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Biology

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211

Introduction

터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 TDT () 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL)이 dUTP를 3를 연결합니다 가열 치사 효소를 사용하는 과정은 '단일 및 이중 가닥 DNA가 12, 23 나누기 끝입니다. 세포 사멸 및 DNA 손상의 검출을위한 TUNEL 방법은 첫째 Gavrieli 등. 1,12,24 20 년 전에보고되었다. 그것은 이후 평가와 다른 조직 준비 7,23,27,40에 최적화되었습니다. TUNEL 뉴런 6,14,2943, 44 심근 허혈에 의한 세포 죽음, 흥분성 신경 세포 사멸 (30, 31)을 연구하는 데 사용하고, 관절염 치료 (39)의 바이오 마커로하고있다. 또한, 다양한 인간 암에서 2,3,15,32,37,38,42 예후 인자 및 종양 세포 마커로 사용되었다.

다른 방법은 DNA 손상 및 세포 사멸 검출을 위해 존재하지만, 그들은 기술적 인 문제와주의 사항이 있습니다. 서던 블랏 quantif하는데 사용될 수있다Y DNA 전체 조직 해물 7,9-11 손상,하지만이 방법은 세포 수준의 해상도를 제공하고 정량화하기 어려운되지 않습니다. 혜성 분석은 세포 4,20,28,36에서 보존 핵을 추출 필요로하는 다른 셀 기반 방법입니다. 혜성 분석법 격리 배양 세포에서 잘 작동하지만, 골격근 조직 8,21에서 그대로 핵을 제조하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 서던 블랏과 마찬가지로 혜성 분석은 전체의 근육 조직 파쇄 액으로부터 세포 유형 특정 정보를 제공하지 않는다. TUNEL 방법에 대한 또 다른 대안은 단일 가닥 DNA 25,33,41에 대해 또는 DNA 손상 반응과 세포 사멸 경로에 (예를 들어 p53을, H2AX, 그리고 카스파) 13,17,22,40 참여 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학이다. 이러한 항체 - 기반 방법은 높은 신호 대 백그라운드 비율을 수득 항체의 철저한 특성이 우수한 항체 특이성을 필요로한다. 경우에도 사양IFIC 항체들은 항원 검색 절차 (34, 35)을 통해 목적 단백질의 변성을 요구할 수있는. 우리가 여기에서 토론 할 때, 허용 할 수 없을 정도로 높은자가 형광의 근육 조직 결과에 항원 검색. 다른 방법과 달리, TUNEL 간단 양성 및 음성 대조군, 우수한 조직 침투 항원 검색을 필요로하지 않으며, 세포 수준의 해상도로 테스트 될 수있는 높은 신호, 낮은 백그라운드, 우수한 특이성 DNA 손상 검출을 달성한다. 다른 방법은 전형적으로 밤새 항온 처리를 요구하는 반면, 또한, TUNEL 방법은 완료하는 데 약 4 시간이 걸린다.

우리는 리튬 - Hsieh의 동료 (16)에 의해 생성 된 척수 근위축증 (SMA) (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 사멸 연구. 근육 세포 사멸을 정량화하기 위해, 우리는 다른 skele 걸쳐 견고 작동 티슈 제조, 염색 및 정량하는 방법을 개발했다마우스에서 발달 상이한 시점에서 탈 근육 그룹. 우리는 시중에서 판매하는 TUNEL 라벨링 키트 및 상용 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 척수 (10)에 면역 형광 염색법과 함께 TUNEL 분석을 사용했다.

여기에 설명 된 방법은 골격 근육에서 조직 병리, 질병의 메커니즘, 노화의 메커니즘과 발달 (사전 및 산후) 세포 사멸을 평가하려는 연구자 유용합니다. TUNEL 기술은 세포의 서브 세트 만이 영향을 세포 수준의 해상도가 필요하다 모델 시스템에서의 DNA 손상과 수리 및 세포 사멸 연구에 특히 유용하다.

이 동영상은 해부, 조직 처리, 절편, 마우스 골격 근육의 형광 기반의 TUNEL 라벨을 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량 방법을 설명한다.

