Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выявление и анализ повреждений ДНК в клетках мышиной скелетных мышц Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

Терминал дезоксинуклеотидтрансферазу (TdT) дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) является процесс с использованием фермента TdT приложить дУТФ к 3 'концах дважды и одноцепочечной ДНК разрушает 12,23. Метод TUNEL для обнаружения апоптоза и повреждения ДНК впервые было сообщено в течение 20 лет назад Gavrieli и др. 1,12,24. С тех пор были оценены и оптимизированы в различных тканевых препаратов 7,23,27,40. TUNEL был использован для изучения ишемии-индуцированной гибели клеток нейронов 6,14,29 и кардиомиоциты 43,44, эксайтотоксический нейронов гибель клеток 30,31, и в качестве биомаркера в лечении артрита 39. Он также используется в качестве прогностического фактора и опухолевых клеток маркера в различных человеческих раковых 2,3,15,32,37,38,42.

Существуют альтернативные методы для повреждения ДНК и обнаружения гибели клеток, но они имеют технические проблемы и подводные камни. Саузерн-блоттинг может использоваться для quantifу повреждение ДНК в целом лизатов ткани 7,9-11, но этот метод не дает разрешение сотовой уровня и трудно поддаются количественной оценке. Кометы анализ является альтернативным способом на основе клеток, что требуется извлечение сохранившиеся ядра из клеток 4,20,28,36. Хотя комет хорошо работает на культивируемых изолированных клеток, это гораздо сложнее подготовить нетронутыми ядра от скелетной мышечной ткани 8,21. Как Саузерну, комет не дает типов клеток конкретную информацию от целого мышечной ткани гомогенате. Другой альтернативой способу TUNEL является иммуногистохимии с использованием антител против одноцепочечной ДНК 25,33,41 или против белков, участвующих в ответ повреждение ДНК и гибели клеток путей (например, р53, H2AX и каспазы) 13,17,22,40. Такие методы на основе антител требует тщательного характеристику антител и отличную специфичность антител с получением высокого отношения сигнал-фон. Даже тогда, когда спецификациисуществуют БР антитела, они могут потребовать денатурации белка-мишени в соответствии с процедурами поисковых антиген 34,35. Когда мы будем обсуждать здесь, антиген поиска в результатах мышечной ткани неприемлемо высокой флуоресценции. В отличие от альтернативных методов, TUNEL достигает обнаружение повреждений ДНК с высоким отношением сигнал и низким уровнем фона, отличную специфичность, которые могут быть проверены с помощью простых положительных и отрицательных контролей, хорошее проникновения в ткани, которые не требуют извлечения антигена, а разрешение сотовой уровня. Кроме того, метод TUNEL занимает около 4 часов, чтобы закончить, в то время как альтернативные методы, как правило, требуют ночные инкубации.

Мы изучаем скелетных смерть мышечных клеток в мышиной модели спинальной мышечной атрофии (SMA) 10, которая была сгенерирована Се-Li и его коллеги 16. Для количественной оценки апоптоза клетки в мышцы, мы разработали способ получения тканей, окрашивания и количественного который работает энергично через другой ШкелеTal группы мышц в различных развития временных точках мышей. Мы используем имеющийся в продаже TUNEL-маркировки комплект и коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Мы также успешно использовали анализ TUNEL в комбинации с иммунофлуоресцентного окрашивания в спинном мозге 10.

Методы, описанные здесь, являются полезными для исследователей, которые хотят, чтобы оценить тканей патологии, механизмы заболевания, механизмы старения и развития (пре- и послеродовой) гибель клеток в скелетных мышцах. Методика TUNEL особенно полезно для исследований повреждений ДНК и ремонт и клеточной смерти в модельных системах, где только часть клеток зависит и клеточная разрешения уровня необходимо.

Это видео описывает вскрытие, обработки тканей, секционирование и флуоресценции основе TUNEL маркировки мыши скелетных мышц. Он также описывает способ полуавтоматического TUNEL сигнала количественного определения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения 26. Протокол (MO13M391) был одобрен Комитетом Университета Джонса Хопкинса уходу и использованию животных мимо.

