाने और मात्रात्मक वर्णन किया गया है माउस कंकाल की मांसपेशी में डीएनए की क्षति जुड़े apoptosis के विश्लेषण करने के लिए। प्रक्रिया ऊतक कटाई, TUNEL के धुंधला, डिजिटल छवि अधिग्रहण, और छवि विश्लेषण भी शामिल है। आम ऊतकीय आपूर्ति और उपकरणों की जरूरत है, और एक विशेष वाणिज्यिक TUNEL के किट के लिए आवश्यक है। जरूरी बड़ा उपकरण आइटम एक cryostat, डिजिटल छवि क्षमता के साथ epifluorescent खुर्दबीन, और छवि विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर प्रणाली रहे हैं।

प्रयोगकर्ता के संभावित नुकसान के बारे में पता होना चाहिए। ऊतक autofluorescence प्रतिदीप्ति इमेजिंग में एक प्रमुख चिंता का विषय है। Unperfused पशुओं में, लाल रक्त कोशिकाओं शेष काफी उच्च autofluorescent संकेत योगदान देगा। Endothelial कोशिकाओं भी काफी autofluorescent जा सकता है। इसलिए, यह है कि autofluorescence पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है TUNEL के पॉजिटिव संकेत के लिए गलत नहीं है। यह आकलन आसानी से नहीं फ्लोरिडा के साथ एक चैनल में एक छवि लेने के द्वारा पूरा किया हैuorophore, TUNEL के पॉजिटिव चैनल से तुलना और संभव घटाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इस तरह, प्रतिदीप्ति आधारित TUNEL के विधि पृष्ठभूमि धुंधला के लिए एक आंतरिक नियंत्रण की पेशकश नहीं है कि वर्णमिति brightfield माइक्रोस्कोपी तरीकों से बेहतर है।

ऊतक निर्धारण TUNEL के लेबलिंग की सफलता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा। यह paraformaldehyde में निर्धारण के समय को कम करने के लिए 24 घंटे से अधिक नहीं होना सबसे अच्छा है। भ्रूण और नवजात ऊतक 24 घंटा की तुलना में काफी कम निर्धारण बार की आवश्यकता होगी।

TUNEL के लेबलिंग सफल होता है जब संकेत है कि आसानी से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग तीव्रता दहलीज gating के द्वारा अलग किया जा सकता है, ताकि TUNEL के पॉजिटिव संकेत, पृष्ठभूमि autofluorescence की तुलना में काफी अधिक होना चाहिए। साइट्रेट बफर 27,35 में हीटिंग के मानक प्रोटोकॉल का उपयोग प्रतिजन पुनर्प्राप्ति थोड़ा हीटिंग समय एक न्यूनतम (5 मिनट) के लिए रखा जाता है तो कम TUNEL के संकेत सुधार है, लेकिन इस pretreatment के दस सकता हैहीटिंग (95 डिग्री सेल्सियस पर जैसे 20 मिनट) लंबी अवधि के लिए बढ़ाया है अगर डी एस TUNEL के संकेत को कम करने के लिए। प्रतिजन पुनर्प्राप्ति वृद्धि हुई TUNEL के संकेत से संकेत करने वाली शोर अनुपात में किसी भी लाभ नकारना सकता है, इस प्रकार पृष्ठभूमि autofluorescence और झूठी सकारात्मक वृद्धि, और होगा।

TUNEL के संकेत माप quantitated कुल पेशी क्षेत्र के लिए या quantitated क्षेत्र के प्रति नाभिक की संख्या के लिए या तो सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। TUNEL के apoptotic नाभिक के उपाय, क्योंकि आदर्श सामान्यीकरण कुल नाभिक होगा। हालांकि, यहां तक ​​अपेक्षाकृत पतली (10 माइक्रोन) मांसपेशी वर्गों में, myofibers और नाभिक तो कई हैं और यह स्वचालित रूप thresholding और कण जुदाई एल्गोरिदम द्वारा हेक्स्ट से सना हुआ नाभिक गिनती करने के लिए असंभव है कि, इतनी बारीकी से पैक किया। मैनुअल गिनती भी बहुत श्रम प्रधान और गलत है। संभव वैकल्पिक कुल पेशी क्षेत्र को सामान्य करने के लिए है।

उचित ऊतक प्रसंस्करण के साथ इस्तेमाल किया TUNEL के परख,तकनीक और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, ऊतकों में डीएनए की क्षति और कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मात्रात्मक विधि है। यह प्रभावित प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, और चिकित्सीय उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, एक रोग तंत्र के रूप में apoptosis पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रक्रिया एसएमए, ए एल एस, पेशी dystrophy, विष प्रेरित मायोपथी सहित कंकाल की मांसपेशी की बीमारी और चोट के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मूल्य का हो, और शरीर विज्ञान का प्रयोग करेंगे।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

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Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

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