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Protocol

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 절차가 건강 (26)의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 프로토콜 (MO13M391)는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 신생아 마우스 희생, 해부 및 고정

  1. CO 2 흡입 신생아 마우스를 희생.
  2. 바로 무릎 위의 사지를 잘라. 약 출생 후 7 일까지, 다리 뼈는 저온 유지 장치에 연속적으로 섹션에 큰 실험실 가위 날카로운 칼날을 극복 할만큼 부드럽고합니다.
  3. 15 ML 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS)에 차가운 얼음 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖의 뒷다리를 놓습니다.
  4. 집중은 4 ℃에서 4-24 시간 동안 파라 포름 알데히드의 사지를 고정합니다. 배아 조직은 여러 시간이 필요합니다고정의의.
    1. 이 TUNEL 분석 효율을 감소시킬 수 있으므로 24 시간보다 더 오래 고정을하지 마십시오.
  5. 자당 용액에 침지하여 뒷다리를 Cryoprotect.
    1. 같은 15 ML 튜브에 PBS의 10 % 자당에 파라 포름 알데히드를 변경, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다.
    2. PBS 30 % 수크로오스로 변경, 4 ° C에서 또는 튜브의 바닥 뒷다리 싱크까지 밤새 배양한다. 조직을 수크로오스 멸균 여과되었음을 제공, 긴 기간 동안 30 % 수크로오스에 남아있을 수있다.

2. 조직 포함]

  1. 매체를 포함와 레이블이 포함 금형 절반 방법을 채 웁니다.
  2. 몰드의 한쪽 벽에 최대한 가깝게 잘라면이 매립 매체 위에 배치 뒷다리. 금형의 외부에 뒷다리의 방향을 표시합니다.
    1. 여러 뒷다리를 포함하고 같은 블록으로 잘라. 그러나, 모든 힌을 확인하는 것이 중요하다블록 dlimbs은 사지의 축 방향과 일치하는 수준에서 섹션을 얻기 위해 서로에 대해 평행하게 배향된다.
  3. 매체를 포함와 뒷다리를 커버. 매체를 붓는 동안 뒷다리가 이동하는 경우, 무딘 팁 집게 또는 이쑤시개로 다시 방향.
  4. 적어도 15 분 동안 실온에서 조직에 침투되는 매립 매체 허용.
  5. 직접 드라이 아이스 또는 드라이 아이스에 이소 펜탄에 넣어 금형은 매체를 포함 동결. 항상 금형 수준을 유지하고 내장 조직의 이동을 방지해야합니다.
  6. 몇 달까지 들어 잘라 준비까지 -80 ℃에서 냉동 금형을 보관하십시오.

3. 냉동 절편 임베디드 사지

  1. -20 ° C로 설정 저온 유지 챔버 온도, -18 ° C에서 객체 온도; 필요에 따라 개체를 아래로 온도를 조절합니다.
  2. 적어도 30 분 동안 저온 유지 챔버 내부 조직 블록을 평형. 올바른 블록 온도erature 섹션의 품질에 대한 중요합니다.
  3. 10 ㎛ 이하의 두께로 잘라 횡단면도. 두꺼운 섹션은 완전히 TUNEL 시약에 의해 침투되지 않습니다. 안티 - 롤 플레이트, 블레이드, 블레이드 각도를 사용하여 (일반적으로 5 °)는 저온 유지하는 것이 좋습니다.
  4. 실온에서 젤라틴 또는 vectabond 코팅 된 유리 슬라이드 위에 섹션을 수집합니다. 드라이 아이스에서 슬라이드 상자에 바로 놓습니다. 팔의 손이 닿는 곳에 저온 유지 장치 부근에 드라이 아이스와 별도의 용기에 슬라이드 상자를 보관하십시오.
    1. 100 ~ 200 μm의 생략, 사지의 장축을 통해 가로 시리얼 부분을 잘라. 각 시리얼 수준에서 최소 3 인접한 섹션을 수집합니다.