1. новорожденных мыши Жертва, рассечение, и фиксация

  1. Пожертвуйте новорожденных мыши, CO 2 ингаляции.
  2. Сразу отрезать выше колена задней конечности. Примерно до послеродового день 7, кости ног не достаточно мягким, чтобы прорваться через большие лабораторных ножницами или острым лезвием и впоследствии раздел на криостата.
  3. Поместите задних конечностей в 10 мл ледяной 4% параформальдегидом в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в 15 мл пробирку.
  4. Погружение зафиксировать задних конечностей в параформальдегида течение 4-24 ч при 4 ° С. Эмбриональной ткани требуется только несколько часовс фиксации.
    1. Во избежание фиксации больше, чем 24 ч, так как это может снизить эффективность анализа TUNEL.
  5. Cryoprotect задних конечностей, погружая его в растворе сахарозы.
    1. Изменение параформальдегида до 10% сахарозы в PBS в той же трубе 15 мл, инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
    2. Изменение до 30% сахарозы в PBS, инкубируют в течение ночи при 4 ° С или до задней конечности опускается на дно пробирки. Ткань может быть оставлен в 30% сахарозы в течение более длительного периода, при условии, что сахароза была стерильно фильтруют.

2. Ткань вложения

  1. Заполните меченого вложения плесени на полпути с вложение среды.
  2. Поместите задних конечностей в верхней части вложения среды, с вырезом части как можно ближе к одной из стенок формы. Отметить ориентацию задней конечности на наружной стороне формы.
    1. Вставить несколько задних конечностей и сократить в том же блоке. Тем не менее, важно, чтобы убедиться, что все хинdlimbs в блоке ориентированы параллельно друг другу, чтобы получить секции в соответствие уровни вдоль оси конечности.
  3. Обложка задних конечностей с вложение среды. Если задние конечности перейти при заливке среду, переориентировать их с тупыми наконечниками пинцета или зубочисткой.
  4. Разрешить вложение среды, чтобы проникнуть в ткань при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
  5. Место формы непосредственно на сухом льду или в изопентан на сухом льду, чтобы заморозить вложение среды. Удостоверьтесь, чтобы держать уровень прессформ во все времена и во избежание смещение встроенного ткани.
  6. Держите замороженные формы при температуре -80 ° С до готовности, чтобы вырезать, в течение нескольких месяцев.

3. Cryosectioning Embedded Конечности

  1. Установка криостата температуры в камере до -20 ° С, температура объекта до -18 ° С; регулировать температуру объекта вниз по мере необходимости.
  2. Уравновешивают тканей блок внутри криостата камеры, по крайней мере, 30 мин. Правильный блок температуратературы имеет решающее значение для качества разделе.
  3. Сокращение поперечные срезы с толщиной 10 мкм или менее. Более толстые участки не будут полностью проникает TUNEL реагентов. Используйте стабилизатор пластины, ножи и угол лезвия (как правило, 5 °) рекомендуется для криостата.
  4. Соберите разделы на gelatin- или vectabond покрытием стеклах при комнатной температуре. Поместите сразу в слайд-поле на сухом льду. Сохраните упаковку слайд в отдельном контейнере с сухим льдом расположенной вблизи криостата на расстоянии вытянутой руки.
    1. Сокращение поперечной серийных срезов через длинной оси конечности, пропуская 100-200 мкм. Соберите по крайней мере 3 соседних участков на каждого последовательного уровне.