상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 뒷다리 섹션 4. TUNEL 분석 (실온에서 모든 단계를 언급하지 않는)

  1. 실내 온도와 건조 야간 또는 주말 섹션이 슬라이드를 해동.
  2. immersin로 섹션을 재수코 플린 항아리에 2 × 10 분 동안 PBS에서 g 슬라이드. 실험실 건조 가능한 부분 주위에 많은 액체를 제거 닦아냅니다.
  3. Permeabilize 하시려면 섹션
    1. 비 단백질 분해, 사포닌 기반 상용 시약 0.5 % 트윈 20 0.05 % PBS에 트리톤 X100를 사용합니다.
    2. 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 충분한 물이 상자의 바닥을 추가로 포함하도록 간단한 습도 챔버는 뚜껑이 꽉 빈 피펫 팁 상자이다.
    3. 섹션을 충당하기 위해 슬라이드에 피펫 충분한 시약 (50 μl의 신생아 마우스 사지에 충분하다). 반복 교반 슬라이드를 떠 섹션의 원인이 될 수 섹션에 직접 피펫하지 마십시오.
    4. 무딘 팁 집게 사용 시약의 드롭을 확산 섹션의 상단에 파라 필름의 작은 사각형을 배치하고 완전히 섹션 커버. 모든 거품이 파라 필름에서 형성되면, 부드럽게 건조, 들어 올릴 및 다시 적용합니다.
    5. permeabili와 슬라이드를 품어덮여 습도 챔버에서 1 시간 동안 아네트 시약. 섹션 슬라이드에서 떠 시작하면, 투과성으로 시간은 30 분으로 감소 할 수있다.
    6. 코 플린 항아리 2 × 5 분에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 파라 필름 사각형 상단에 떠 있어야하고 제거 및 폐기 될 수있다.
    7. 실험실을 사용하면, 가능한 한 섹션 주위에 많은 액체를 닦아 건조.
  4. TdT에 매개 DNA 휴식 라벨링
    1. (50 μL 신생아 마우스 사지에 충분하다) 조직 부분을 충당하기 위해 슬라이드에 1 배 가열 치사 라벨 버퍼, 피펫 충분히 라벨 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 또한, 코 플린 항아리에 가열 치사 라벨 버퍼에 슬라이드를 담가.
    2. 가열 치사 라벨 믹스를 만들기 위해 키트 지침을 따르십시오. 키트는 코발트, 마그네슘, 망간 및 양이온을 포함한다; 망간 양이온은 골격 근육, 신경계, 담배 마는 포함, 다양한 조직에 잘 작동합니다UE들, 간, 피부, 뼈.
    3. 양성 대조군의 경우, 가열 치사 라벨 믹스의 DNase (키트에 표시된 "클레아 제")를 추가합니다. 대안 적으로, 키트 설명서에 따라, 37 ° C에서 1 시간 동안 클레아 버퍼와 DNase를 포지티브 제어부 미리 치료. 교차 오염을 방지하기 위해 멀리 다른 실험 섹션에서 DNase의 솔루션과 DNase를 처리 섹션을 유지합니다.
    4. 음성 대조군의 경우, 라벨 믹스에서 가열 치사 효소를 생략합니다.
    5. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 가열 치사 라벨 버퍼를 제거 와이프 ​​사용합니다. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 가열 치사 라벨 믹스, 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 1 시간 동안 37 ° C에서 습도 챔버에 품어.
    6. 1X 정지 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 슬라이드에서 가열 치사 라벨링 믹스를 닦아 제거하는 랩을 사용하여 조직 절편을 커버하도록 200-300 μL 정지 완충액을 추가 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 알 대체적으로, 코 플린 항아리에 정지 버퍼에 슬라이드를 담가.
    7. PBS에서 슬라이드 2 × 2 분을 씻으십시오. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용.
  5. 형광 라벨
    1. DNA 나누기에 dNTPs를 레이블을 형광 라벨 용액을 제조 키트 지침을 따르십시오. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 솔루션은 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 20 분 동안 습도 챔버에 품어.
    2. 코 플린 항아리에 PBS에서 2 분 동안 세척 슬라이드. 연구소는 슬라이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용.
    3. 슬라이드에 1 μg의의 /의 PBS에서 ml의 피펫에 훽스트 33258 핵 얼룩을 희석 (100 ~ 200 μl의 부분을 커버하기에 충분하다). 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다.
    4. PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오.
    5. antifade 형광 장착 미디어 커버 슬립과 매니큐어와 가장자리를 밀봉.
jove_title "> 5. 디지털 화상 취득