4. TUNEL пробы на задних конечностях частей с помощью коммерчески доступного набора (все шаги при комнатной температуре, если не указано иное)

  1. Оттепель слайды с разделами до комнатной температуры и сухой на ночь или на выходные.
  2. Увлажняет разделы от immersinг слайды в PBS в течение 2 × 10 мин в банке Коплин. Высушите лаборатории протрите, удаляя как можно больше жидкости вокруг секции, как это возможно.
  3. Проницаемыми разделы
    1. Используйте или не-протеолитическую, сапонин основе коммерческого реагента или 0,5% Tween20 и 0,05% Triton X100 в PBS.
    2. Поместите слайд в камере влажности. Простой камера влажности является пустой пипетки коробка с плотной крышкой, с достаточным количеством воды, добавляют, чтобы покрыть дно коробки.
    3. Внесите достаточно реагент на слайд, чтобы покрыть часть (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Не пипетки непосредственно на участке, а повторное возбуждение может вызвать раздел для того чтобы поднять слайд.
    4. Использование тупыми наконечниками пинцета, поместите небольшой прямоугольник парафильмом на верхней части раздела разложить падение реагента и полностью покрывают раздел. Если пузырьки образуются под парафином, осторожно поднимите его, сухой, и повторно.
    5. Выдержите слайды с permeabiliзации реагента в течение 1 ч в закрытой камере влажности. Если части начинают отрываться от ползуна, время пермеабилизации может быть уменьшено до 30 мин.
    6. Вымойте слайды в PBS в Коплин банку 2 х 5 мин. Парафильмом прямоугольники должны плавать на поверхности и может снять и выбросить.
    7. Использование лаборатории салфеткой, сушить как можно больше жидкости вокруг участков, как это возможно.
  4. ТДТ-опосредованной ДНК-брейк маркировка
    1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x TdT маркировки буфер, пипетки достаточно буфер маркировки на слайд, чтобы покрыть срезы ткани (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Кроме того, погрузите слайд в TdT маркировки буфера в Коплин банку.
    2. Следуйте инструкциям по установке, чтобы TdT маркировки смеси. Комплект включает в себя кобальт, магний и катионов марганца; катионом марганца хорошо работает на разнообразных тканей, в том числе скелетных мышц, нервных TISS системыЕЭС, печени, кожи и костного.
    3. Для положительного контроля, добавить ДНКазы (обозначенный "нуклеазы" в наборе) в смеси маркировки TdT. Альтернативно, предварительно обработать положительный секцию управления с ДНКазы в нуклеазы буфера в течение 1 ч при 37 ° С, в соответствии с инструкциями набора. Держите решение ДНКазы и ДНКазы лечение разделы вдали от других опытных участков, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    4. Для отрицательного контроля, опустить TdT фермент от маркировки смеси.
    5. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше TdT маркировки буфер из слайда, как это возможно. Пипетка TdT маркировки смесь на слайде (50 мкл) в разделе, крышка с новой прямоугольника парафином и инкубируют в камере влажности при 37 ° С в течение 1 часа.
    6. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x буфер остановки. Использование лаборатории протереть, чтобы удалить TdT маркировки смесь из ползуна, и добавить 200-300 мкл буфера остановки, чтобы покрыть срезы ткани, и инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Аль ternatively, погрузите слайд в стоп-буфера в банке Коплин.
    7. Вымойте слайд 2 х 2 мин в PBS. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS с горкой, как это возможно.
  5. Флуоресцентных меток
    1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы подготовить флуоресцеина решение маркировки на этикетке дНТФ в разрывов ДНК. Внесите раствора на слайде (50 мкл в разделе), накрыть новый прямоугольник парафильма, и инкубировать в камере влажности в течение 20 мин.
    2. Вымойте слайд в течение 2 мин в PBS в банке Коплин. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS как можно дальше от слайда.
    3. Развести Hoechst 33258 ядерных пятно на 1 мкг / мл в PBS и пипеткой на предметное стекло (100-200 мкл достаточно, чтобы покрыть раздел). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин.
    4. Промыть 3 раза в течение 5 мин в PBS.
    5. Покровное с antifade флуоресценции монтажных СМИ и печать края с лаком для ногтей.
jove_title "Приобретение Digital Image> 5.