  1. DAPI, FITC, 텍사스 레드 필터 (또는 동급)와 기존의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 라벨이 성공과 핵 (손상 또는 조각)가 표시되었는지 확인하기 위해 높은 배율의 목표 (20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 10X 목적은 TUNEL 양성 puncta의 정량에 충분하다.
  2. 하나의 이미지로 결합 별도의 세 가지 거짓 컬러 채널로 훽스트 염색, TUNEL 염색 및 autofluorescent 신호의 이미지를 수집합니다. TUNEL의 형광 라벨과 적색 필터, 이미지 autofluorescent 신호, 녹색이면 그 반대로.
    1. 이후 임계 값 및 정량 슬라이드 사이에 해당하는 모든 이미지 설정을 유지합니다. 각 필터, 사전 설정 및 녹화 노출 시간, 게인 및 비닝 (binning)을 위해 (더 비닝 (binning)는 최고의 없음); 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오.
    2. 가장 INTEN의 범위를 캡처 노출 및 게인 설정을 찾기 위해 시행 착오를 사용하여모든 스테인드 슬라이드에 걸쳐 잇고. 획득 된 이미지에는 포화 픽셀이 의지 바이어스 정량으로,이 없는지 확인하십시오.
  3. 관심의 전체 근육 그룹의 이미지를 가져 가라. 이것은 함께 "스티치"할 여러 이미지를 필요로 할 수있다.

6. 이미지 분석

  1. TUNEL 염색의 디지털 이미지를 분석하는 상용 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 분석 여기에 표시됩니다. 대안 적으로, NIH로부터 자유 소프트웨어가 ImageJ에 TUNEL 염색을 분석하는데 사용될 수있다.
  2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 TUNEL 염색 섹션에 인접한 섹션을 얼룩과 기존의 시야 현미경으로 전체 섹션 디지털 이미지를 촬영합니다. 정량화 할 수있는 해부학 적 구조를 추적 해부학 아틀라스 5,18,19와 조합이 H & E 이미지를 사용합니다.
  3. TUNEL 채널을 끈 상태에서 수동으로 사용하여 정량 영역의 윤곽을 추적훽스트 (Hoechst)와 안내자가 형광 채널. 마스크로 추적 영역 변환 (선택한 화소의 세트를 분석 할 좌표).
  4. TUNEL 채널을 켭니다. 이미지 분석 프로그램 기능을 임계 화 강도를 사용하여, 모든 자기 형광 신호를 제외하는 임계 값을 낮게 설정한다.
  5. 연구 세트의 모든 이미지에 동일한 임계 값 설정을 적용합니다. 마스크로 역치 선택을 변환합니다.
  6. 예를 들어, 각각의 이미지가 근육 영역 마스크와 마스크 TUNEL을 결합한다. 새로운 조합 마스크는 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호를 나타냅니다.
  7. 객체의 수를 확인하고 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호의 영역을 객체로 조합 마스크에 마스크 정량을 수행합니다. ImageJ에있는 입자 분석기 기능을 사용하여이 작업을 수행합니다.

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Representative Results

성공적인 조직 화학 염색, TUNEL 양성 신호 강도 임계치를 설정하여자가 형광 물질로부터 격리 할만큼 밝은해야한다. 낮은 배율에서 TUNEL 양성 개체는 골격 근육 (그림 1A)에 밝은 불규칙한 조각을 나타날 수 있습니다. 관련된 세포 사멸 유형은 세포 사멸 (도 1b) 인 경우에는 고배율, 고전 사멸 형태 일부 TUNEL 양성 개체 관찰되어야한다. 양성 대조군 (DNase를 추가) 섹션 (그림 1C)의 모든 조직에 걸쳐 균일하게 분포 풍부한 TUNEL 양성 신호를 전시한다. 음성 대조군 (반응 생략 가열 치사 효소) 낮은 강도의 배경 및 autofluorescent 신호 만 (그림 1D)를 산출한다. 이 조직은 정상 세포 사멸 (그림 1A)의 높은 속도를 가지고 같은 피부, 다리 전체 섹션의 내부 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다.

적혈구세포, 뼈, 내피 세포는 상당한 autofluorescent 신호 (그림 2) 기여할 수있다. 그것은 그자가 형광을 보장하기 위해 더 형광 라벨에 별도의 채널의 각 섹션은 긍정적 인 TUNEL 신호로 오인하지 이미지 것이 좋습니다. 그것이 이미지 세기 임계 값 (도 2A, 중간 행)를 설정하여 단리 할 수 있도록 진정한 TUNEL 양성 신호는 자기 형광보다 훨씬 높은 강도를 가져야한다. 대안 적으로, autofluorescent 채널 디지털 TUNEL 양성 신호 (도 2A, 아랫 줄)을 수득 TUNEL 채널로부터 감산 될 수있다.

여기에 설명 TUNEL 라벨링 방법 SMA (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 죽음을 정량화하는 데 사용되어왔다. TUNEL 라벨링 한배 새끼 컨트롤 (도 3A)와 비교하여, 오래된 오일 SMA 생쥐에서 다리 근육 세포 사멸 프로파일의 증가를 나타낸다. 아폽토시스의 증가는상기 방법에 의해 정량 여러 근육 군 (도 3B)에서 통계적으로 유의 한 차이를 나타내는, 상술.

그림 1
그림 1 : 마우스 뒷다리 근육의 대표 TUNEL 라벨. (A) 전 경골근 근육, 경골, 피부를 보여주는 마우스 뒷다리의 횡단면을 TUNEL는 표지. TA - 전 경골근, FDL - 굴곡 심지 longus, EDL - 신전 심지 longus. 녹색 - TUNEL, 블루 - 핵, 빨간색 - autofluorescent 신호. 점선은 정량을위한 근육의 영역을 묘사. 뒷다리 근육에 인접한 피부 TUNEL 라벨링에 대한 내부 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다. 스케일 바 = 200 μm의. (B) 대표 고배율 이미지 배아에서 TUNEL 양성 구조 (녹색) 식별 세포 사멸 핵으로 하루 13 마우스 골격 근육. Fayzullina 마틴 2014 10에서 수정 된 스케일 바 = 10 μm의. A와 B는. 마우스 뒷다리의 (C) 가로 섹션 양성 대조군으로 제공하기 위해 DNase를 처리 후 TUNEL 표지. 대부분의 핵 밝은 TUNEL 라벨이 있습니다. 스케일 바 = 50㎛의. (D)에 도시 된 바와 같이 C와 동일한 마우스 뒷다리 횡단면 (C 섹션에 인접한 반 -) 대조군 역할을 생략 가열 치사 TUNEL 효소 - 표지. 더 밝은 TUNEL 양성 신호가 없습니다; 빨강 채널에서 신호 colocalization을 인식 한 유일한 녹색 신호는 형광도있다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 : 조직의 형광도 고려하고 TUNEL 라벨을 분석 할 때 정량 분석에서 제외해야합니다. TUNEL 라벨링 및자가 형광과 (A) 마우스 뒷다리의 횡단면 :자가 형광 (적색) 채널 원본 이미지 (맨 윗줄), 조정 된 임계 값과 동일한 이미지 (가운데 줄)과 같은 이미지는 (아랫 줄)을 차감. 임계 대부분의 적혈구 세포와 내피 세포의 형광도 있지만 염색 이슈 (화살촉, 중간 행)을 제거한다. 채널 빼기도 염색 이슈 (화살촉, 맨 아래 줄)을 제거한다. 녹색 - TUNEL, 빨간색 -자가 형광, 블루 - 핵. 스케일 바 = 100 μm의. 회색 사각형은 B에서 확대 된 영역을 묘사한다. (B) 빨간색 형광도 패널의 높은 배율 이미지에서. 적혈구 일부 내피 세포 (화살표) 및 마는모두 빨간색과 녹색 형광 필터에서 UE 염색 이슈 (화살촉) autofluoresce. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : TUNEL 라벨 신생아 SMA 마우스의 골격 근육에서 세포 사멸을 보여줍니다 출생 후 5 일에서 SMA 마우스에서 낮은 뒷다리 근육이 TUNEL 방법으로 표시 한 (A) TUNEL 라벨은 SMA 마우스의 여러 근육 그룹의 여러 세포 사멸 프로파일을 보여줍니다.. 한배 새끼 제어 (좌측)과 비교하여 근육 (오른쪽). 녹색 - TUNEL, 블루 - 훽스트 (핵), 빨간색 - 형광도. 점선은 정량 근육 영역을 묘사. TA - 전 경골근, FDL - 굴곡 발굴itorum의 longus, EDL - 신전 심지 longus. 스케일 바는 = ~ 200㎛. (B) TUNEL 라벨링 근육의 전체 화소 영역에 규격화 TUNEL 신호의 전체 화소 영역으로서 정량 하였다. 5 마우스 - 수단 ± 표준 오차는 4 표시, N =됩니다. 각 근육 그룹 (한 꼬리 t-Test)에서 SMA 및 제어 사이의 통계적 유의성 : * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. 이 그림은 Fayzullina 마틴 2014 10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