  1. Получение изображений с помощью обычного флуоресцентного микроскопа с DAPI, FITC и Техас Red фильтров (или эквивалент). Используйте большее увеличение цели (20x или 40X), чтобы убедиться, что маркировка была успешной, и ядра (нетронутых или фрагментированные) были помечены. 10X Цель является достаточным для количественного определения TUNEL-положительных Puncta.
  2. Собирают изображения окрашивания Hoechst, окрашивание TUNEL и autofluorescent сигнала в виде трех отдельных искусственных цветовых каналов, объединенных в одно изображение. Если флуорофор этикетки TUNEL зеленый, изображение autofluorescent сигнала в красный фильтр, и наоборот.
    1. Держите все настройки визуализации эквивалентны между слайдами для последующего порога и количественного определения. Для каждого фильтра, заданных и записи времени воздействия, усиления и биннинга (без отбора по не лучше); не использовать автоматические настройки экспозиции или усиления.
    2. Используйте проб и ошибок, чтобы найти настройки экспозиции и усиления, которые лучше всего учесть весь спектр Intenстей во всех окрашенных слайдов. Убедитесь, что нет насыщенные пиксели в получаемых изображений, как это количественного воля смещения.
  3. Выполняйте съемку всей группы мышц интересов. Это может потребоваться несколько образов, которые будут "сшитые" вместе.

Анализ 6. Изображение

  1. Используйте имеющиеся в продаже программы анализа изображений для анализа цифровых изображений окрашивания TUNEL. Анализ с использованием коммерческого программного обеспечения показано здесь. Кроме того, бесплатное программное обеспечение ImageJ от НИЗ может быть использована для анализа окрашивание TUNEL.
  2. Пятно раздел прилегающей к секции TUNEL-окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) и взять полный раздел цифровое изображение с помощью обычного светлого микроскопа. Используйте этот H & E изображение в сочетании с анатомии атлас 5,18,19 проследить анатомические структуры должны быть определены количественно.
  3. С канала TUNEL выключен вручную отслеживать контур области, чтобы быть количественно, используяHoechst и автофлуоресцентной каналы для руководства. Преобразование прослеживается область в маске (множество выбранных координатах пикселей, которые будут проанализированы).
  4. Включите канал TUNEL. Использование интенсивности пороговых значений функции в программе анализа изображения, установите нижний порог, чтобы исключить все автофлуоресцентной сигнал.
  5. Примените те же настройки пороговых ко всем изображениям в наборе исследования. Преобразование порогами выбор в масках.
  6. Для каждого изображения, объедините маску мышцы области и маску TUNEL. Новая комбинация маска будет представлять сигнал TUNEL в рамках прослеживается области мышц всего.
  7. Выполните маски количественное от комбинации маску, чтобы определить количество объектов и объектов площадью сигнала TUNEL в рамках прослеживается области мышц. Выполните это, используя функцию анализатора частиц в ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С успешной окрашивания TUNEL-позитивный сигнал должен быть достаточно ярким, чтобы изолировать автофлюоресценции, установив пороги интенсивности. TUNEL-позитивные объекты на малом увеличении может отображаться в виде ярких нерегулярные фрагменты в скелетных мышцах (рис 1А). Тем не менее, при более высоком увеличении, некоторые TUNEL-положительных объекты с классической апоптоза морфологии следует соблюдать, если тип гибели клеток участвует в апоптоз (фиг.1В). Положительный контроль (ДНКазы добавляется) должны обладать обильные TUNEL-положительных сигнал, распределенный равномерно по всем тканям в разделе (рис 1в). Отрицательный контроль (TdT фермент исключены из реакции) должны дать фон низкой интенсивности и autofluorescent сигнал только (рис 1D). Кожа обеспечивает внутренний положительный контроль в целых разделов ног, как эта ткань имеет высокую скорость нормального апоптоза (рис 1А).

Красная кровьклетки, костей и эндотелиальные клетки могут способствовать значительное autofluorescent сигнал (рис 2). Желательно, чтобы изображение каждый раздел в отдельном канале, без флуоресцентных меток для обеспечения того, чтобы аутофлуоресценцию не ошибается для положительного сигнализации TUNEL. Правда TUNEL-положительных сигнал должен иметь гораздо более высокую интенсивность флуоресценции, чем, так что он может быть выделен путем установки пороговых значений интенсивности изображения (фиг.2А, среднем ряду). Кроме того, autofluorescent канал может быть цифровой вычитается из канала TUNEL, чтобы получить TUNEL-положительных сигнала (рис 2А, нижний ряд).

Способ маркировки TUNEL описано здесь был использован для количественной оценки гибели клеток скелетных мышц в мышиной модели SMA 10. TUNEL маркировки показывает увеличение количества апоптозных профилей в мышцы ног от 5-дневных мышей SMA, по сравнению с контрольной однопометница (3А). Увеличение апоптоза являетсяколичественному способом, описанным выше, указывает на статистически значимых различий в нескольких групп мышц (фиг.3В).

Рисунок 1
Рисунок 1: представитель TUNEL маркировки мыши задних конечностей мышц. () TUNEL-меченых поперечное сечение мыши задних конечностей, показывая передней большеберцовой мышцы, голени и кожи. TA - передней большеберцовой, FDL - сгибателя пальцев, EDL - разгибатель большого пальца. Зеленый - TUNEL, синий - ядра, красный - autofluorescent сигнал. Пунктирные линии разграничения мышц области для количественного определения. Кожа прилегающих задних конечностей мышцы обеспечивает внутренний положительный контроль для TUNEL маркировки. Масштаб бар = 200 мкм. (B) Представитель высоким увеличением изображения, идентифицирующие TUNEL-положительных структур (зеленый) в эмбриональных день 13 мыши скелетных мышц, как апоптоза ядер. Шкала бар = 10 мкм. А и В изменены с Файзуллина и Martin 2014 10. (C) Поперечный разрез задней конечности мыши TUNEL-меченого после обработки ДНКазой, чтобы служить в качестве положительного контроля. Большинство ядер имеют яркий TUNEL маркировки. Шкала бар = 50 мкм. (D) Поперечное сечение той же задней конечности мыши, как показано в позиции С (полу-примыкает к секции в C) TUNEL-меченный ферментом TdT опущены, чтобы служить в качестве отрицательного контроля. Там нет ярких TUNEL-позитивный сигнал; только зеленый сигнал аутофлуоресценция как обнаруживается колокализации с сигналом в красном канале. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

2 "FO: контент-ширина =" 6in "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 2: ткани аутофлуоресценция должны быть рассмотрены и исключены из количественного при анализе TUNEL маркировки. () Мышь задних конечностей поперечное сечение с TUNEL маркировки и флуоресценции: исходное изображение (верхний ряд), тот же образ с настроенным порогов (средний ряд), и то же изображение с автофлуоресцентной (красный) канала вычитается (нижний ряд). Thresholding устраняет большинство красных клеток крови и эндотелия аутофлуоресценцию клеток, но не окрашивание артефакт (стрелки, средний ряд). Вычитание канала также устраняет окрашивание артефакт (стрелки, нижний ряд). Зеленый - TUNEL, красный - аутофлуоресценция, синий - ядра. Шкала бар = 100 мкм. Серый прямоугольник очерчивает область увеличенное в B. (B) при большем увеличении изображение красного автофлуоресцентной панели в. Красные клетки крови и некоторые эндотелиальные клетки (стрелки), а также TissUE окрашивание артефакт (стрелка) autofluoresce в красных и зеленых флуоресцентных фильтров. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3: TUNEL маркировки показывает гибель клеток в скелетных мышцах новорожденных мышей SMA Нижние мышцы задних конечностей от мышей SMA в постнатальный день 5 метили с помощью метода TUNEL (А) TUNEL маркировки показывает несколько апоптоза профили в нескольких мышечных групп в SMA мыши.. мышц (справа) по сравнению с контролем однопометница (слева). Зеленый - TUNEL, синий - Hoechst (ядер), красный - аутофлуоресценция. Пунктирные линии разграничения областей мышц количественно. TA - передней большеберцовой, FDL - сгибателей копатьitorum большого пальца стопы, EDL - разгибатель большого пальца. Масштабные линейки = 200. (B) TUNEL мкм маркировки была количественно, как общей площадью пикселя сигнала TUNEL нормированной общей площади пикселя мышцы. Средства ± стандартная ошибка показано, п = 4 - 5 мышей. Статистическая значимость между SMA и контроля для каждой группы мышц (односторонний т-тест): * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001. Эта цифра была изменена с Файзуллина и Мартин 2014 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод обнаружения и количественного анализа повреждений ДНК, ассоциированных с апоптоз в клетках мышиной скелетных мышцах описано. Процедура включает в себя сбор тканей, окрашивание TUNEL, цифровой захвата изображений и анализа изображений. Общие гистологические материалы и инструменты необходимы, и специальный коммерческий набор TUNEL необходимо. Основные крупные единицы оборудования, необходимые являются криостат, эпифлуоресцентной микроскоп с возможностью цифрового изображения, и компьютерная система для анализа изображений.