방법은 감지하고 정량적으로 설명 마우스 골격 근육에서 DNA 손상 관련 세포 사멸을 분석합니다. 절차는 조직 수확, TUNEL 염색, 디지털 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함한다. 일반적인 조직 학적 용품 및 도구가 필요하고, 특수 TUNEL 상업용 키트가 필요하다. 필요한 필수적인 큰 장비 항목은 저온 유지 장치, 디지털 영상 능력 epifluorescent 현미경 및 이미지 분석을위한 컴퓨터 시스템이다.

실험은 잠재적 인 함정을 알고 있어야합니다. 조직자가 형광은 형광 이미징의 주요 관심사입니다. unperfused 동물, 적혈구 남은 상당히 높은 autofluorescent 신호를 기여할 것이다. 내피 세포도 크게 autofluorescent 할 수있다. 따라서, 그자가 형광을 확인하는 것이 중요하다 TUNEL 양성 신호로 오인하지 않습니다. 이 평가는 쉽게 아니 FL 채널로 화상을 취함으로써 달성된다uorophore, TUNEL 양성 채널에서 비교 가능한 빼기에 사용되는. 이와 같이, 형광 기반 TUNEL 방법은 배경 염색 내부 제어를 제공하지 않는 색채 시야 현미경 법보다 우수하다.

조직의 고정은 TUNEL 라벨의 성공에 중요한 영향을 미칠 것이다. 그것은, 파라 포름 알데히드에 고정 시간을 최소화하기 위해 24 시간을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 배아 및 신생아 조직은 24 시간보다 훨씬 짧은 고정 시간을 필요로 할 것이다.

TUNEL 라벨링이 성공하면 그 신호가 용이하게 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 강도 임계 게이팅에 의해 분리 될 수 있도록, TUNEL 양성 신호는 배경 형광도보다 훨씬 더 높아야한다. 시트르산 완충액 27,35 가열의 표준 프로토콜을 사용하여 항원 검색 약간 가열 시간이 최소값 (5 분)으로 유지된다 TUNEL 저 IF 신호를 개선하지만,이 전처리 수 십가열 (95 ° C에서 예를 들면 20 분) 이상 기간을 연장하면 DS는 TUNEL 신호를 줄일 수 있습니다. 항원 회수가 증가 TUNEL 신호로부터 신호 대 잡음 비의 모든 이득을 깨뜨릴 수있다, 따라서 자기 형광 배경과 위양성을 증가 할 것이다.

TUNEL 신호 측정 정량 근육 전체 영역 또는 정량 면적당 핵의 개수 중 ​​정규화되어야한다. TUNEL은 세포 사멸 핵을 측정하기 때문에, 이상적인 정상화 전체 핵이 될 것이다. 그러나, 상대적으로 얇은 (10 μm의) 근육 섹션에서, 근섬유와 핵 너무 많다 및 자동 임계 값 및 입자 분리 알고리즘에 의해 훽스트 염색 핵을 계산 불가능하다, 너무 밀접하게 포장. 수동 계산도 매우 노동 집약적이고 부정확하다. 가능한 대안은 전체 근육 영역에 정규화한다.

적절한 조직 처리에 사용 TUNEL 분석,기술 및 양성 및 음성 대조군 조직에서 DNA 손상과 세포 사멸을 검출하기위한 비교적 빠르고, 재현 가능한 정량 방법이다. 이것은 영향을받은 세포 유형을 확인하고, 치료 학적 치료의 효능을 평가하기 위해, 병적기구로서 아폽토시스를 확인하는데 사용될 수있다. 이 절차는 SMA, ALS, 근육 영양 장애, 독소에 의한 근육 병증을 포함한 골격 근육 질환과 부상 등의 분야에서 연구에 가치가, 생리학을 행사합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

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References

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생리학 문제 94 TUNEL 형광 골격근 DNA 손상 이미지 분석 조직 학적 SMA 운동 신경 질환
마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여
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Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

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