Экспериментатор должен быть в курсе потенциальных опасностей. Ткань автофлуоресценции серьезной проблемой в флуоресцентной томографии. В unperfused животных, оставаясь красные кровяные клетки будут способствовать достаточно высокий сигнал autofluorescent. Эндотелиальные клетки также могут быть значительно autofluorescent. Таким образом, важно, чтобы подтвердить, что аутофлюоресценция не принимают за TUNEL-положительных сигнала. Эта оценка легко сделать, взяв изображение в канале, не Флоридаuorophore, которые будут использоваться для сравнения и возможного вычитания из TUNEL-положительных канала. Таким образом, метод TUNEL флуоресценции на основе превосходит колориметрических методов светлого микроскопии, которые не дают внутренний контроль за фоновое окрашивание.

Ткань фиксация будет иметь значительное влияние на успех TUNEL маркировки. Лучше всего, чтобы минимизировать время фиксации в параформальдегиде, не должен превышать 24 ч. Эмбриональное и новорожденных ткани потребует фиксации раз значительно меньше, чем 24 часа.

При TUNEL маркировки успешно, TUNEL-положительных сигналов должна быть значительно выше, чем фон флуоресценции, так что сигнал может быть легко выделен интенсивности порогового стробирования с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Поиск Антиген, используя стандартный протокол отопления в цитратном буфере 27,35 может немного улучшить слабый сигнал, TUNEL если время нагрева сведено к минимуму (5 мин), но это предварительная десятьDS, чтобы уменьшить сигнал TUNEL, если нагрев продолжается в течение более длительных периодов (например, 20 мин при 95 ° С). Поиск Антиген увеличится фона аутофлуоресценцию и ложных срабатываний, и, таким образом, может свести на нет любые достижения в соотношении сигнал-шум от увеличения сигнала TUNEL.

Измерения сигналов TUNEL должны быть нормализованы либо к общей площади мышечной количественно или количества ядер в области количественно. Потому что TUNEL измеряет апоптоза ядер, идеально подходит нормализация будет всего ядра. Тем не менее, даже в относительно тонких (10 мкм) секций мышцы, мышечные волокна и ядра так много и упакованы так близко, что это невозможно автоматически рассчитывать Hoechst окрашенных ядер пороговых и разделения частиц алгоритмов. Руководство подсчета также очень трудоемким и неточными. Реальной альтернативой является нормализация общей площади мышц.

TUNEL анализ, используемый с соответствующей обработки тканейметоды и положительный и отрицательный контроли, является относительно быстрым, воспроизводимым, количественный метод для обнаружения повреждения ДНК и гибель клеток в ткани. Он может быть использован, чтобы подтвердить апоптоз как патологический механизм, чтобы определить типы клеток пораженные, а также для оценки эффективности терапевтических процедур. Эта процедура будет иметь ценность для исследователей в области скелетной болезни и травмы мышц, в том числе SMA, БАС, мышечной дистрофией, токсинов миопатии и физиологии упражнений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

Физиология выпуск 94 TUNEL флуоресценция скелетных мышц повреждения ДНК анализ изображений гистология SMA двигательный нейрон болезнь
Выявление и анализ повреждений ДНК в клетках мышиной скелетных мышц<em&gt; На месте</em&gt; Использование Тюнеля метод
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter